CN105120904A - 造影剂及其制造方法和制造试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种造影剂(1)，其在具有超声波造影功能的基材(2)的表面具备至少1个分子探针(3～5)和至少1个光学探针(6)。即，通过在能够进行超声波造影的基材(2)上标记分子探针(3～5)和光学探针(6)，能够提供不仅对于超声波具有敏感性、而且对于实时性和分辨率优异的光也具有敏感性、并且为能够由血管移动到组织的尺寸的造影剂(1)。
Description
技术领域
本发明涉及造影剂及其制造方法和制造试剂盒。
背景技术
长久以来，X射线CT、MRI、超声波诊断装置等图像诊断方式在医疗现场是必须的工具。它们分别将生物体内的CT值、自旋弛豫时间、声阻抗的差异进行图像化，这些物理性质的差异专门反映生物体的结构(形状)，因此被称为“形态成像”。
与此相对，将对于即使在结构上为相同组织、但在功能上处于不同状态的部位进行图像化的技术称为“功能成像”。在该功能成像中，特别是对蛋白质等生物体构成分子的存在状态进行可视化的技术多被称为“分子成像”。分子成像可以期待应用于发生、分化等生命现象的阐明和疾病的诊断、治疗，因此是目前最受关注的研究领域之一。
在分子成像中，多使用“分子探针”，该分子探针是具有对生物体构成分子具有选择性的结构的物质，这种情况下，对分子探针附加能够利用某种物理手段进行检测的结构，使分子探针在体内的分布可视化。近年来，将这样的分子成像用于早期诊断的动向加速。
对于之前用于上述的形态成像用途的MRI、超声波诊断装置等方式，也进行了用于分子成像的研究开发。此外，由于超声波诊断装置具有：(1)实时性优异；(2)小型化因而在手术室内使用的相关限制少；(3)不仅能够诊断、而且还能够作为治疗用工具使用；等其他设备所不具备的特长，因此，作为在大型医院以外也能够使用的诊断治疗综合工具而受到期待。
以往，为了实现“疾病的早期诊断”中的分子成像，作为超声波造影剂，已知有使用了液体的微气泡前体的部位特异性(sitespecific)水包油型乳液(例如，参见专利文献1)。
该微气泡前体中，气体形成性化学物质的乳液能够在液体状态下处于稳定。并且，提出了可从血管移动到组织中的尺寸的造影剂，其为在被施加超声波能量时产生微小气泡的造影剂。
该微气泡前体是在施与至生物体时通过对纳米尺寸的液滴照射超声波而产生相变、从而生成微气泡的相变型超声波造影剂。由于具有在施加超声波能量时形成微小气泡的能力，因此，能够成为部位特异性造影剂，并且，通过进一步附加抗体、配体等与生物体构成分子选择性结合的分子探针而能够使其具有组织选择性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3016592号公报
发明内容
发明所要解决的课题
但是，专利文献1的由微气泡前体形成的超声波造影剂存在无法判断其存在于细胞内外的何处的问题。特别是存在无法判断其是否被纳入到细胞内的问题。
本发明是鉴于上述情况而进行的，其目的在于提供一种能够容易地确认到已被纳入到细胞内的造影剂及其制造方法和制造试剂盒。
解决课题的手段
为了达成上述目的，本发明提供下述手段。
本发明的一个方式提供一种造影剂，其是在具有超声波造影功能的基材的表面具备至少1个靶向用的分子探针和至少1个光学探针的造影剂。
在上述方式中，可以具备偶联用的第1分子探针、标记在第2分子探针上的光学探针、以及与疾病特异性细胞或组织结合的靶向用的第3分子探针。
另外，在上述方式中，上述第3分子探针可以由上述第1分子探针进行了标记。
另外，在上述方式中，上述第2分子探针和上述第3分子探针可以以摩尔比1:1的比例含有。
另外，在上述方式中，上述基材可以为胶囊状造影剂，该胶囊状造影剂的内部内包有具有造影功能的造影物质，且该胶囊状造影剂具有由脂质膜形成的外壳。
另外，在上述方式中，上述造影物质可以通过超声波照射而气化的不溶于水的物质。
此外，在上述方式中，上述造影物质可以为气体。
此外，本发明的另一方式提供上述造影剂的制造方法，其包含下述步骤：第1步骤，生成将上述第1分子探针标记于上述基材的表面而得到的第1溶液；第2步骤，生成将上述光学探针标记于上述第2分子探针上而得到的第2溶液；第3步骤，生成将上述第1分子探针标记于上述第3分子探针上而得到的第3溶液；第4步骤，将上述第2步骤中生成的第2溶液与上述第3步骤中生成的上述第3溶液混合，生成第4溶液；第5步骤，将上述第4步骤中生成的溶液混合到上述第1步骤中生成的第1溶液中，进行反应；以及第6步骤，对该第5步骤中生成的混合液进行离心分离。
在上述方式中，在上述第4步骤中被混合的上述第2溶液中的上述第2分子探针与上述第3溶液中的上述第3分子探针可以为摩尔比1:1的比例。
另外，在上述方式中，在上述第5步骤中，可以将上述第1步骤中生成的上述第1溶液稀释至10倍以上后进行混合。
另外，本发明的另一方式提供上述造影剂的制造试剂盒，其具备2个以上的收容部以及连接这些收容部的可开闭的流路，该2个以上的收容部将第1溶液、第2溶液和第3溶液各自分离地收容，所述第1溶液是将上述第1分子探针标记于上述基材的表面而得到的，所述第2溶液是将上述光学探针标记于上述第2分子探针上而得到的，所述第3溶液是将上述第1分子探针标记于上述第3分子探针上而得到的。
发明的效果
根据本发明，可发挥如下效果：能够容易地确认到已被纳入到细胞内。
附图说明
图1为示出本发明的第1实施方式的造影剂的示意性的分子结构图。
图2为示出图1的造影剂的制造方法的流程图。
图3示出了在培养前、撒入造影剂30分钟后图1的造影剂对CCA1高表达癌细胞的特异性结合性，(a)为共聚焦荧光显微镜图像、(b)为亮视野图像、(c)为重叠图像；还示出了使用不具有CCA1抗体的造影剂的比较例，(d)为共聚焦荧光显微镜图像、(e)为亮视野图像、(f)为重叠图像。
图4示出了在培养6小时后图1的造影剂在CCA1高表达癌细胞中的特异性细胞内纳入，(a)为共聚焦荧光显微镜图像、(b)为亮视野图像、(c)为重叠图像；还示出了使用不具有CCA1抗体的造影剂的比较例，(d)为共聚焦荧光显微镜图像、(e)为亮视野图像、(f为重叠图像。
图5为示出在培养6小时后图1的造影剂在癌细胞中的特异性细胞内纳入的流式细胞仪分析结果，(a)为CCA1高表达癌细胞的由相变纳米液滴的纳入所带来的荧光量与细胞数的关系，(b)为(a)的各情况下的平均荧光量，(c)为内包成分不同的相变纳米液滴的纳入所带来的荧光量与细胞数的关系，(d)为(c)的各情况下的平均荧光量。
图6为示出用于对施与了图1的造影剂的组织进行超声波照射和摄像的实验系统的图。
图7为示出气相化所需强度的超声波(a)照射前、(b)照射后的超声波图像的图。
图8为分别示出作为比较例的与图2的制造方法的步骤顺序不同的造影剂的(a)制造方法的流程图、(b)不进行(a)的第二阶段步骤而不具有CCA1抗体的造影剂的共聚焦显微镜分析结果、(c)纳入了也进行了第二阶段步骤、具有CCA1抗体的造影剂的情况下的共聚焦显微镜分析结果的图。
图9为分别示出在图2的流程图的第5步骤中(a)未稀释的情况下的散射、(b)20倍稀释的情况下的散射的图。
图10为示出图1的造影剂的变形例对(a)培养前、(b)培养后的癌细胞的特异性结合性的超声波图像。
图11示出了在培养3小时后图1的造影剂在HCT116细胞中的特异性细胞内纳入，(a)为共聚焦荧光显微镜图像、(b)为亮视野图像、(c)为重叠图像；还示出了使用不具有CCA1抗体的造影剂的比较例，(d)为共聚焦荧光显微镜图像、(e)为亮视野图像、(f)为重叠图像。
图12示出了在培养3小时后图1的造影剂在AGS细胞中的特异性细胞内纳入，(a)为共聚焦荧光显微镜图像、(b)为亮视野图像、(c)为重叠图像；还示出了使用不具有CCA1抗体的造影剂的比较例，(d)为共聚焦荧光显微镜图像、(e)为亮视野图像、(f)为重叠图像。
图13为示出在培养12小时后图1的造影剂在HCT116细胞和AGS细胞中的特异性细胞内纳入的流式细胞仪分析结果，(a)为示出HCT116细胞的由相变纳米液滴的纳入所带来的荧光量与细胞数的关系的图，(b)为示出(a)的各情况下的平均荧光量的图，(c)为示出AGS细胞的由相变纳米液滴的纳入所带来的荧光量与细胞数的关系的图，(d)为示出(c)的各情况下的平均荧光量的图。
图14是示意性示出本发明的一个实施方式的造影剂的制造试剂盒的图。
具体实施方式
下面，参照附图对本发明的第1实施方式的造影剂1及其制造方法进行说明。
如图1所示，本实施方式的造影剂1具备：能进行超声波造影的基材2、以及修饰在该基材2的表面的至少1个分子探针3～5和至少1个光学探针6。
基材2由在内部内包有全氟己烷、表面进行了聚乙二醇化的脂质体构成。全氟己烷为不溶于水的物质，其具有如下性质：通过以某一阈值以上的强度照射超声波而相变为气体。即，通过相变为气体，可发挥超声波造影功能。
分子探针3～5包括标记于基材2的表面的偶联用的第1分子探针3、标记于光学探针6上的第2分子探针4、以及标记第1分子探针3的靶向用的第3分子探针5。
作为第1分子探针3，例如使用生物素。
作为第2分子探针4，例如使用链亲和素。
作为第3分子探针5，例如使用CCA1抗体。
作为光学探针6，例如使用AlexaFluor(AF)647。
下面，对如此构成的本实施方式的造影剂1的制造方法进行说明。
如图2所示，本实施方式的造影剂1的制造方法包括下述步骤：第1步骤S1，将第1分子探针3标记于基材2的表面，生成第1溶液；第2步骤S2，将光学探针6标记于第2分子探针4上，生成第2溶液；第3步骤S3，将第3分子探针5标记于第1分子探针3上，生成第3溶液；第4步骤S4，将第2步骤中生成的第2溶液与第3步骤中生成的第3溶液混合，生成第4溶液；第5步骤S5，将第4步骤S4中生成的第4溶液混合到第1步骤S1中生成的第1溶液中，进行反应；以及第6步骤S6，对该第5步骤S5中生成的混合液进行离心分离。
即，在第1步骤S1中，生成第1溶液，该第1溶液包含在基材2的表面标记有生物素3的生物素化纳米液滴；在第2步骤S2中，将AF6476标记于链亲和素4上，生成第2溶液；在第3步骤S3中，将生物素3标记于CCA1抗体5上，生成包含生物素化CCA1抗体的第3溶液。
然后，在第4步骤S4中，将第2溶液(例如，0.4μM)与第3溶液(例如，0.4μM)混合，静置15分钟使其复合化，由此生成第4溶液。并且，在第5步骤S5中，将第1溶液的稀释(例如，稀释至20倍)液(例如，50μL)与第4溶液(例如，50μL)混合，例如在4℃下反应30分钟。由此，将CCA1抗体和AF6476同时修饰于造影剂的基材2的表面。
进而，在第6步骤S6中，将第5步骤S5中生成的混合液在例如3000G下进行5分钟离心分离，由此制造本实施方式的造影剂1。在本步骤中，将未修饰于造影剂1上的游离的复合物与造影剂分离并去除。
此处，重要的是：在第4步骤S4之前进行第3步骤S3；在第4步骤S4中，将第2溶液与第3溶液以摩尔比1:1进行混合；以及在第5步骤S5中，将第1溶液稀释至10倍以上后与第4溶液混合。
第2溶液的浓度例如可利用吸光测定法进行估算。另外，第3溶液的浓度例如可使用吸光测定法和考马斯亮蓝法(Bradford法)精确地测定。
下面，对如此制造的本实施方式的造影剂1的作用进行说明。
使用本实施方式的造影剂1，考察了其对在培养皿上培养的大肠癌细胞(DLD-1)的特异性结合特性。
此时，除去在第6步骤S6中离心分离出的上清，将沉淀物再悬浮于PBS(例如100μL)中，将所得到的溶液撒到细胞中，静置30分钟后利用培养液清洗表面。
关于特异性结合特性，利用共聚焦荧光显微镜和流式细胞仪进行确认。
在图3(a)、(d)、图4(a)、(d)中示出了共聚焦荧光显微镜图像，在图3(b)、(e)和图4(b)、(e)中示出了显微镜亮视野像，并在图3(c)、(f)、图4(c)、(f)中示出了它们的重叠图像。另外，在图5(a)～(d)中示出了流式细胞仪的分析结果。
图5(a)示出了(0)未处理(intact)、(1)仅相变纳米液滴(PCND)、(2)无CCA1抗体、(3)本实施方式的造影剂1的细胞内纳入所带来的荧光量与细胞数的关系，图5(b)示出了(a)的各情况下的平均荧光量。另外，图5(c)示出了使用了与(a)的内包成分的不同的相变纳米液滴的情况下的(0)未处理(intact)、(2)无CCA1抗体、(3)本实施方式的造影剂1的细胞内纳入所带来的荧光量与细胞数的关系，图5(d)示出了(c)的各情况下的平均荧光量。
根据这些图显示出，由于本实施方式的造影剂1标记有作为第3分子探针5的CCA1抗体，因而在细胞中的蓄积性高。另外，由于本实施方式的造影剂1能够以纳米尺寸制作，因而显示出若培养时间短则结合在细胞表面、若培养时间延长则造影剂进入到细胞内部的现象(内化)。其结果，随着施与到生物体后的时间的推移，能够对不同的功能进行成像。并且，该效果不依赖于内包成分。
另外，本实施方式的造影剂1在内部内包有作为不溶于水的物质的全氟己烷。该全氟己烷为通过以某一阈值以上的强度照射超声波而相变为气体的物质。此处，对于标记有抗体和色素的本实施方式的造影剂1，使用图6和图7，对为了进行作为超声波用造影剂的功能评价而测定了从液体向气体的相变所得到的结果的一例进行说明。
图6为示出用于进行超声波照射和摄像的实验系统的图。图中，符号7为水槽、符号8为聚焦超声波换能器、符号9为诊断用超声波探头、符号10为放大器、符号11为波形发生装置、符号12为超声波诊断装置。另外，符号A为试样、符号B为脱气水。以下对实验程序进行说明。
首先，在水槽7中充满37℃的脱气水B。
并且，在水槽7内设置在8％丙烯酰胺凝胶中按照全氟戊烷换算浓度为0.02mg/mL的方式含有本实施方式的造影剂的体模(试样A)，使用聚焦超声波换能器8向其照射1秒3MHz的脉冲超声波(占空比0.01、1000循环)。
超声波换能器8利用波形发生装置11和放大器10进行驱动。使用与超声波诊断装置12连接的诊断用超声波探头12，获取由超声波换能器8照射超声波中的体模A的超声波图像。
图7(a)、(b)示出了照射在超声波图像上产生亮度变化所需要的超声波强度(阈值：相当于生成诊断用的微米尺寸气泡所需要的超声波强度)以上的超声波前后的肿瘤的超声波图像(参照图7(b)中的箭头)。此时，由于诊断用的超声波以低于相变阈值的方式进行了设定，因此表示，利用诊断用的超声波得到的回声信号为来自于已经气泡化而成的气泡的散射波。
需要说明的是，在将由聚焦超声波换能器8照射超声波的条件变化为9MHz的情况下，通过对强度、循环数、照射时间进行优化，也能够得到与图7同等的结果。根据此处所示的结果，本实施方式这样的内包有伴随着从液体向气体的相变的不溶于水的物质的造影剂1的效果可通过超声波诊断像中的亮度变化来明确。
需要说明的是，利用低沸点的不溶于水的物质与高沸点的不溶于水的物质组合而成的造影剂也同样地得到了与本实施方式同样的效果。
另外还确认到，即使像这样在基材2的表面搭载有光学探针6和CCA1抗体等分子探针5，也能够进行气相化。
另外，在并非为本实施方式的制造方法的顺序的情况下、例如在设定为图8(a)所示的步骤顺序的情况下，如图8(b)、(c)所示，造影剂发生凝聚，难以产生与靶分子特异性结合的功能。在图8(a)所示的步骤顺序中，在上述的第1步骤S1和第2步骤S2之后将第1溶液与第2溶液混合，在所生成的溶液中混合含有将生物素标记于CCA1抗体上而得到的生物素化CCA1抗体的溶液。
图8(b)为将在生物素化相变纳米液滴上修饰有AF647修饰链亲和素的溶液应用于细胞的情况下的显微镜照片，图8(c)为将在(b)的溶液中修饰有生物素化CCA1抗体的溶液应用于细胞的情况下的显微镜照片。
另外，在第5步骤S5中，在将第1步骤S1中生成的第1溶液以原液的形式直接使用的情况下，如图9(a)所示，造影剂也发生凝聚，也难以产生与靶分子特异性结合的功能。
如此，根据本实施方式的造影剂1及其制造方法，具有如下优点：造影剂1之间不会发生凝聚，能够利用第3分子探针5仅与生物体(细胞)的靶分子特异性结合。另外还具有如下优点：能够利用施与到生物体后的经过时间，通过光和超声波对生物体侧的不同状态(功能)进行成像。
其结果，能够使用本实施方式的造影剂1的荧光成像，预先掌握对细胞的内化时机等本实施方式的造影剂1的细胞行为。另外，能够在实时观测荧光的同时以最佳的时间照射超声波。
即，通过在能够进行超声波造影的基材2上标记分子探针3和光学探针6，能够提供不仅对超声波具有敏感性、而且对实时性和分辨率优异的光也具有敏感性、并且为能够由血管移动到组织的尺寸的造影剂。而且，由此还具有能够进行细胞水平的“疾病的早期诊断”的优点。
另外，还能够适当地设定照射超声波进行气相化的时机。即，通过使用本实施方式的造影剂1，即使在超声波下也能够进行各种功能成像。
需要说明的是，在本实施方式中，作为造影剂1的内包物质，采用了作为通过超声波照射而气化的不溶于水的物质的全氟己烷，但也可以为其他不溶于水的物质，还可以将沸点不同的两种以上的不溶于水的物质进行组合。此外，为了能够将超声波与光以外的方式合并使用，也可以在造影剂中含有对其他方式具有敏感性的造影物质。
分子探针3～5、光学探针6也并不限于本实施方式中使用的物质。
另外，在本实施方式中，也可以使内包物质为含有全氟丁烷来代替全氟己烷的溶液，制成外皮被由聚乙二醇形成的脂质膜覆盖的纳米尺寸的气泡脂质体。
将如此构成的造影剂1注射到小鼠的尾巴中时，通过基于纳米尺寸的EPR效果和基于抗体的主动结合，如图10(a)、(b)所示，能够选择性地仅在肿瘤组织中蓄积。由此，具有即使内包物质未被气相化也能够进行超声波成像的优点。
作为造影剂1的内包物质，可以为空气、氩气、全氟丁烷、全氟丙烷等气体本身。另外，外皮也并不限于由聚乙二醇形成的脂质膜，也可以为具有其他亲水性基团的脂质等。另外，在不需要内化的信息的情况下，也可以省略光学色素标记的步骤。
另外，由于本实施方式的造影剂具有对癌细胞的组织选择性和进入到细胞内部的内化能力，因而也能够作为向任意癌细胞内输送的输送体。作为输送体的构成条件，可以制成藉由具有光学活性的偶联用分子探针与靶向用分子探针结合的基材等与本实施方式的造影剂相同的构成。
另外，在基材中可以含有能够表现出抗癌功能的所期望的物质。另外，还可以含有仅在照射治疗用超声波时开封的物质。如此构成的输送体例如可以用作诊断、治疗药。
接着，下面参照附图对本发明第2实施方式的造影剂的制造方法进行说明。
本实施方式的造影剂采用将全氟己烷与全氟戊烷这两种气体以1:1的混合比混合得到的气体作为内包物质。
表1中示出了如此构成的本实施方式的造影剂的大小与利用其他制造方法得到的造影剂的大小的比较。表1为2个实验例。
【表1】
向第1步骤中生成的第1溶液中单独添加链亲和素(SA)时，尺寸变得相当大，发生凝聚；而在利用本实施方式的制造方法制作时，能够在保持纳米尺寸的情况下对抗体进行标记。不溶于水的物质的混合比并不限定于本实施方式。可以根据要进行气相化的条件(气泡径、气相化的持续时间、频率响应性和超声波强度的阈值等)进行内包物质或其组合、比例等进行适当设计变更。
这样，利用本实施方式的制造方法制造的造影剂即使变更内包的气体，造影剂之间也不会发生凝聚，能够利用第3分子探针仅与生物体(细胞)的靶分子特异性地结合。另外，能够利用施与到生物体后的经过时间，对生物体侧的不同的状态(功能)进行成像。
此处，在不改变作为第3分子探针5的CCA1抗体的情况下，使用HCT116细胞和AGS细胞代替DLD1细胞来考察特异性结合特性。
具体而言，添加到HCT116细胞和AGS细胞的培养皿中，静置例如1小时后，利用培养基清洗表面，例如在3小时后利用共聚焦激光显微镜对特异性的细胞内纳入进行观察，并且在12小时的培养后利用PBS进行清洗，利用胰蛋白酶/EDTA将细胞从培养皿剥离，进行流式细胞仪分析。
蓄积结果示于图11(a)～(f)和图12(a)～(f)。图11(a)～(c)、图12(a)～(c)示出了在HCT116细胞中的特异性细胞内纳入，图11(d)～(f)、图12(d)～(f)示出了在AGS细胞中的特异性细胞内纳入。另外，流式细胞仪的分析结果示于图13(a)～(d)。
本实施方式的造影剂在HCT116细胞内也发生了蓄积、内部移动，在据报道CCA1的表达量少的AGS细胞中没有蓄积。
由此，本实施方式的造影剂具有能够仅与标记的抗体所对应的抗原特异性地结合、能够与其他细胞清晰地区别的优点。
另外，在本发明中，可以利用图14所示的制造试剂盒21来制造造影剂1。
该制造试剂盒21具备：无菌地收容第1～第3溶液的收容部22,23,24、以及连接这些收容部22～24的流路25,26。在各流路25,26中设置有阀27,28，可通过阀27,28的操作使流路25,26开闭。
在打开第2流路26的阀28将第2溶液与第3溶液混合而生成第4溶液后，打开第1流路25的阀27将第1溶液与第4溶液混合，并且将制造试剂盒整体置于离心分离机，由此能够无菌地制造本实施方式的造影剂1。需要说明的是，关于打开阀的顺序，也可以设置仅按照在阀28之后为阀27的顺序来打开的安全装置。
符号的说明
1造影剂
2基材
3第1分子探针
4第2分子探针
5第3分子探针
6光学探针
21制造试剂盒
22～24收容部
25,26流路
Claims (11)
1.一种造影剂，其是在具有超声波造影功能的基材的表面具有至少1个分子探针和至少1个光学探针的造影剂。
2.如权利要求1所述的造影剂，其中，所述造影剂具备第1分子探针、标记在第2分子探针上的光学探针、以及与疾病特异性细胞或组织结合的第3分子探针。
3.如权利要求2所述的造影剂，其中，所述第3分子探针由所述第1分子探针进行了标记。
4.如权利要求2或权利要求3所述的造影剂，其中，所述第2分子探针和所述第3分子探针以摩尔比1:1的比例含有。
5.如权利要求1～权利要求4的任一项所述的造影剂，其中，所述基材为胶囊状造影剂，该胶囊状造影剂的内部内包有具有造影功能的造影物质，且该胶囊状造影剂具有由脂质膜形成的外壳。
6.如权利要求5所述的造影剂，其中，所述造影物质为通过超声波照射而气化的不溶于水的物质。
7.如权利要求5所述的造影剂，其中，所述造影物质为气体。
8.权利要求2所述的造影剂的制造方法，其包括下述步骤：
第1步骤，生成将所述第1分子探针标记于所述基材的表面而得到的第1溶液；
第2步骤，生成将所述光学探针标记于所述第2分子探针上而得到的第2溶液；
第3步骤，生成将所述第1分子探针标记于所述第3分子探针上而得到的第3溶液；
第4步骤，将所述第2步骤中生成的第2溶液与所述第3步骤中生成的所述第3溶液混合，生成第4溶液；
第5步骤，将所述第4步骤中生成的第4溶液混合到所述第1步骤中生成的第1溶液中，进行反应；以及
第6步骤，对该第5步骤中生成的混合液进行离心分离。
9.如权利要求8所述的制造方法，其中，在所述第4步骤中被混合的所述第2溶液中的所述第2分子探针与所述第3溶液中的所述第3分子探针为摩尔比1:1的比例。
10.如权利要求8或权利要求9所述的制造方法，其中，在所述第5步骤中，将所述第1步骤中生成的所述第1溶液稀释至10倍以上后进行混合。
11.权利要求2所述的造影剂的制造试剂盒，其具备2个以上的收容部以及连接这些收容部的可开闭的流路，该2个以上的收容部将第1溶液、第2溶液和第3溶液各自分离地收容，所述第1溶液是将所述第1分子探针标记于所述基材的表面而得到的，所述第2溶液是将所述光学探针标记于所述第2分子探针上而得到的，所述第3溶液是将所述第1分子探针标记于所述第3分子探针上而得到的。
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