尿液中巯基类化合物检测试剂盒及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学检验领域的尿液检测试剂,具体涉及一种尿液中巯基类化合物检测试剂盒及制备方法和应用。
背景技术
在全世界危害女性健康的恶性肿瘤中,宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌的最常见的妇科恶性肿瘤之一。在一些发展中国家其发病率居首位,据国际癌症研究中心估计,每年大约有371200的宫颈癌新发病例,占所有肿瘤的9.8%,占女性新发病例的15%,其中78%的病例发生在发展中国家,发达国家仅占4.4%。我国地域广阔、人口众多,根据90年代卫生部全国肿瘤防治研究办公室组织的大规模全国人口死亡原因调查显示,每年有新发病例约10万,占世界宫颈癌新发病例总数的四分之一。经过几十年广泛开展妇科普查,宫颈癌的发病率及死亡率降低了近68%,但从全国范围来看,宫颈癌的患病率仍居妇科恶性肿瘤的第一位。
宫颈癌前病变和宫颈癌发病过程中(早中晚期)整个巯基分子将不可逆的脱落并从尿液中排出体外,而机体正常情况下并无巯基分子脱落,因此检测尿液中的巯基化合物可用于宫颈癌的筛查和辅助诊断。临床数据及多篇文献表明:尿液巯基化合物浓度显著增高常见于子宫颈组织癌变过程。
现有技术中存在利用巯基可将磷钨酸还原成钨蓝而呈蓝色的特性制备出用于提示宫颈癌病变的尿液中巯基类代谢物检测试剂盒,比如CN104181155A中就公开了一种相关试剂盒及其制备方法,但由于尿液中除了巯基类代谢物具有还原性外,尿液中的尿酸和Vc同样具有还原性,同样可以与磷钨酸反应而显色,该文献中采用对照试剂中添加汞离子排除巯基代谢物的方法,通过对照组和检测组的颜色深浅的比对来排除尿酸和Vc的干扰,虽然这种方法可以排除假阳性的问题,但是肉眼分辨深浅,很容易造成误判,特别是在巯基类代谢物含量较低时对照组和检测组的显色非常接近,分辨误差大,容易造成假阴性误判,从而大大降低了该检测试剂的准确性和精确性,限制该产品的实际应用,且尿液中含有蛋白会对试剂的准确性产生干扰
发明内容
本发明提供了一种尿液中巯基类化合物检测试剂盒及制备方法和应用,用以解决目前巯基检测试剂假阴性误判突出,检测准确性和精确度低的问题。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案是:所述尿液中巯基类化合物检测试剂盒,包括检测试剂、对照试剂和显色试剂;
其中,所述检测试剂为包含亚汞离子化合物和三氯乙酸的水溶液;
所述对照试剂为包含汞离子化合物、亚汞离子化合物和三氯乙酸的水溶液;
所述显色试剂为包含磷钨酸、硅钨酸和锂离子化合物的缓冲溶液。
其中对照试剂与检测试剂中三氯醋酸可破坏尿液中蛋白质分子的结构,使得干扰蛋白质沉淀,避免假阳性产生,在三氯醋酸和磷钨酸的分步作用下,近100%的蛋白质可以被除去,提高测定结果的准确性,试剂中亚汞离子可与尿液中的无机盐结合,防止其干扰整个反应过程,加强试剂测定的稳定性。对照试剂中汞离子可选择性与尿液中巯基代谢物反应,与检测试剂比对后排出假阳性问题。显色试剂中的硅钨酸可优先与尿液中的还原性物质如尿酸、Vc等反应,避免其与磷钨酸发生还原反应,从而有效避免了因尿酸、Vc显色干扰对照组和检测组的显色比对,导致假阴性误判。
进一步的,所述亚汞离子化合物选自硝酸亚汞或氯化亚汞,所述汞离子化合物选自硫酸汞、硝酸汞或氯化汞,所述锂离子化合物选自硫酸锂或碳酸锂。
进一步的,所述亚汞离子化合物为氯化亚汞,所述汞离子化合物为氯化汞,所述锂离子化合物为碳酸锂。
进一步的,所述检测试剂中,亚汞离子的浓度为0.001mol/L,三氯醋酸的质量浓度为10wt%;所述对照试剂中,亚汞离子的浓度为0.001mol/L,汞离子的浓度为0.04-0.045mol/L,三氯醋酸质量浓度为10wt%;所述显色试剂中,磷钨酸的浓度为36-57g/L,硅钨酸的浓度为8.5-20g/L,锂离子的浓度为1-2.7mmol/L。所述离子浓度是指以亚汞离子、汞离子或锂离子的浓度,相应亚汞离子化合物、汞离子化合物或锂离子化合物的浓度要根据上述离子浓度进行换算,比如亚汞离子的浓度为0.001mol/L,则氯化亚汞的浓度为0.001mol/L,汞离子浓度为0.04-0.045mol/L,则氯化汞的浓度为0.04-0.045mol/L,锂离子的浓度为1-2.7mmol/L,则碳酸锂的浓度为0.5-1.35mmol/L。所述汞离子的浓度如果低于0.04mol/L时,则在巯基代谢物浓度较高时,存在不能完全反应的情况,则之后还是会与磷钨酸反应显色,则会做出阴性的误判。
进一步的,所述缓冲溶液为乙酸钠/乙酸缓冲体系,pH值为4.8-5.6。在此区间磷钨酸试剂有良好的显色反应。
进一步的,所述检测试剂的量为1ml,对照试剂的量为1ml,显色试剂的量为4ml。
本发明还提供了上述尿液中巯基类化合物检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
1)检测试剂的制备:将亚汞离子化合物和三氯醋酸溶于蒸馏水中,保持无菌环境将其分装入5ml安瓿瓶并拉丝灌封;
2)对照试剂的制备:将汞离子化合物、亚汞离子化合物和三氯醋酸溶于蒸馏水中,而后在无菌环境下将其分装入5ml安瓿瓶中并拉丝灌封;
3)显色试剂制备:
a、称取磷钨酸溶于蒸馏水中,然后加入锂离子化合物;
b、称取硅钨酸溶于蒸馏水中;
c、配置乙酸钠/乙酸缓冲体系的缓冲溶液,所述缓冲溶液中乙酸钠浓度为0.2mol/L,乙酸浓度为0.3mol/L;
d、将a、b、c步骤所制备的试剂案按1:(1~1.5):(1.5~2.0)的体积比混合均匀,并分装入5ml安瓿瓶并拉丝灌封。
进一步的,所述显色试剂制备中步骤a配置的试剂中,所述磷钨酸的浓度为160g-200g/L,所述锂离子化合物的浓度为2.3-4.7mmol/L。
进一步的,所述显色试剂制备中步骤b配置的试剂中,所述硅钨酸的浓度为30g-60g/L。
本发明还提供了上述尿液中巯基类化合物检测试剂盒在宫颈癌的筛查和辅助诊断方面的应用。
本发明提供的技术方案利用巯基能将磷钨酸还原成钨蓝而呈现蓝色的特性来检测尿液中巯基,但磷钨酸能够破坏了蛋白质的结构,产生蛋白质沉淀,干扰检测结果,出现假阳性现象,在三氯醋酸和磷钨酸的分步作用下,近100%的蛋白质可以被除去,提高测定结果的准确性;;试剂中的碳酸锂或硫酸锂对磷钨酸的还原反应有很好的催化作用;对照试剂与检测试剂中的亚汞离子可先与尿液中的无机盐结合,防止其干扰整个反应过程,加强试剂测定的稳定性;对照试剂中汞离子能与尿液中巯基结合,而检测试剂中不含汞离子故尿液中若含巯基将还原磷钨酸从而使其变蓝;最为重要的是显色试剂中的硅钨酸可与尿液中的还原性物质如尿酸、Vc等优先反应,从而排除因尿酸、Vc的干扰导致的假阴性问题,与现有技术相比,本发明提供的技术方案工艺简单、稳定性高,检测结果假阳性率和假阴性率低等特点,适合用于宫颈癌的筛查和辅助诊断。
具体实施方式
本发明中所用试剂和器皿均为市购商品。
实施例1
制作1000个尿液中巯基类化合物检测试剂盒,过程如下:
一、检测试剂的制备:将氯化亚汞和三氯醋酸分别溶于蒸馏水,配置亚氯化亚汞浓度为0.001mol/L,三氯醋酸质量浓度为10wt%,保持无菌环境将其分装入5ml安瓿瓶并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量1ml,据此制备检测试剂1000支;
二、对照试剂的制备:将氯化汞、氯化亚汞和三氯醋酸溶于蒸馏水,配置氯化汞的浓度为0.04mol/L,氯化亚汞的浓度为0.001mol/L,三氯醋酸质量浓度为10wt%,在无菌环境下将其分装入5ml安瓿瓶中并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量1ml,据此制备对照试剂1000支;
三、显色试剂的制备:其中磷钨酸的浓度为38g/L,碳酸锂的浓度为1.13mmol/L,硅钨酸的浓度为11.4g/L。
a、称取适量磷钨酸充分溶于蒸馏水中,最后加入碳酸锂,其中磷钨酸浓度为160g/L,碳酸锂的浓度为350mg/L,4℃冷藏备用;
b、称取适量硅钨酸充分溶于蒸馏水中,其中硅钨酸浓度为40g/L,4℃冷藏备用;
c、缓冲溶液的制备:将0.2mol/L乙酸钠水溶液与0.3mol/L乙酸水溶液按5.9:4.1的体积比混合,pH值为4.8,置2℃—8℃冷藏保存备用;
d、将a、b、c步骤所制备的试剂按1:1.2:2.0混合,并将混合均匀的试剂分装入5ml安瓿瓶并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量为4ml,制备1000支。
四、将一、二、三制备好的安瓿瓶分别按检测试剂1支、对照试剂1支,显色试剂1支,即可制作试剂盒1000盒。
实施例2
制作1000个尿液中巯基类化合物检测试剂盒,过程如下:
一、检测试剂的制备:将氯化亚汞和三氯醋酸分别溶于蒸馏水,配置亚氯化亚汞浓度为0.001mol/L,三氯醋酸质量浓度为10wt%,保持无菌环境将其分装入5ml安瓿瓶并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量1ml,据此制备检测试剂1000支;
二、对照试剂的制备:将氯化汞、氯化亚汞溶和三氯醋酸于蒸馏水,配置氯化汞的浓度为0.045mol/L,氯化亚汞的浓度为0.001mol/L,三氯醋酸质量浓度为10wt%在无菌环境下将其分装入5ml安瓿瓶中并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量1ml,据此制备对照试剂1000支;
三、显色试剂的制备:其中磷钨酸的浓度为46.5g/L,碳酸锂的浓度为0.94mmol/L,硅钨酸的浓度为10.5g/L。
a、称取适量磷钨酸充分溶于蒸馏水中,最后加入碳酸锂,其中磷钨酸浓度为200g/L,碳酸锂的浓度为300mg/L,4℃冷藏备用;
b、称取适量硅钨酸充分溶于蒸馏水中,其中硅钨酸浓度为30g/L,4℃冷藏备用;
c、缓冲溶液的制备:将0.2mol/L乙酸钠水溶液与0.3mol/L乙酸水溶液按9.1:0.9的体积比混合,pH值为5.6,置2℃—8℃冷藏保存备用;
d、将a、b、c步骤所制备的试剂按1:1.5:1.8混合,并将混合均匀的试剂分装入5ml安瓿瓶并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量为4ml,制备1000支。
四、将一、二、三制备好的安瓿瓶分别按检测试剂1支、对照试剂1支,显色试剂1支,即可制作试剂盒1000盒。
实施例3
制作1000个尿液中巯基类化合物检测试剂盒,过程如下:
一、检测试剂的制备:将氯化亚汞和三氯醋酸分别溶于蒸馏水,配置亚氯化亚汞浓度为0.001mol/L,三氯醋酸质量浓度为10%,保持无菌环境将其分装入5ml安瓿瓶并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量1ml,据此制备检测试剂1000支;
二、对照试剂的制备:将氯化汞、氯化亚汞和三氯醋酸溶于蒸馏水,配置氯化汞的浓度为0.04mol/L,氯化亚汞的浓度为0.001mol/L,三氯醋酸质量浓度为10%,在无菌环境下将其分装入5ml安瓿瓶中并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量1ml,据此制备对照试剂1000支;
三、显色试剂的制备:其中磷钨酸的浓度为47.3g/L,碳酸锂的浓度为0.89mmol/L,硅钨酸的浓度为20.5g/L。
a、称取适量磷钨酸充分溶于蒸馏水中,最后加入碳酸锂,其中磷钨酸浓度为180g/L,碳酸锂的浓度为250mg/L,4℃冷藏备用;
b、称取适量硅钨酸充分溶于蒸馏水中,其中硅钨酸浓度为60g/L,4℃冷藏备用;
c、缓冲溶液的制备:将0.2mol/L乙酸钠水溶液与0.3mol/L乙酸水溶液按7.9:2.1的体积比混合,pH值为5.2,置2℃—8℃冷藏保存备用;
d、将a、b、c步骤所制备的试剂按1:1.3:1.5混合,并将混合均匀的试剂分装入5ml安瓿瓶并拉丝灌封,每个安瓿瓶装量为4ml,制备1000支。
四、将一、二、三制备好的安瓿瓶分别按检测试剂1支、对照试剂1支,显色试剂1支,即可制作试剂盒1000盒。
实施例4对比例
所述对比例参考CN104181155A中的实施例1制备获得对比例试剂盒。
实施例5抗干扰能力检测
实验方法:人工尿样以尿素为主要成分,含量为1.8%,DL-半胱氨酸模拟巯基代谢物。分别向对照试剂和检测试剂中滴加1ml待测样品,摇匀,静止片刻,然后在分别滴加2ml显色试剂。
实施例1的检测结果判断方法:观察对照试剂和检测试剂溶液的颜色变化,若两溶液均未变色则为阴性,若对照试剂未变色而检测试剂变色则为阳性,若对照试剂和检测试剂均变色时则为阳性。
实施例4的检测结果判断方法:若对照试剂和检测试剂颜色一致则判断阴性,若两溶液颜色不同且检测试剂颜色显示的蓝色比对照剂颜色更深则判定为阳性。
人工尿样中添加无机盐类,磺胺类药物,尿酸和/或Vc模拟各种情况,每种样本例数为20,检测结果如表1:
表1抗干扰能力检测
实施例6效果验证试验
1.试验对象
1)宫颈癌病变、宫颈癌(早、中、晚期)患者以及正常妇女共1057名,应用本试剂盒进行检测。
2.试验方法
所有试验对象均取新鲜洁净晨尿1mL加入试剂盒中的对照试剂和检测试剂中,摇匀、静置,而后在对照试剂和检测试剂中分别加入2mL显色试剂;自然光下观察并将对照试剂和检测试剂溶液的颜色进行对比。
检测结果判断方法参见实施例5。
3.实验结果:见表2和表3
表2采用实施例1试剂盒检测各组尿液结果
组别 |
患者例数 |
检测出阳性人数 |
阳性率 |
准确率 |
宫颈癌前病变组 |
231 |
190 |
82.3% |
87.3% |
早期宫颈癌组 |
240 |
178 |
74.2% |
89.4% |
中晚期宫颈癌组 |
200 |
190 |
95% |
95.2% |
正常人 |
386 |
3 |
0.8% |
100% |
表3采用实施例4试剂盒检测各组尿液结果
组别 |
患者例数 |
检测出阳性人数 |
阳性率 |
准确率 |
宫颈癌前病变组 |
231 |
100 |
43.3% |
80.4% |
早期宫颈癌组 |
240 |
165 |
68.8% |
80.4% |
中晚期宫颈癌组 |
200 |
160 |
80% |
86.4% |
正常人 |
386 |
6 |
1.6% |
92.3% |
阳性率是指全部检测结果中,出现阳性结果的百分率。
准确率是指有病人群中检测为阳性的比例。
根据以上实验结果可以表明,本发明提供的技术方案在判断检测结果时更加直观和准确,降低了假阴性假阳性情况的发生。
实施例7
为进一步验证此试剂效果,我们用实施例1所制试剂盒观察宫颈癌部分病例的动态变化,即治疗前与治疗(手术、放疗、化疗)后的检测结果,详见表4。
表4宫颈癌动态变化
组别 |
治疗前阳性数 |
治疗后阳性数 |
准确率 |
宫颈癌 |
190 |
109 |
87.9% |