CN105106194A

CN105106194A - Caesalpin E在制备治疗肾癌药物中的应用

Info

Publication number: CN105106194A
Application number: CN201510578969.1A
Authority: CN
Inventors: 周午贤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-09-13
Filing date: 2015-09-13
Publication date: 2015-12-02

Abstract

本发明公开了Caesalpin？E在制备治疗肾癌药物中的应用，属于药物领域。试验表明Caesalpin？E能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖性。Caesalpin？E可以进一步研究开发成制备治疗肾癌的药物。

Description

Caesalpin E在制备治疗肾癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物CaesalpinE的新用途，具体涉及CaesalpinE在制备治疗肾癌药物中的应用。

背景技术

GuoxuMa等人首次分离纯化出化合物CaesalpinE，并将成果发表在著名天然产物杂志JournalofNaturalProduct上(CaesalpinsA-H,BioactiveCassane-TypeDiterpenesfromtheSeedsofCaesalpiniaminax，J.Nat.Prod.，2013，76，1025-1031)。

目前尚未有该化合物关于肾癌的活性报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CaesalpinE的医药用途。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

CaesalpinE在制备治疗肾癌药物中的应用，所述CaesalpinE化学结构式如下，

进一步地，所述肾癌为人肾癌RC-2。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：CaesalpinE的分离制备及结构确证

CaesalpinE的制备方法同文献报道的制备方法(CaesalpinsA-H,BioactiveCassane-TypeDiterpenesfromtheSeedsofCaesalpiniaminax，J.Nat.Prod.，2013，76，1025-1031)。

结构确证：白色无定形粉末，HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z453.1907，结合核磁特征可得分子式为C₂₄H₃₀O₇，不饱和度为10。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，600MHz)：H-1(5.64，t，J＝1.8)，H-2(1.88，m)，H-2(2.15，m)，H-3(1.18，m)，H-3(1.93，m)，H-6(5.89，d，J＝6.0)，H-7(5.01，d，J＝6.0)，H-11(6.68，s)，H-15(6.84，d，J＝2.4)，H-16(7.68，d，J＝2.4)，H-17(2.55，s)，H-18(1.21，s)，H-19(1.22，s)，H-20(1.64，s)，1-OCOCH₃(1.84，s)，6-OCOCH₃(2.19，s)，5-OH(4.09，s)，7-OH(5.76，s)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，600Hz)：77.6(CH，1-C)，22.5(CH₂，2-C)，33.6(CH₂，3-C)，39.9(C，4-C)，79.8(C，5-C)，81.1(CH，6-C)，74.5(CH，7-C)，128.1(C，8-C)，141.1(C，9-C)，50.3(C，10-C)，104.7(CH，11-C)，156.0(C，12-C)，131.3(C，13-C)，132.4(C，14-C)，106.1(CH，15-C)，146.8(CH，16-C)，17.3(CH₃，17-C)，31.3(CH₃，18-C)，25.6(CH₃，19-C)，29.9(CH₃，20-C)，171.6(C，1-OCOCH₃)，21.5(CH₃，1-OCOCH₃)，173.3(C，6-OCOCH₃)，22.1(CH₃，6-OCOCH₃)。结构确证数据与文献报道一致，因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的CaesalpinE。

实施例2：CaesalpinE的药理作用试验

一、材料和仪器

人肾癌RC-2细胞株购于ATCC细胞库(美国)。分析纯蔗糖购于国药集团化学试剂公司。重水(D₂O)购于青岛腾龙微波科技有限公司。Tris、SDS、30％丙烯酰胺单体、Tween20购于重庆医科大学基础研究所实验室。小牛血清、RPMI-1640购于美国Gibco公司。Centriplus离心超滤管、AmiconUltra高回收率高流速切向流超滤离心管(100kD)、PVDF膜购于Millipore公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海安亭科学仪器厂。5×SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液、BeyoECL荧光检测试剂、考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250购于碧云天生物技术研究所。CaesalpinE自制，HPLC归一化纯度大于98％。鼠抗人HSP70单克隆抗体、兔抗人ICAM-1单克隆抗体、兔抗人G250多克隆抗体购于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗体武汉博士德生物有限公司。

超净工作台(苏州华新空调净化有限公司)，自动平衡离心机(上海医用分析仪器厂)，光学显微镜(NIKON，日本)，透射电子显微镜(LeicaTCS-NT，德国)，低温高速离心机(日立公司，日本)，低温超高速离心机H-80B(日立公司，日本)。垂直电泳槽、电转槽(北京六一厂，中国)。台式高速离心机、酶标仪(上海安亭科学仪器厂，中国)。96孔培养板(Corning公司，美国)。凝胶仪、PCR扩增仪(BIO-RAD，美国)。

二、试验方法

1、MTT检测CaesalpinE不同浓度48h对肾癌细胞株RC-2增殖的影响

用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液(含有0.1％青霉素、链霉素)常规培养人肾癌细胞株RC-2，根据细胞生长密度1～2天换液一次，3天传代一次。取对数期生长细胞，按照如下步骤操作：(1)接种细胞：胰酶消化对数生长期的肾癌RC-2细胞，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液1mL制成单细胞悬液，混匀后用移液管按照体积100μL/孔，即接种肾癌细胞数目5×10³个/孔，加入96孔培养板中。每组细胞设置3个复孔；(2)培养细胞：将培养板小心置入孵箱中(37℃、5％CO₂)培养3天；(3)处理细胞：分别按空白组(加5μLDMSO液)、0.25、0.5、0.75、1μmol/LCaesalpinE处理组分组后加药处理48h；(4)显色：在各个时间点，予以每孔各加入MTT溶液20μL，之后继续放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔内培养液用注射器吸去；对于当天接种的细胞而言，离心之后(1000rpm，5min)，然后将孔内培养液移除。之后把150μLDMSO加入每孔，使其充分振荡10min后，把结晶物溶解完全；(5)比色：在全自动酶标仪上检测各孔在580nm波长下的光密度值[(D580)]，按公式测定细胞活力：D(580)实验孔/D(580)对照孔×100％。

2、MTT检测0.5μMCaesalpinE不同时间对肾癌细胞株RC-2增殖的影响

接种和处理细胞及显色和比色步骤同上(1)、(2)、(4)、(5)，处理细胞：分别按空白组(加5μLDMSO液)、0.5μMCaesalpinE处理24h、48h、72h分组。

3、制备exosomes

(1)细胞分组：取6份细胞计数相近的人肾癌RC-2细胞株体外常规培养，其中三份为对照组(CE)，另外三份为实验组(CE2)，等细胞呈对数生长时，两组细胞株按照3×10⁶/100mL重新传代至新的培养瓶，严格控制每组细胞培养基的体积一致；在实验组，等细胞培养48h后加入0.5μM的CaesalpinE处理细胞48h，之后收集培养上清液各150mL；对照组不加药物，加入与实验组等量的DMSO，48h后收集培养上清液各150mL，置于-20℃冰箱保存；(2)提取exosomes：培养上清液150mL，300g低温离心(4℃)10min去除细胞；800g低温离心30min获取上清l0000g低温离心30min获取上清通过100kDMWCOCentriplus离心超滤管浓缩超滤(MWCO：分子量截留)，以1000g离心30min，得到约20mL超滤液。将超滤液分别移至2mL含30g/L的蔗糖重水垫的10mL的离心管中，100000g低温超速离心lh。收集离心管底部的缓冲垫用PBS稀释，置于100kDMWCO高回收率高流速切向流超滤离心管中1000g离心30min，得到3mLexosome。0.22μm滤膜过滤除菌，-80℃保存备用设置对照组细胞(CE1)来源的exosomes为EX1组exosomes，实验组细胞(CE2)来源的exosomes为EX2组exosomes。

4、BCA法检测exosomes蛋白含量

(1)测定方法：取96孔酶标板，按下表加入试剂并绘制标准曲线：

管号	1	2	3	4	5	6	7	8
									标准蛋白溶液(μL)	0	1	2	4	8	16	18	20

蒸馏水(μL)	20	19	18	16	12	4	2	0
									BCA试剂(μL)	200	200	200	200	200	200	200	200
蛋白质浓度(mg/mL)	0	0.025	0.05	0.1	0.2	0.3	0.45	0.5

上述试剂加完后，准确吸取10μL样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μL，轻摇，于37℃保温30min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质浓度；(2)计算方法：exosome浓缩液总蛋白质含量(mg)＝浓缩后的总体积×BCA法测定蛋白质浓度。重复6次实验，取平均值做统计学分析。

5、统计学方法

使用软件GRAGHPADPRISM5.0进行图表制作及统计学分析，计量资料以x±s表示，比较组间差异使用方差分析或t检验。

三、结果及结论

1、MTT显示不同浓度CaesalpinE作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化

MTT结果显示当CaesalpinE浓度0.75μM作用细胞时，细胞活力(71.32±4.68％)与CaesalpinE浓度0.5μM及0.25μM作用细胞时细胞组(91.43±2.74％；94.67±1.21％)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2、MTT显示0.5μMCaesalpinE不同时间作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化

MTT结果显示当0.5μMCaesalpinE作用细胞72h组(71.34±1.64％)与作用48h组(91.04±6.23％)、24h组(94.56±1.13％)对比，细胞活力差异具有统计学意义(P<0.05)。

3、Exosomes计数和蛋白定量

电镜下实验组(EX2)和对照组(EX1)exosomes计数和exosomes蛋白定量结果：经CaesalpinE处理后，RC-2细胞产生的exosomes数量和exosome蛋白含量较未经药物处理组都明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

结果说明，CaesalpinE能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖性。经CaesalpinE处理后，透射电镜观察肾癌细胞株RC-12源性exosomes形态未见明显改变，其分泌量和蛋白含量较处理前明显增加(P＜0.05)，这些说明CaesalpinE对肾癌细胞株RC-12的抑制作用与CaesalpinE引起的肾癌细胞RC-2表达野生型p53mRNA上调有关。

表1实验组和对照组分泌exosomes数量及蛋白含量对比

	n	EX2组(实验组)	EX1组(对照组)	P值
					Exo数目	3	4.67×10⁹±1.8×10²	3.76×10⁸±5.8×10²	<0.05
Exo蛋白含量	3	1.67±0.18mg	0.57±0.11mg	<0.05

Claims

1.CaesalpinE在制备治疗肾癌药物中的应用，所述CaesalpinE化学结构式如下，

2.根据权利要求1所述的CaesalpinE在制备治疗肾癌药物中的应用，其特征在于：所述肾癌为人肾癌RC-2。