CN105097415A

CN105097415A - 用于大分子复合物的质谱分析的方法和设备

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Publication number: CN105097415A
Application number: CN201510236151.1A
Authority: CN
Inventors: M·别洛夫
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-05-11
Also published as: GB201409196D0; GB2541795A; US9887074B2; GB2541795B; GB2526360B; CN105097415B; US20150340213A1; GB2526360A; DE102015006433B4; GB201612029D0; DE102015006433A1

Abstract

一种通过质谱法分析大分子复合物离子例如蛋白质复合物离子的方法，以及用于进行该方法的设备，其中该方法包括：将大分子复合物离子引入第一碎裂装置，例如堆叠环形离子导向器(优选在10^-2至10^-1mbar下)，并且将其中的复合物离子俘获持续俘获时间段(优选至少2ms)；在该第一碎裂装置中将这些俘获的复合物离子碎裂，优选在100至300V能量下，以产生单体子单元离子；通过m/z任选地选择一种或多种子单元离子的种类；将这些子单元离子种类中的一种或多种引入第二碎裂装置中，该第二碎裂装置在空间上与该第一碎裂装置分开；在该第二碎裂装置中将这些子单元离子碎裂以产生这些子单元离子的多个第一碎片离子；并且在质量分析器中对这些第一碎片离子进行质量分析，或使这些第一碎片离子经受一个或多个另外的碎裂步骤以形成另外的碎片离子并且对这些另外的碎片离子进行质量分析。

Description

用于大分子复合物的质谱分析的方法和设备

技术领域

本发明涉及质谱分析法领域，尤其是大分子复合物例如天然蛋白质复合物的质谱分析法。本发明的多个方面涉及此类复合物的MS²和MS³分析。

背景技术

质谱仪被广泛用于基于离子的质荷比(m/z)来分析离子。质谱分析法已经成为分析蛋白质的一种主要技术。最近，质谱分析法已经被应用到分析大蛋白质复合物。与质谱分析法联用的电喷射电离的发展已经使得能够分析大的完整蛋白质复合物，甚至当后者通过弱的非共价相互作用保持在一起时。鉴于蛋白质复合物在生物系统中作为多种功能模块的作用，对它们的研究是重要的。因此一个新的领域已经出现，被称为天然蛋白质质谱分析法，集中于在接近生理条件下(即，在大约中性pH下)分析这些种类。

典型地，在天然条件下产生的大的完整复合物离子具有相对高的质量和相对低的电荷状态以及因此高的m/z(典型地超过m/z5,000，或超过m/z10,000)。因此，对于这些大的完整复合物离子本身的质量分析，它已经变为飞行时间(TOF)质量分析器的典型应用，由于这些质量分析器用于评估非常高的m/z的能力，常常与专用的四极滤质器相结合(在非常低的频率下运行以扩展质量范围)。然而，最近，静电质量分析器例如轨道阱也已经用于天然蛋白质复合物(US-2014-0027629-A1)，具有质量分辨率上的优势。

然而，对于蛋白质复合物的单体结构的完全分析和识别，需要应用串联或MSⁿ质谱法。在现有技术中已经描述了许多用于完整蛋白质复合物的解离的方法，包括碰撞诱导解离(CID)、电子俘获解离(ECD)和表面诱导解离(SID)。最近在Belov,M.E.；Damoc,E.；Denisov,E.；Compton,P,D,；Makarov,A,A,；Kelleher,N,L.分析化学(Anal.Chem.),2013,85,11163–11173中已经总结和讨论了在此领域中的大部分现有技术。在该论文中，已经示出了一些相对小的蛋白质复合物可以成功地解离为组分单体子单元，然后在高能碰撞解离室(HCD室)中对这些组分单体子单元进而进行预选择和碎裂。该方法依赖于在轨道阱(Orbitrap^TM)质谱仪的包括具有注入扁平极杆(flatapole)的双离子漏斗接口的源、质量选择器和HCD室之间在“飞过(fly-through)”模式下的天然蛋白质复合物的解离。然而，已经发现那种方法对于一些大的复合物例如GroEL天然复合物是不可靠的并且已经发现其不适用于大的异源复合物(例如，GroEL-GroES14:7复合物)。

在另一种现有技术方法中，已经研究了这些天然蛋白质复合物在离子迁移/飞行时间质谱仪(IMS-TOFMS)的截取锥区域中的活化(Ruotolo,B.T.；Giles,K.；Campuzano,I.；Sandercock,A.M.；Bateman,R.H.；Robinson,C.V.在不存在本体水情况下大分子蛋白质环的证据(Evidenceofmacromolecularproteinringsintheabsenceofbulkwater).科学杂志(Science),2005,310,1658-1661；以及Benesch,J.L.P.蛋白质复合物的碰撞活化：拾取片段(Collisionalactivationofproteincomplexes:pickingupthepieces).美国质谱学会志(J.Am.Soc.MassSpectrom.),2009,20,341-348)。如由IMS测量证实的，报告了感兴趣的蛋白质复合物的重构和去折叠。然而，未观察到天然蛋白质复合物的解离(即，单体子单元的喷射)，可能由于在截取锥接口中的升高的压力。

因此，所希望的是提供用于更宽范围的大蛋白质复合物的碎裂的更有效的方法和设备。

鉴于以上背景，做出了本发明。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了一种通过质谱法分析大分子复合物离子的方法，该方法包括：

将大分子复合物离子引入第一碎裂装置中并且将其中的复合物离子俘获持续俘获时间段；

在该第一碎裂装置中将这些俘获的复合物离子碎裂以产生单体子单元离子；

通过m/z任选地选择一种或多种子单元离子的种类；

将该一种或多种子单元离子的种类引入第二碎裂装置中，该第二碎裂装置在空间上与该第一碎裂装置分开；

在该第二碎裂装置中将这些子单元离子碎裂以产生这些子单元离子的第一碎片离子；并且

在质量分析器中对这些第一碎片离子进行质量分析，并且使这些第一碎片离子经受一个或多个另外的碎裂步骤以形成另外的碎片离子并且对这些另外的碎片离子进行质量分析。

该俘获时间段优选至少2ms(毫秒)。在一个优选的实施例中，该方法可以包括将这些大分子复合物离子作为连续流引入该第一碎裂装置中，其中该俘获时间段是至少2ms；该方法进一步包括：

将这些单体子单元离子作为包从该第一碎裂装置喷射到该第二碎裂装置；

重复在该第一碎裂装置中俘获这些复合物离子和将这些子单元离子包从该第一碎裂装置喷射的步骤以便在该第二碎裂装置中积累多个子单元离子包；

在该第二碎裂装置中将该积累的多个子单元离子包碎裂以产生这些子单元离子的第一碎片离子；并且

在该质量分析器中对这些第一碎片离子进行质量分析，并且使这些第一碎片离子经受一个或多个另外的碎裂步骤以形成另外的碎片离子并且对这些另外的碎片离子进行质量分析。

本发明总体上在两个空间上分开的碎裂步骤中实施，使得能够分别进行MS²和MS³。该第一和第二碎裂装置总体上按与离子源的距离的顺序安排，即，该第一碎裂装置(用于MS²)定位为最靠近该离子源而该第二碎裂装置(用于MS³)定位为距该离子源最远。优选地，在如以下更详细描述的条件下在该第一碎裂装置中将这些复合物离子俘获或积累进行碎裂持续第一俘获时间段。另外地，在如以下更详细描述的条件下，在该第二碎裂装置中将这些产生的子单元离子总体上俘获或积累进行碎裂，例如持续第二俘获时间段。

这些复合物离子和这些子单元离子总体上通过碰撞诱导解离(CID)机理进行碎裂。这些单体子单元离子的种类可以是具有不同质荷比(m/z)的种类，这些单体子单元是这些复合物离子的单体。典型地，这些单体子单元是在该复合物中非共价地结合的复合物离子的单体，例如这些单体子单元可以是蛋白质复合物的蛋白质单体(蛋白质)。优选地，该方法包括在该第一碎裂装置的下游和该第二碎裂装置的上游通过m/z选择一种或多种子单元离子的种类，由此以此方式通过m/z选择的一种或多种子单元离子的种类被该第二碎裂装置接收。

除了分析这些碎片离子的步骤之外，本发明还包括对这些子单元离子和/或这些复合物离子进行质量分析，在这种情况下这些子单元离子可以被传递到质量分析器进行分析而无需这些子单元离子进入该第二碎裂装置和/或这些复合物离子可以被传递到质量分析器进行分析而无需在该第一碎裂装置中被俘获或碎裂。

该一个或多个另外的碎裂步骤可以在该第一和/或第二碎裂装置中进行，如将从以下说明中清楚的。

本发明还提供进行该方法的设备。

在又另一个方面中，本发明提供一种包括堆叠环组件的碎裂装置以接收从离子源产生的复合物离子。包括堆叠环组件以接收从离子源产生的离子的该碎裂装置可以用作本发明的多个方面的第一碎裂装置。

在又还另一个方面中，本发明提供一种用于对大分子复合物离子进行质量分析的质谱仪，该质谱仪包括：

离子源，该离子源用于产生大分子复合物离子；

第一碎裂装置，该第一碎裂装置包括堆叠环组件离子阱并且用于将这些复合物离子至少碎裂为单体子单元离子，该离子阱用于接收从该离子源产生的复合物离子并且将这些离子俘获持续俘获时间段；

任选地在该第一碎裂装置下游的滤质器，该滤质器用于通过m/z选择来自该第一碎裂装置的子单元离子；

在空间上与该第一碎裂装置分开的第二碎裂装置，该第二碎裂装置用于接收来自该第一碎裂装置的子单元离子并且被配置成将这些子单元离子碎裂；以及

质量分析器，该质量分析器用于接收来自该第一和/或第二碎裂装置的离子并且对这些离子进行质量分析。

在一个另外的方面中，本发明提供一种用于对大分子复合物离子进行质量分析的质谱仪，该质谱仪包括：

离子源，该离子源用于产生大分子复合物离子；

第一碎裂装置，该第一碎裂装置包括用于接收从该离子源产生的复合物离子的离子阱，其中该离子阱被配置成泵抽到高于约10^-2mbar的压力(优选从约10^-2mbar至约10^-1mbar)，以将这些复合物离子俘获持续至少2ms的时间段并且以提供这些复合物离子的每个元电荷从约100至300V的碰撞能量用于将这些复合物离子至少碎裂为单体子单元离子；

该设备优选包括在该第一碎裂装置下游的滤质器，该滤质器用于通过m/z选择来自该第一碎裂装置的离子。然后该第二碎裂装置优选在该滤质器的下游。

在再另外一个方面中，本发明提供一种用于质谱仪的离子阱碎裂装置，该离子阱包括两个不同地泵抽的区段，其中较高压力区段定位为比较低压力区段距质量分析器更远，该离子阱可以用作该第二碎裂装置。

在一个另外的方面中，本发明提供一种质谱仪，该质谱仪包括：

离子源；

碎裂装置；以及

质量分析器，该质量分析器用于接收来自该碎裂装置的离子并且对这些离子进行质量分析，

其中该碎裂装置是离子阱，该离子阱包括两个不同地泵抽的区段：较高压力区段和较低压力区段，并且该较高压力区段包括堆叠环组件。

任选地，该较高压力区段定位为比该较低压力区段距该质量分析器更远。

优选地，在本发明的其他方面中包括两个不同地泵抽的区段的该离子阱用作该第二碎裂装置。

在又另一个方面中，本发明提供一种质谱仪，该质谱仪包括：

离子源；

碎裂装置；以及

其中，该碎裂装置是离子阱，该离子阱包括两个不同地泵抽的区段，其中较高压力区段定位为比较低压力区段距该质量分析器更远，并且来自该离子源的离子必须穿过该较低压力区段以到达该较高压力区段并且必须返回穿过该较低压力区段以到达该质量分析器。

现在将描述本发明的进一步特征，包括用于实施本发明的优选实施例。

具体实施方式

优选地，这些引入的复合物离子是(完整的)蛋白质复合物离子。优选地，这些复合物离子是非共价地结合的蛋白质复合物，优选处于天然状态。这些引入的复合物离子可以包含2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多种单体，例如蛋白质单体。有利地，这些复合物离子可以是十聚体(10种单体)或更高阶的复合物(例如，十四聚体，具有14种单体)。因此，优选地，这些单体子单元离子是蛋白质离子。此外，优选地，这些第一碎片种类是肽级别的碎片(即，肽碎片)。虽然本发明在此关于蛋白质复合物进行说明，应理解的是本发明不受限于此类复合物并且可以应用于其他大分子复合物离子。其他大分子复合物可以包括DNA蛋白质、RNA蛋白质、抗体-药物轭合物、蛋白质-配体复合物等。

优选地，这些复合物离子具有至少5,000、更优选至少10,000、甚至更优选至少15,000、以及最高达30,000、或更大的质荷比。分析的这些复合物离子的质量可以大于0.2MDa、或大于0.5MDa、或大于1MDa或大于2MDa(MDa＝兆道尔顿)。该质量可以最高达2MDa、或最高达3MDa、或更大。这些子单元离子的质量可以高达100kDa(等于0.1MDa)、或更大。

本发明优选包括在离子源中产生离子并且将这些离子引入质谱仪中的步骤。优选地，这些离子通过电喷射(ESI)、尤其是纳米ESI，或MALDI，激光喷射或入口电离来产生，即，该离子源优选是以下各项之一：电喷射(ESI)离子源、尤其是纳米ESI离子源，MALDI离子源，激光喷射离子源，以及入口电离源。这些离子优选通过一种大气压力电离方法来产生，例如，像电喷射电离、MALDI等。由此产生的离子是多电荷的。

优选地，这些离子从溶液、尤其从溶液电喷射产生。这些离子优选通过有利于产生具有每单位质量低电荷(z/m)的离子的方法(优选电喷射)产生。这些离子更优选从具有大于优选5或更高的pH的溶液产生(尤其是电喷射)。尤其优选的是从具有在6至8.5的范围内、更优选在7.0至7.6的范围内的pH的溶液产生离子。因此，在此类实施例中的溶液优选处于接近-生理条件(pH～7)。因此，该离子源优选是接合至在上述范围内、尤其在6至8.5范围内pH的溶液的一个电喷射源。

优选地，在该离子源与该第一碎裂装置之间提供离子漏斗安排，优选双离子漏斗安排，其中该离子源是电喷射离子源，具有从该离子源到该离子漏斗安排内的正交离子注入。此种安排有助于这些复合物离子的有效去溶剂化。

在某些实施例中，该第一碎裂装置是离子阱，并且在此类实施例中，优选地，该第一碎裂装置是线性离子阱，例如多极杆。该离子阱优选被配置成提供轴向电场和RF电场。在优选的实施例中，该第一碎裂装置包括堆叠环组件，即，RF堆叠环组件。以下描述了该堆叠环组件的进一步细节。

该第一碎裂装置，作为例如线性离子阱或堆叠环组件，优选具有定位在其两端的端电极，这些端电极允许离子被俘获在该装置中并且当需要时被释放。该第一碎裂装置，作为例如线性离子阱或堆叠环组件，优选具有处于孔口的形式的一个入口门和一个出口门，在使用中向这些门可控制地施加电压(通过控制器)以俘获其中的离子(在俘获模式期间)或允许离子进入或退出该装置。

优选地，这些复合物离子被俘获(积累)在该第一碎裂装置中持续至少2ms、更优选从约2至200ms、尤其从约2至20ms(毫秒)的时间段。优选地，这些复合物离子从连续离子流被引入该第一碎裂装置中并且被俘获且积累在该第一碎裂装置中持续至少2ms、更优选从2至200ms、尤其从2至20ms的时间段，然后将子单元离子朝向该第二碎裂装置喷射。因此，优选地，在朝向该第二碎裂装置喷射之前，这些积累的离子解离成多个子单元离子。

优选地，在该第一碎裂装置中的压力是高于约10^-2mbar。更优选地，在该第一碎裂装置中的压力是从约10^-2mbar至约10^-1mbar、尤其是约10^-1mbar的量级。优选地，这些复合物离子在该第一碎裂装置中经历在每个元电荷从约100至300V、优选200至300V的碰撞能量下的碰撞解离。该第一(和第二)碎裂装置总体上填充有一种如本领域中已知用于离子的碰撞解离的缓冲气体。

在此种较高动能下在该第一碎裂装置内部的大的、完整的例如蛋白质复合物的积累确保赋予足够的内能到这些俘获的离子的旋转和振动模式中。与将在感兴趣的离子与缓冲气体之间的相互作用时间限制为这些离子横穿该碰撞室的时间的现有技术的飞过方法相比，在该第一碎裂装置中的俘获能力确保了要求的碰撞数量以促进有效的蛋白质复合物重构(例如，去折叠)和解离。也就是说，一旦这些复合物或前体离子在高能量下被俘获在该第一碎裂装置中，它们每次碰撞接收高的活化能并且还经受大量的碰撞，这些碰撞对于较大蛋白质复合物的解离是足够的。此外，动能调制不再是如现有技术中成为问题，因为，在解离时，这些碎片离子在该阱中变得碰撞弛豫，并且然后在最佳设置下喷射以传输通过下游离子光学器件。使用现有技术方法时，存在被认为是与能量值相关的问题，该能量值可以存放到大蛋白质复合物的内部自由度中以超过解离阈值。在增加碰撞数量的同时，仅增加在界面区域中的压力，导致每次碰撞的活化能的成比例减少以及不足的能量转移到复合物解离的振动和旋转模式内。考虑到这个区域中的短停留时间，不可能可靠地解离更大的复合物。减少该同一区域中的压力导致每次碰撞的能量转移的增加，但带来这些离子的动能的调制和不完全的碰撞弛豫，这进而导致离子逃逸出由RF径向限制场产生的能量位垒以及随后的信号损失。

从以上可看出，一个优选的第一碎裂装置包括用于接收从该离子源产生的复合物离子的离子阱，其中该离子阱被配置成泵抽到高于10^-2mbar的压力(优选从10^-2mbar至10^-1mbar、尤其约10^-1mbar的量级)，以将这些复合物离子俘获持续至少2ms的时间段并且以提供这些复合物离子的每个元电荷从约100至300V(优选从200至300V)的碰撞能量用于将这些复合物离子至少碎裂为多个单体子单元离子。该离子阱最优选是堆叠环组件。

优选地，通过m/z选择一个或多个子单元离子(也被称为相对于它们的随后下游碎裂的前体离子)通过滤质器进行，该滤质器位于该第一碎裂装置的下游，更优选地位于该空间上分开的第一和第二碎裂装置之间。这些m/z选择的离子被该第二碎裂装置接收，例如用于MS³碎裂。该滤质器优选是多极杆，例如，四极滤质器，但在其他实施例中，它可以是例如质量分辨离子阱。因此，优选地该谱仪包括位于该空间上分开的第一和第二碎裂装置之间的滤质器，该滤质器优选是施加有质量分辨用RF/DC的四极滤质器。该四极滤质器优选能够选择在最高达并且高于20,000的m/z下的前体离子种类。操作中的滤质器可以选择单一m/z种类或者窄或宽范围的m/z种类以传输通过该四极杆。因此，单一前体离子种类可以进行选择并且传输，或者多种前体离子种类可以进行选择并且同时传输通过该四极杆质量分析器。在多种前体离子选择的情况下，该四极杆质量分析器优选在仅RF模式下用叠加的辅助RF波形运行。该辅助波形优选作为双极激励施加在一对相对的四极杆之间。该辅助RF波形的频谱典型地由具有最高达十个不同陷波的经调整的噪声组成，对应于在该四极杆质量分析器中的前体离子的久期振荡(secularoscillation)的频率。在该频谱中的每个陷波的宽度优选在约1kHz至5kHz的范围内。

优选地，这些(选定的)子单元离子在该第二碎裂装置中经历在每个元电荷从约100至200V的碰撞能量下的碰撞解离(即，这些子单元离子的碰撞解离在该第二离子阱中在这些子单元离子的每个元电荷100至200V的范围内的动能下发生)。

优选地，该第二碎裂装置是离子阱。优选地，在该第二碎裂装置中或在该第二碎裂装置的至少一部分中的压力低于该第一碎裂装置中的压力。优选地，在该第二碎裂装置中的压力是从约10^-4mbar至10^-1mbar。更优选地，在该第二碎裂装置的至少一部分中的压力是从约10^-4mbar至10^-3mbar。更优选地，在该第二碎裂装置的至少另一部分中的压力是高于约10^-2mbar、更优选从约10^-2mbar至10^-1mbar。

在一些实施例中该第二碎裂装置可以位于终端(dead-end)位置，即，其中离子从一个端(例如，一个低压端)进入该第二碎裂装置并且必须经由同一端(例如，低压端)离开。为此目的可以在该第二碎裂装置中提供DC轴向场。

在某些实施例中，该第二碎裂装置可以是线性离子阱或碰撞室。该第二碎裂装置可以是高压碰撞解离(HCD)室，优选位于该质量分析器的上游，该HCD室在该第一碎裂离子阱的下游。

在更优选的实施例中，该第二碎裂装置是配置为两个分开区段的离子阱。对于此配置，该第二碎裂装置优选分成不同地泵抽的压力区域，包括较高压力区域(优选高于10^-2mbar、更优选在10^-2至10^-1mbar下)和较低压力区域(优选在10^-4至10^-3mbar下)。

优选地，该第二碎裂装置的较高压力区域包括堆叠环组件。优选地，该第二碎裂装置的较低压力区域包括多极杆。

该第二碎裂装置，作为例如线性离子阱或堆叠环组件，优选具有定位在其两端的端电极或栅电极，这些端电极或删电极允许离子被俘获在该装置中并且当需要时被释放。

优选地，该质量分析器是高质量分辨率分析器，并且还优选是高质量精确度分析器。该质量分析器优选是静电阱或飞行时间(TOF)或四极杆质量分析器或FT-ICR质量分析器。该静电阱最优选是轨道式阱质量分析器，例如轨道阱。该谱仪在一些实施例中可以包括多于一个质量分析器，即，它可以包括上述高分辨率质量分析器和另一种质量分析器例如线性离子阱质量分析器之一。

在质量分析之后，该方法优选进一步包括从这些碎片离子的质量分析，即，通过确定肽序列，识别这些复合物离子的单体子单元(例如，蛋白质)。

在其中该第一碎裂装置包括堆叠环组件(即，RF堆叠环组件)的优选实施例中，该堆叠环组件优选被配置成提供轴向电场。该堆叠环组件还优选被配置成提供RF电场，例如通过将RF波形施加到该堆叠环组件的电极上。

优选地，该第一碎裂装置的堆叠环组件包括多个环形电极，其中相邻的电极彼此电阻地耦合。可以跨过该多个电极施加DC电压，从而提供轴向电场。而且，提供RF电源用于将两个RF电压波形施加到该多个电极上，从而使得将这些RF波形之一施加到每隔一个的电极上并且将另一个RF波形施加到其余电极上，这两个RF电压波形是彼此180°异相的。以此方式，相邻的电极具有相反的极性。该堆叠环组件优选包括至少四个独立受控的电极。最优选地，该堆叠环组件包括四个电极。

优选地，该堆叠环组件的电极被电容地耦合到这些RF波形上。优选地，这些RF波形具有100V_pp至300V_pp的RF幅值。优选地，这些RF波形具有约2MHz的RF频率。

优选地，在操作中该第一碎裂装置的堆叠环组件中的压力是至少约10^-2mbar，尤其从约10^-2mbar至10^-1mbar。优选地，该第一碎裂装置的堆叠环组件被配置成(即，具有通过控制器施加到其电极上的电压)为其中的离子提供每个元电荷约100至300V、优选200至300V的碰撞能量。

使用堆叠环组件增加了该第一碎裂装置的电荷容量并且使得能够使用在比用线性阱(例如，扁平极杆)的显著更低的幅值下的RF波形。前一因素对于获得例如在源自大蛋白质复合物的MS³谱中的碎片离子的较高的信噪比是重要的。后一因素可以缓解在过渡压力范围(10^-1mbarxcm)中施加高压的电晕放电特性的开始。该堆叠环组件还有助于这些复合物离子的有效去溶剂化。

在该碎裂装置中，优选地该第二碎裂装置中，该碎裂装置是包括两个不同地泵抽的区段的离子阱，优选地较高压力区段定位为比较低压力区段距该质量分析器更远，并且优选地较低压力区段定位为比该较高压力区段更靠近该第一碎裂装置，这样使得离子总体上必须首先穿过(最初经由该较低压力区段的入口)该较低压力区段以到达该较高压力区段并且随后必须再次穿过该较低压力区段(最终经由该较低压力区段的入口离开)以到达该质量分析器。

优选地，此装置具有配置为泵抽到高于约10^-2mbar的压力的较高压力区段。优选地，该碎裂装置的较高压力区段被配置成在操作中泵抽到约10^-2mbar至10^-1mbar的压力。优选地，该第二碎裂装置的较低压力区段被配置成在操作中泵抽到10^-4mbar至10^-3mbar的压力。

优选地，该第二碎裂装置的较高压力区段包括堆叠环组件。该较高压力区段的堆叠环组件优选提供轴向DC电场并且优选包括多个环形电极，其中相邻的电极是彼此电阻地耦合的。可以跨过该多个电极施加DC电压，从而提供轴向电场。而且，提供RF电源用于将两个RF电压波形施加到该多个电极上，从而使得将这些RF波形之一施加到每隔一个的电极上并且将另一个RF波形施加到其余电极上，这两个RF电压波形是彼此180°异相的。以此方式，相邻的电极具有相反的极性。该较高压力区段的堆叠环组件优选包括四个或至少四个独立受控的电极。优选地，这些电极被电容地耦合到这些RF波形上。优选地，这些RF波形具有100V_pp至200V_pp的RF幅值。优选地，这些RF波形具有约2MHz的RF频率。

优选地，该第二碎裂装置被配置成(通过施加到其电极上的电压)为其中的离子提供每个元电荷约100至200V的碰撞能量。因此，优选地，该较高压力区段的堆叠环组件被配置成(通过施加到其电极上的电压)在实验室参考系中为其中的离子提供每个元电荷约100至200V的碰撞能量。

优选地，该第二碎裂装置的较低压力区段包括RF多极杆，优选具有轴向dc电场。该轴向场允许在随后离子转移到该质量分析器之前邻近该多极杆入口将离子(即，碎片离子)压缩成包。可控电压可以施加到该多极杆的入口门或孔口上以使得邻近该入口的这些压缩离子从该多极杆中释放以转移到该质量分析器中。因此该第二碎裂装置优选被配置成允许这些子单元离子在该较高压力区段中碎裂并且随后在将这些碎片离子转移到该质量分析器之前在该较低压力区段的入口附近积累这些碎片离子。

优选地，该较高压力区段的堆叠环组件被配置成在操作中泵抽到高于约10^-2mbar的压力、更优选到约10^-2mbar至10^-1mbar的压力。该碎裂装置的较低压力区段，例如多极杆区段优选被配置成在操作中泵抽到10^-4mbar至10^-3mbar的压力。

使用由堆叠环组件和具有轴向电场的RF多极杆组成的该碎裂装置的不同地泵抽的区段的优选安排提高了i)在该堆叠环组件中的离子的高效率俘获和碎裂，ii)通过该多极杆入口的有效的离子包压缩和随后到高分辨率质量分析器中的高效率离子转移；以及iii)在该质量分析器中的较低压力，这对于获得高的质量准确度和分辨率是极其重要的。此外，该高压力区段对于完整蛋白质也是有效的，由于完整蛋白质复合物可以在该较高压力区段中被俘获并且碰撞地弛豫并且然后被喷射到该质量分析器例如轨道阱中以在较低压力下进行高分辨率检测。

优选地，本发明进一步包括，在将离子引入该(高分辨率)质量分析器之前，该质量分析器进而优选是静电阱但可以是TOF或FT-ICR，将这些离子在注入离子阱中俘获(即，存储)，该注入离子阱是例如线性离子阱。该注入离子阱优选是多极杆离子阱，例如多极杆线性离子阱，在注入到轨道式阱例如轨道阱中的情况下尤其是弯曲的线性离子阱(C-阱)。这些离子优选直接从这个注入离子阱被引入该质量分析器中，尤其作为离子脉冲从该注入离子阱被引入该质量分析器中。该注入离子阱可以接收来自该第二碎裂离子阱和/或来自该第一碎裂离子阱、优选来自两者的离子。在一个优选的实施例中，该注入离子阱位于该第一和第二碎裂室之间，还优选在该滤质器的下游。

该质量分析器总体上不受限于任何特定类型，但通常是具有高质量分辨能力和高质量准确度的质量分析器并且例如可以是静电阱，例如轨道阱(例如，Orbitrap^TM)、或FT-ICR质量分析器或TOF质量分析器。该方法包括将这些有待分析的离子引入该质量分析器中并且检测在该质量分析器中的离子。该质量分析器优选用于接收和俘获其中的离子并且用于使得这些离子经历周期运动，例如在该质量分析器内振荡(该术语在此还涵盖旋转运动)。优选地，在该质量分析器中的离子的振荡通过镜像电流检测进行检测。此种检测优选由静电阱质量分析器，例如轨道式阱来提供。优选地，该质量分析器中的压力不大于1×10^-8mbar、优选不大于5×10^-9mbar、更优选不大于2×10^-9mbar并且甚至更优选不大于1×10^-9mbar。

用于该质谱仪的控制器优选包括被编程例如以控制按上述方式的离子引入的计算机，该方式包括上述的离子的俘获和碎裂、将必要的电压施加到这些离子阱(堆叠环组件)的电极上以及控制该真空泵抽以获得指定压力的步骤。信号处理系统还优选包括计算机，该计算机被编程以确定在该质量分析器中检测到的至少一些离子的质荷比并且产生质谱。该控制器和该信号处理系统可以包括相同的计算机、或不同的计算机。

本发明，在实施例中，提供了一种用于解离天然蛋白质复合物的多阶段碎裂方法(使得能够进行MS³、MSⁿ)。该方法包括首先将这些复合物俘获持续一段时间，尤其在堆叠环组件中，以使得能够在高压力和高碰撞能量的条件下将这些蛋白质复合物有效碰撞诱导解离(MS²)为这些组分单体子单元(蛋白质单体)，优选接着通过它们的质荷(m/z)比(例如，用四极滤质器)选择单体子单元，并且随后将这些单体子单元解离(尤其是碰撞诱导解离)为单体碎片，尤其使用双压力区段离子阱(MS³)。然后将这些单体碎片离子在高的质量分辨率和质量测量准确度下进行分析，从而使得能够进行这些单体子单元(蛋白形式(proteoforms))的可靠识别并且随后测定该完整蛋白质复合物的化学计量比和组成。如果需要的话，在该第二碎裂装置中产生的第一碎片(肽级别的碎片)可以在该第二碎裂装置中、或通过将这些离子传递回上游到该第一碎裂装置中而经受一个或多个另外的碎裂步骤(MS⁴或更一般地MSⁿ)。因此，本发明的第一和第二碎裂装置的组合还可以用于MSⁿ实验，以便离子可以在这些阱之间来回传递，使得能够在每个俘获事件上选择和碎裂。本发明不排除在该质谱仪中提供可以用于另外的碎裂阶段的第三碎裂装置等等的可能性。

附图说明

图1示意性地示出了根据本发明的一个实施例的质谱仪。

图2示意性地示出了图1的质谱仪的多个部分的电势，用于MS²事件(A)、用于MS³事件(B)以及用于将离子吹扫到在该质量分析器之前的c-阱(C)。

图3示意性地示出了包括堆叠环组件的根据本发明的另一个实施例的质谱仪的一部分。

图4示出了在本发明的一个实施例中分别施加到该前端阱的出口门和该质量分析器触发器上的两个实验波形。

图5示出了GroEL的14聚体蛋白质复合物的使用本发明的一个实施例记录的实验质谱，其中图A)示出了完整14-聚体复合物的质谱；B)示出了伪MS²谱；C)示出了在该前端阱中活化和在1000Th的m/z窗口下的四极杆选择两者之后的GroEL子单元的质谱；并且D)示出了通过在该前端阱中GroEL复合物的解离和随后通过该四极滤质器的选择获得的单电荷状态的GroEL子单元的质谱。

图6示出了对于14-聚体GroEL复合物的使用本发明获得的MS³谱，其中A示出了在该GroEL单体的3个最大丰度电荷状态的分离之后的完整MS³谱；B示出了A中质谱的具有选定的肽识别的一部分；并且C示出了来自谱B的肽识别之一。

图7示出了使用本发明获得的谱，其中谱A示出了完整GroEL-GroES14:7复合物的质谱；谱B示出了其中指出了GroES单体的电荷状态的伪MS²谱；并且谱C示出了谱B的展开图，该展开图示出了不同电荷状态的GroEL单体、GroES单体和GroES六聚体的峰。

图8示出了对于GroEL-GroES14:7复合物的使用本发明获得的一个另外的谱，其中A示出了其中通过该四极滤质器选择[GroES+5H]⁵⁺单体的来自GroEL-GroES14:7的MS²谱；并且B示出了来自[GroES+5H]⁵⁺前体的碎片的MS³谱。

图9示出了对于GroEL-GroES14:7复合物的使用本发明获得的又一个另外的谱，其中A示出了使用该四极杆选择GroEL子单元；并且B示出了MS³谱，其中指出了GroEL骨架碎片(在图9C中展开的部分)，连同GroES单体(在图9D中展开的部分)和碎片。

发明详细说明

为了使得能够更详细理解本发明，现在将以举例方式并参考附图说明来描述多个实施例。

参见图1，示意性地示出了根据本发明的一个实施例的质谱仪。在对大蛋白质复合物进行测序中的三个相继事件是：i)MS²，即，蛋白质复合物解离成单体子单元，ii)MS³，即，基于m/z的选择和接着将这些单体子单元碎裂为钛级别的碎片，iii)将这些碎片离子转移到高分辨率质量分析器中。将参考该质谱仪描述这些事件。

质谱仪10总体上包括由一个四极滤质器4分开的两个离子阱或碰撞室2和6。一个离子引入系统包一个电喷射离子(ESI)源12(例如，纳米ESI源)，该电喷射离子源将离子正交地引入一个包括离子漏斗1a和1b的双离子漏斗安排中。在Belov,M.E.；Damoc,E.；Denisov,E.；Compton,P,D,；Makarov,A,A,；Kelleher,N,L.分析化学,2013,85,11163–11173中描述了此类正交离子注入系统。在使用中，复合物离子例如完整的、天然状态的蛋白质复合物的离子由此被电喷射到这些离子漏斗中。在该离子漏斗区域中的压力典型地高于1mbar(例如1-20mbar)，例如2mbar。这些离子在这些离子漏斗中至少经历部分去溶剂化。

在图2中示意性地示出了在不同阶段在该质谱仪中的电位电压。在图2(A)中示出了在第一阶段(即，第一阶段解离/MS²)期间的电位。在区域(1)中的电位梯度代表了离子漏斗1a、1b的区域中的轴向场。然后这些离子通过轴向电位被传递到离子阱2。

离子阱2，可以被称为该“前端”阱，是该谱仪的第一碎裂装置。在所示出的该实施例中，离子阱2是一个四极杆并且更确切地说是一个扁平极杆。离子阱2具有处于孔口形式的一个入口门8a和一个出口门8b。在一种操作模式中，在入口门8a具有降低的电位时，这些复合物离子作为一个连续流被引入该离子阱内持续一段时间。出口门8b具有升高的电位以将离子在该离子阱中俘获。这些复合物离子从该离子流积累持续一段时间并且然后升高该入口门电位以将这些离子在该离子阱中俘获。在该离子阱中的总的俘获时间或停留时间是至少2ms并且优选是从2至200ms，尤其2至20ms。图2(A)示出了在一个俘获时间段期间对应于离子阱2中的区域的区域(2)中的势阱。势阱(2)由通过这些入口和出口门8a、8b提供的势垒界定。

离子阱2填充有一种缓冲气体用于这些复合物离子的碰撞解离并且在离子阱2中的压力高于10^-2mbar并且优选是10^-2mbar至10^-1mbar。在一个优选的实施例中，离子阱2中的压力是10^-1mbar。该碰撞解离是用典型地在实验室参考系中每个元电荷100至300V、优选200至300V的范围内的动能进行的。此种碰撞能量源自在该阱入口门和这些扁平极杆处的电位之间的差异。例如，为此目的，100V的电位可以施加在该阱入口处并且-200V施加在该注入扁平极杆处。离子阱2中的离子的停留时间和压力，连同高碰撞能量，对于使得将甚至大蛋白质复合物解离为它们的单体子单元(蛋白质)是有效的。然后通过升高离子阱2的电位并且降低出口门8b的电位从该离子阱中释放包含这些子单元(蛋白质)的解离离子，如在图2(B)中示出的。

前端离子阱2位于m/z选择装置4的上游，该m/z选择装置在该实施例中是一个四极滤质器。m/z选择装置4的能够选择m/z超过20,000的前体离子种类。在该离子阱中的解离事件之后，该大复合物的单体子单元的喷射离子由一个保持在10^-3mbar的压力下的弯曲多极杆离子导向器3(一个扁平极杆)被引导至m/z选择装置4，在此处通过它们的m/z对它们进行选择并且然后引入在该m/z选择装置下游的另一个线性离子阱6中。m/z选择装置4中的压力是10^-6mbar。这些离子在m/z选择装置4中的下游通过一个传输多极杆14和弯曲线性离子阱5(压力10^-5mbar)被引导以进入另一个线性离子阱6。在图2(B)中示出了当对离子进行m/z选择并且将其传输到另一个离子阱6进行该第二解离事件(MS³)时弯曲扁平极杆(3)、m/z选择装置(4)和弯曲线性离子阱或c-阱(5)的区域中的电位。

离子阱6，可以被称为该“后端”阱，是该谱仪的第二碎裂装置。在图2(B)中示出了离子阱6的区域(6)中的俘获电位。在这个实施例中离子阱6是一个更高能量碰撞解离(HCD)室，在所示出的实施例中总体上在10^-1-10^-4mbar范围内并且在10^-3mbar下的压力下运行。在离子阱6中，该较大蛋白质复合物的单体子单元的离子经历更高能量碰撞。这些单体子单元或蛋白质离子将在该离子阱中在实验室参考系中每个元电荷100-200V的碰撞能量下被活化并且然后将有效地碎裂为组分肽级别碎片。离子阱6中的俘获时间对于蛋白质复合物典型地是10至200ms。

这些肽级别碎片随后从离子阱6转移到c-阱5中并且从那里到该质量分析器中，该质量分析器在所示出的实施例中是一个轨道阱7。在图2(C)中，示出了升高在离子阱6中的电位以将这些离子转移出该阱，在将这些离子从c-阱5转移到轨道阱7中之前，初始地将这些离子在该c-阱中俘获。在该轨道阱中的高分辨率质量分析产生关于这些肽碎片的m/z信息，该信息进而使得能够识别这些单体子单元。

在本发明的一个优选实施例中，来自一个连续离子流的复合物离子在前端离子阱2中积累并且解离持续2至20ms的固定时间段并且然后在每个积累时间段之后以一个包被喷射，这样使得多个包对于每个在后端阱6中的单一积累事件从该前端离子阱被转移。对于在该后端阱中的整个积累时间段，该质量选择装置将进行调谐以通过离子的m/z选择感兴趣的前体离子(单体子单元或蛋白质离子)。

在本发明的另一个优选的实施例中，前端离子阱2，不是包括上述的扁平极杆，而是相反包括一个堆叠环组件，例如具有四个独立受控的电极。该堆叠环组件的每两个相邻电极是彼此电阻地耦合的，例如使用100kOhm电阻器，以提供跨过该组件的轴向电场。两个射频(RF)波形用于径向地限制这些蛋白质复合物和被喷射的子单元两者的离子。该组件的每隔一个电极耦合到对应的RF波形上，优选是使用例如一个10nF电容器电容地耦合的。这些RF波形在100V_pp至300V_pp的RF幅值和2MHz的RF频率下运行并且是180°异相的。在这些离子被俘获在该堆叠环组件中持续至少2ms、优选从2至200ms、并且最优选2至20ms时，碰撞活化在该堆叠环组件中在实验室参考系中每个元电荷100至300V的范围内的动能下进行。

在本发明的另一个优选实施例中，后端阱6分成不同地泵抽的压力区域，在此被称为较高(10^-1-10^-2mbar)和较低(10^-3-10^-4mbar)压力区段。该后端阱的较高压力区段被构造成一个堆叠环组件，在构造上与上述的那个堆叠环组件类似。因此，该堆叠环组件是用两个180°异相的RF波形激励的并且该堆叠环组件的电极使用例如10nF电容器交替地耦合到相应RF波形上。这些RF波形在100V_pp至200V_pp的RF幅值和2MHz的频率下运行的。相邻的电极是DC耦合的，例如使用100kOhm电阻器，以提供跨过该装置的一个轴向电场。在具有不同地泵抽的压力区域的这个实施例中，后端阱6的较低压力区段包括一个具有轴向DC电场的仅RF多极杆。在四极滤质器4中的m/z选择之后，这些单体子单元离子被引导到该后端阱的较高压力区段中以俘获和碎裂。在该较高压力区段中的碎裂和碰撞弛豫之后，这些肽级别的碎片被传输到该后端阱的较低压力区域以通过该阱的入口电极进行积累和聚束。一旦离子云在该后端阱的较低压力区域中被紧密压缩，这些碎片离子种类然后被转移到质量分析器7中(经过c-阱5)以进行高质量准确度和高分辨率检测。

在图3中示意性地示出了使用分成不同地泵抽的压力区域的后端阱6的此类实施例，连同类似于图2的电位分布图。为了简明起见在该图中省略了电喷射源和轨道阱，并且该图仅旨在示出与这些离子的俘获和碎裂相关的组件的布局。这些复合物离子穿过其进入该系统的离子漏斗离子导向器1(在2mbar压力下)接合到保持在10^-1mbar的前端阱2上。前端阱2优选通过如上所述的堆叠环组件来实施。在这些复合物离子在前端阱2中解离时，从前端阱2喷射的子单元离子被传输穿过转移多极杆3(在10^-3mbar下)、m/z选择装置4(在10^-6mbar下)和多极杆(c-阱)5(在10^-5mbar下)最终进入后端阱6。后端阱6包括一个较低压力区段6a(在10^-3mbar下)和一个较高压力区段6b(在10^-1mbar下)。该后端阱的较高压力区段6b被构造成一个堆叠环组件，如上所述的。该后端阱的较低压力区段6b包括一个具有轴向DC电场的仅RF多极杆。在四极滤质器4中的m/z选择之后，这些单体子单元离子被引导到该后端阱的较高压力区段6b中以俘获和碎裂。在碎裂和碰撞弛豫之后，这些肽级别的碎片将被传输到该后端阱的较低压力区域6a以通过该较低压力区段的入口电极16进行积累和聚束(通过该RF多极杆的dc-电场)。一旦这些离子在该后端阱的较低压力区域6a中被紧密压缩，这些碎片离子种类然后将被转移到质量分析器中。

典型地，对于后端阱6中的每次积累和随后的质量分析将在前端离子阱2中进行多个俘获和喷射事件。参见图4，示出对于图1中示出的本发明的实施例如施加到前端阱2的出口门8b和质量分析器(轨道阱)触发器上的两个实验波形。在前端阱2中的4ms持续时间的俘获事件期间，出口门8b维持在20至100V电位下(参考接地)以确保阻断来自该纳米ESI源的连续离子流。该前端阱的杆维持在-100至-200V的电位下。在该离子吹扫事件中，离子以窄的200μs(即，0.2ms)宽的包从该前端阱中被释放。吹扫事件对应于该出口门波形的较低电位。与降低该出口门电位同时地，将这些前端阱杆处的电位(即，偏压电位)增加到最佳传输电压(典型地+4至+7V)。该轨道阱触发器脉冲显示为叠加在该出口门的脉冲上。

已经发现本发明对于以高质量分辨率和良好的信噪比S/N获得大的完整蛋白质复合物的结构和序列信息是有效的。参见图5，示出了使用纳米ESI源从乙酸铵缓冲液电喷射的GroEL的14-聚体蛋白质复合物(MW_14单体:800,760.7Da；MW_单体:57,197.19Da)的使用本发明记录的实验质谱。在图5中，图A)示出了完整14-聚体复合物的质谱；B)示出了伪MS²谱，揭示了14-聚体GroEL复合物解离为单体子单元；C)示出了在该前端阱中活化和在1000Th的m/z窗口下的四极杆选择两者之后的GroEL子单元的质谱；并且D)示出了通过在该前端阱中GroEL复合物的解离和随后通过该四极滤质器的选择获得的单电荷状态的GroEL子单元的质谱。

图6示出了用该14-聚体GroEL复合物获得的MS³谱。详细地，图6A示出了在该GroEL单体的3个最大丰度电荷状态的分离之后的完整MS³谱；并且B示出了A中质谱的具有选定的肽识别的一部分。在4.7ppm的均方根(RMS)误差下识别了总计97种y-和b-碎片。在97种已识别的骨架碎片中的57种是独特的，产生48％的蛋白质序列覆盖率。所实现的高的分辨率和S/N可以从谱B的肽识别之一的图6C中的谱中看出。

虽然解离类GroEL的大复合物在现有技术的“飞过”模式中是可行的，已经发现那种方法是不可靠的并且与不同的样品制备技术是不兼容的。此外，已经发现该现有的飞过模式不适用于较大或异源复合物例如GroEL-GroES14:7、或IgM五聚体复合物。相比之下，本发明已经用于有效地解离GroEL-GroES14:7并且获得MS²和MS³谱。参见图7，在谱A中，示出了使用本发明获得的在Mg-ATP存在下完整GroEL-GroES14:7复合物的质谱；谱B示出了伪MS²谱，揭示了该14:7复合物的解离，其中指出了不同电荷状态的GroES单体子单元。在图7C中示出了谱B的展开图，该展开图示出了不同电荷状态的GroEL单体、GroES单体和GroES六聚体的峰。在图8A中示出了其中通过该四极滤质器选择[GroES+5H]⁵⁺单体的来自GroEL-GroES14:7的MS²谱。图8B示出了来自[GroES+5H]⁵⁺前体的碎片的MS³谱。在3.3ppm的RMS误差下识别了总计69个骨架碎片。发现独特碎片的数量是35，产生从GroEL-GroES14:7异源复合物喷射的GroES子单元的100％的序列覆盖率。如图9A中示出的，也进行使用该四极杆选择GroEL单体子单元，该图示出了GroEL单体和GroES六聚体的分离。在图9B中示出了MS³谱，其中指出了GroEL骨架碎片(在图9C中展开的部分)，连同GroES单体(在图9D中展开的部分)和碎片。虽然GroES六聚体种类的试验性识别基于粗略的电荷状态去卷积是可行的，在以下MS³实验中获得了GroES六聚体在GroEL-GroES14:7异源复合物的MS²谱中存在的直接证实。三种不同电荷状态的GroES单体子单元和若干碎片在好于5ppm的质量准确度下衍生自单一电荷状态的GroES六聚体。此外，GroEL单体子单元的MS³碎裂产生了在2.3ppm的RMS误差下49种骨架碎片的识别。发现源自GroEL子单元(其进而从该GroEL-GroES14:7复合物被喷射)的独特GroEL骨架碎片的总数是34，产生了34％GroEL子单元序列覆盖率。所获得的数据显示本发明能够提供用于对大的天然蛋白质复合物到骨架碎片，即，蛋白质复合物到单体到骨架碎片进行测序的可靠碎裂途径。

已经发现在该前端阱的升高压力区域中在高动能下俘获大的完整前体复合物离子解决了现有技术方法在这些大的完整前体复合物的活化和这些被喷射的单体子单元的碰撞弛豫两者中的低效率。本发明已经用于，例如，成功地解离大的异源蛋白质复合物(例如，在870,300Da的MW和最高达12,000的m/z下u的GroEL-GroES)并且然后相继地选择不同类型的子单元用于随后碎裂为组分肽级别的碎片以使用在高质量分辨率和质量准确度下的质谱法对这些蛋白质进行测序和识别。使用10ppm或更好的质量准确度和70,000或更好的质量分辨能力可信地识别了GroEL和GroES复合物两者。

本发明的优点在于将大的天然蛋白质复合物在m/z选择装置(例如，一个rf/dc四级杆)之前有效解离为组分单体子单元(MS²解离)。这可以通过在～10^-1mbar的升高压力区域中在较高的动能下俘获这些前体离子来实现。在解离时，这些被喷射的单体子单元也碰撞地弛豫并且它们可使用最佳设置被转移穿过该m/z选择装置以进行较高分辨率的四级杆选择。由此本发明解决了在该前端接口与该m/z选择装置之间的区域中的大的天然蛋白质复合物的低效率解离。

在一个优选的实施例中，本发明利用在该m/z选择装置之前在升高压力下的一个堆叠环装置中较大的天然蛋白质复合物的俘获以使得能够进行离子包的较高动能活化和轴向场控制的俘获和喷射。此外，在较低RF电位下的堆叠环组件的较大电荷容量具有极大的益处：在该过渡压力范围(～10^-1mbar)中积累大量离子(>10M元电荷)，而不开始电晕放电。

在另一个优选的实施例中，该实施例优选使用在该m/z选择装置之前的堆叠环装置，两个不同地泵抽的区域与在该m/z选择装置的下游的HCD室的结合使得能够进行用于MS³解离的俘获、碎裂和离子转移事件的去耦合。当处理大蛋白质子单元(例如，在MW57,161Da下的GroEL单体)时，前两个事件在较高压力区域(例如，10^-1mbar)中最有效地实施，而在较低压力区域(例如，10^-3mbar)中实施后一事件使得能够不考虑该前体离子质量而进行较高分辨率的检测。类似于上述在该m/z选择装置之前的碎裂装置，一个堆叠环组件是用于～10^-1mbar的较高压力区域中的最合适的装置，由于该装置在较高压力(>10^-1mbar)和对于最大RF幅值的减少的要求(在1MHz下100V_pp)下的高电荷容量(>50M元电荷)。

应理解的是，可以在仍然落入本发明的范畴时对本发明的前述实施例进行变化。除非另有陈述，否则本说明书中披露的各个特点可以由具有相同、等效或相似作用的替代特征取代。因此，除非另外陈述，所披露的每个特征仅是一系列的等效或相似的属类特征的一个实例。

在此所提供的任何以及所有的示例或示例性语言(“比如”、“如”、“例如”以及相似语言)的使用仅旨在更好的示出本发明，并且除非另外主张，并不指示对对本发明的范畴的限制。本说明书中任何语言都不应被解释为将任一非权利要求的要素指示为是实践本发明所必须的。

如在此所使用的，包括在权利要求书中，除非上下文另有指示，这里的术语的单数形式被解释为包括复数形式，并且反之亦然。例如，除非上下文另外说明，否则在此包括权利要求中的单数引用，如“一种/个(a或an)”是指“一个/种或多个/种”。

贯穿本说明书的说明书和权利要求书，词语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”以及这些词的变形，例如“包括着”和“包括了”等，意味着“包括但不限于”，并且并非旨在(并且并不)排除其他成分。

本说明书中所披露的任何步骤都可以任何顺序进行或者同时进行，除非另外陈述或上下文另外要求。

所有在本说明书中所披露的特征可以任何组合方式进行组合，这类特征和/或步骤中至少一些相互排斥的组合除外。具体而言，本发明的优选特征适用于本发明的所有方面并且可以以任何组合方式使用。同样，非本质的组合形式中描述的特征可以单独使用(不进行组合)。

Claims

1.一种通过质谱法分析大分子复合物离子的方法，该方法包括：

通过m/z任选地选择一种或多种子单元离子的种类；

将这些子单元离子种类中的一种或多种引入第二碎裂装置中，该第二碎裂装置在空间上与该第一碎裂装置分开；

在该第二碎裂装置中将这些子单元离子碎裂以产生这些子单元离子的多个第一碎片离子；以及

在质量分析器中对这些第一碎片离子进行质量分析，或使这些第一碎片离子经受一个或多个另外的碎裂步骤以形成另外的碎片离子并且对这些另外的碎片离子进行质量分析。

2.如权利要求1所述的方法，其中这些引入的复合物离子是蛋白质复合物离子，这些单体子单元离子是蛋白质离子并且这些第一碎片种类是肽碎片。

3.如权利要求2所述的方法，其中这些蛋白质复合物离子具有大于0.5MDa的质量。

4.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中该第一碎裂装置包括堆叠环组件。

5.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中这些复合物离子从连续离子流被引入该第一碎裂装置中并且在该第一碎裂装置中被俘获且积累持续至少2ms、优选从2至200ms(毫秒)的时间段，然后将这些子单元离子朝向该第二碎裂装置喷射。

6.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中该第一碎裂装置中的压力是高于约10^-2mbar。

7.如权利要求6所述的方法，其中该第一碎裂装置中的压力是从约10^-2mbar至约10^-1mbar。

8.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中这些复合物离子在该第一碎裂装置中经历在每个元电荷从约100至300V的碰撞能量下的碰撞解离。

9.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中这些子单元离子在该第二碎裂装置中经历在每个元电荷从约100至200V的碰撞能量下的碰撞解离。

10.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中该通过m/z选择一种或多种子单元的步骤通过滤质器进行，该滤质器定位在该空间上分开的第一和第二碎裂装置之间。

11.如权利要求10所述的方法，其中该滤质器是四极滤质器，该四极滤质器在仅RF模式下用叠加的辅助RF波形运行，该辅助波形作为偶极激发被施加在该四极杆的一对相对的电极之间并且该辅助RF波形的频谱典型地由具有最高达十个不同陷波的经调整的噪声组成，对应于在该四极杆质量分析器中的前体子单元离子的久期振荡的频率，并且在该频谱中的每个陷波的宽度是在1kHz至5kHz范围内。

12.如权利要求11所述的方法，其中多种前体离子同时传输穿过使用该RF波形的四极滤质器。

13.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中将这些大分子复合物离子作为连续流引入该第一碎裂装置中，并且其中该俘获时间段是至少2ms；该方法进一步包括：

在该第二碎裂装置中将该积累的多个子单元离子包碎裂以产生这些子单元离子的第一碎片离子；以及

在该质量分析器中对这些第一碎片离子进行质量分析，或使这些第一碎片离子经受一个或多个另外的碎裂步骤以形成另外的碎片离子并且对这些另外的碎片离子进行质量分析。

14.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中该第二碎裂装置是离子阱。

15.如权利要求14所述的方法，其中该第二碎裂装置中的压力是从10^-4mbar至10^-1mbar。

16.如权利要求15所述的方法，其中该第二碎裂装置被分成不同地泵抽的压力区域，包括高于约10^-2mbar(优选在10^-2-10^-1mbar下)的较高压力区域和较低压力区域。

17.如权利要求16所述的方法，其中该较高压力区段定位为比该较低压力区段距该质量分析器更远。

18.如权利要求17所述的方法，其中离子必须穿过该较低压力区段以到达该较高压力区段并且必须返回穿过该较低压力区段以到达该质量分析器。

19.如权利要求18所述的方法，其中这些子单元离子穿过该较低压力区段到该较高区域进行碎裂并且随后地在将碎片离子传递到该质量分析器之前在该较低压力区段的入口附近积累且压缩这些离子。

20.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中该第二碎裂装置的较高压力区域包括堆叠环组件。

21.如权利要求20所述的方法，其中该第二碎裂装置的较低压力区域包括多极杆。

22.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中该质量分析器是静电阱或飞行时间或四极杆质量分析器。

23.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中该方法进一步包括从这些碎片离子的质量分析识别这些复合物离子的单体子单元。

24.一种用于对大分子复合物离子进行质量分析的质谱仪，该质谱仪包括：

离子源，该离子源用于产生大分子复合物离子；

第一碎裂装置，该第一碎裂装置包括堆叠环组件并且用于将这些复合物离子至少碎裂为单体子单元离子，该堆叠环组件用于接收从该离子源产生的大分子复合物离子并且将这些离子俘获持续俘获时间段；

25.如权利要求24所述的质谱仪，其中该堆叠环组件被配置成提供轴向电场和RF电场。

26.如权利要求25所述的质谱仪，其中该堆叠环组件包括多个环形电极，其中相邻的电极是彼此电阻地耦合的，并且提供RF电源用于将两个RF电压波形施加到该多个电极上，从而使得将这些RF波形之一施加到每隔一个的电极上并且将另一个RF波形施加到其余电极上，这两个RF电压波形是彼此180°异相的。

27.如权利要求26所述的质谱仪，其中该堆叠环组件包括四个或至少四个电极。

28.如权利要求26或27所述的质谱仪，其中这些电极被电容地耦合到这些RF波形上。

29.如权利要求26至28中任一项所述的质谱仪，其中这些RF波形具有100V_pp至300V_pp的RF幅值。

30.如权利要求26至29中任一项所述的质谱仪，其中这些RF波形具有约2MHz的RF频率。

31.如权利要求24至30中任一项所述的质谱仪，其中在操作中该第一碎裂装置中的压力是至少10^-2mbar，优选从10^-2mbar至10^-1mbar。

32.如权利要求24至31中任一项所述的质谱仪，其中该第一碎裂装置被配置成为其中的离子提供每个元电荷100至300V、优选200至300V的碰撞能量。

33.如权利要求24至32中任一项所述的质谱仪，其中滤质器位于该空间上分开的第一和第二碎裂装置之间。

34.如权利要求24至33中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置被配置成为其中的离子提供每个元电荷100至200V的碰撞能量。

35.如权利要求24至34中任一项所述的质谱仪，其中在该第二碎裂装置中或在该第二碎裂装置的至少一部分中的压力低于该第一碎裂装置中的压力。

36.如权利要求24至35中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置是离子阱。

37.如权利要求24至36中任一项所述的质谱仪，其中在操作中该第二碎裂装置中的压力是从10^-4mbar至10^-1mbar。

38.如权利要求24至37中任一项所述的质谱仪，其中在操作中该第二碎裂装置的至少一部分中的压力是从10^-4mbar至10^-3mbar。

39.如权利要求38所述的质谱仪，其中在操作中该第二碎裂装置的另一部分中的压力是高于10^-2mbar。

40.如权利要求39所述的质谱仪，其中在操作中该第二碎裂装置的其余部分中的压力是从10^-2mbar至10^-1mbar。

41.如权利要求24至40中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置是离子阱，该离子阱包括两个不同地泵抽的区段，优选地其中较高压力区段定位为比较低压力区段距该质量分析器更远。

42.如权利要求41所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置的较高压力区段被配置成泵抽到高于10^-2mbar的压力。

43.如权利要求42所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置的较高压力区段被配置成在操作中泵抽到10^-2mbar至10^-1mbar的压力。

44.如权利要求41至43中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置的较低压力区段被配置成在操作中泵抽到10^-4mbar至10^-3mbar的压力。

45.如权利要求41至44中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置的较高压力区段包括堆叠环组件。

46.如权利要求45所述的质谱仪，其中该较高压力区段的堆叠环组件包括多个环形电极，其中相邻的电极是彼此电阻地耦合的，并且提供RF电源用于将两个RF电压波形施加到该多个电极上，从而使得将这些RF波形之一施加到每隔一个的电极上并且将另一个RF波形施加到其余电极上，这两个RF电压波形是彼此180°异相的。

47.如权利要求46所述的质谱仪，其中该较高压力区段的堆叠环组件包括四个或至少四个电极。

48.如权利要求46或47所述的质谱仪，其中这些电极被电容地耦合到这些RF波形上。

49.如权利要求46至48中任一项所述的质谱仪，其中这些RF波形具有100V_pp至200V_pp的RF幅值。

50.如权利要求46至49中任一项所述的质谱仪，其中这些RF波形具有约2MHz的RF频率。

51.如权利要求45至50中任一项所述的质谱仪，其中该较高压力区段的堆叠环组件被配置成为其中的离子提供每个元电荷100至200V的碰撞能量。

52.如权利要求41至51中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置的较低压力区段包括RF多极杆，优选具有轴向dc电场。

53.如权利要求52所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置被配置成允许这些子单元离子在该较高压力区段中碎裂并且随后在将这些碎片离子转移到该质量分析器之前在该较低压力区段的入口附近积累这些碎片离子。

54.如权利要求24至53中任一项所述的质谱仪，其中该质量分析器是静电阱或飞行时间质量分析器。

55.如权利要求24至54中任一项所述的质谱仪，其中该谱仪进一步包括在该离子源与该第一碎裂装置之间的离子漏斗安排，具有从该离子源到该离子漏斗安排内的正交离子注入，其中该离子源是电喷射离子源。

56.一种用于对大分子复合物离子进行质量分析的质谱仪，该质谱仪包括：

离子源，该离子源用于产生大分子复合物离子；

第一碎裂装置，该第一碎裂装置包括用于接收从该离子源产生的复合物离子的离子阱，其中该离子阱被配置成泵抽到高于约10^-2mbar的压力，以将这些复合物离子俘获持续至少2ms的时间段并且以提供这些复合物离子的每个元电荷从100至300V的碰撞能量用于将这些复合物离子至少碎裂为单体子单元离子；

任选地在该第一碎裂装置下游的滤质器，该滤质器用于通过m/z选择来自该第一碎裂装置的离子；

57.如权利要求56所述的质谱仪，其中该离子阱被配置成泵抽到从约10^-2mbar至约10^-1mbar的压力。

58.如权利要求56或57所述的质谱仪，其中该离子阱被配置成提供轴向电场和RF电场。

59.如权利要求56至58中任一项所述的质谱仪，其中该第一碎裂装置被配置成为其中的离子提供每个元电荷100至300V的碰撞能量。

60.如权利要求56至59中任一项所述的质谱仪，其中滤质器位于该空间上分开的第一和第二碎裂装置之间。

61.如权利要求56至60中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置被配置成为其中的离子提供每个元电荷100至200V的碰撞能量。

62.如权利要求56至61中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置包括离子阱。

63.如权利要求62所述的质谱仪，其中在操作中该第二碎裂装置中的压力是从约10^-4mbar至10^-1mbar。

64.如权利要求62或63所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置是离子阱，该离子阱包括两个不同地泵抽的区段，其中在操作中该第二碎裂装置的较高压力区段中的压力是高于约10^-2mbar并且其中在操作中该第二碎裂装置的较低压力区段中的压力是从约10^-4mbar至10^-3mbar。

65.如权利要求64所述的质谱仪，其中在操作中该第二碎裂装置的较高压力区段中的压力是从约10^-2mbar至10^-1mbar。

66.如权利要求64或65所述的质谱仪，其中该较高压力区段定位为比该较低压力区段距该质量分析器更远。

67.如权利要求64至66中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置的较高压力区段包括堆叠环组件。

68.如权利要求67所述的质谱仪，其中该较高压力区段的堆叠环组件包括多个环形电极，其中相邻的电极是彼此电阻地耦合的，并且提供RF电源用于将两个RF电压波形施加到该多个电极上，从而使得将这些RF波形之一施加到每隔一个的电极上并且将另一个RF波形施加到其余电极上，这两个RF电压波形是彼此180°异相的。

69.如权利要求68所述的质谱仪，其中这些RF波形具有100V_pp至200V_pp的RF幅值。

70.如权利要求68或69所述的质谱仪，其中这些RF波形具有约2MHz的RF频率。

71.如权利要求67至70中任一项所述的质谱仪，其中该较高压力区段的堆叠环组件被配置成为其中的离子提供每个元电荷100至200V的碰撞能量。

72.如权利要求67至71中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置的较低压力区段包括具有轴向dc电场的RF多极杆。

73.如权利要求64至72中任一项所述的质谱仪，其中该第二碎裂装置被配置成允许这些子单元离子在该较高压力区段中碎裂并且随后在将这些碎片离子转移到该质量分析器之前在该较低压力区段的入口附近积累这些碎片离子。

74.如权利要求56至73中任一项所述的质谱仪，其中该质量分析器是静电阱或飞行时间质量分析器。

75.如权利要求56至74中任一项所述的质谱仪，其中该谱仪进一步包括在该离子源与该第一碎裂装置之间的离子漏斗安排，具有从该离子源到该离子漏斗安排内的正交离子注入，其中该离子源是电喷射离子源。