CN105092843B - 一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。Pt纳米粒子和二氧化锰对双氧水具有双催化的性能。利用二氧化锰和四氧化三铁大的比表面积以及Pt纳米粒子和二氧化锰的双催化作用，将Pt纳米粒子固载在二氧化锰/四氧化三铁的表面作为检测抗体标记物，实现了对胰腺癌标志物CA19-9和<b>CA242</b>的超灵敏检测，对肿瘤标志物的早期诊断及愈后判断具有重要的意义。

Description

一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及本发明涉及一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法及应用。具体是采用Pt-二氧化锰/四氧化三铁作为检测抗体标记物，制备一种检测胰腺癌标志物CA19-9和CA242的生物传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
CAl9-9是一种类粘蛋白的糖蛋白成分，与Lewis血型成分有关。血清内正常值＜37U／mL，是较可靠的胰腺癌标志，79%的胰腺癌升高；而异常升高也可见其它多种肿瘤，少部分良性病变及正常人也可升高。CA242是一种粘蛋白型糖抗原，可作为胰腺癌和结肠癌较好的肿瘤标志物，其灵敏度与CA19-9相仿，其特异性、诊断效率则优于CA19-9。因此，早期诊断与早期治疗非常重要。
纳米材料因其优异的光学、热学、电学、力学以及化学性质，使其在生产、生活及科研中得到了广泛地应用。四氧化三铁具有大的比表面积和好的磁分离能力以及二氧化锰的催化性能好。Pt基催化剂对双氧水具有较好的催化性能，被广泛应用于电池、传感器等领域，Pt纳米粒子和二氧化锰材料结合能够提高材料的催化活性。本发明将Pt-二氧化锰/四氧化三铁材料作为检测抗体标记物，提高生物传感器的灵敏性，本发明构建的传感器具有选择性好、灵敏高、检测限低、操作简单等优点，克服了放射免疫分析法、酶联免疫分析法和试剂盒等方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将该生物传感器成功应用于胰腺癌标志物CA19-9和CA242的检测。
本发明的技术方案
1．一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将6μL、0.5~2mg/mL的氨基化石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）将6μL、5~15μg/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242捕获抗体Ab1滴至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3μL、5~15mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6μL、0.0005~20ng/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将4~6μL检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1h，清洗后，晾干，制得一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器。
2.检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液的制备
（1）四氧化三铁的制备
将2.7g的FeCl3·6H2O溶解在54mL的乙二醇中，振荡制得混合物溶液，加入8.1g醋酸钠和27mL的乙二胺，均匀搅拌30min，置入200?C的高温反应釜内反应8h，冷却至室温，通过外置磁铁磁分离方法得到黑色物质，用超纯水清洗3次，用磁分离方法分离干燥后制得约50nm的四氧化三铁颗粒；
（2）氨基化四氧化三铁/二氧化锰的制备
将四氧化三铁加到100mL、0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中，继续加入60mL、10mmol/L的KMnO4溶液，超声40min，形成棕黑色沉淀物，利用磁分离方法清洗沉淀物三次，干燥制得四氧化三铁/二氧化锰；将该四氧化三铁/二氧化锰加到含1mL3-氨丙基三甲氧基硅烷的80mL无水甲苯中回流4h，制得壳厚度约10-20nm的核壳氨基化四氧化三铁/二氧化锰；
（3）检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁的制备
将氨基化四氧化三铁/二氧化锰分散到10mL水中制得水悬浮液，向溶液中滴加6mL、0.020mol/L的氯铂酸溶液，超声1h，振荡12h，使氯铂酸和氨基化四氧化三铁/二氧化锰完全反应；将混合物用磁分离方法分离得到固体物质；将固体物质加入到6mL、0.1mol/L的硼氢化钠的溶液中反应1h，用磁分离方法分离固体物质并洗涤3次，50?C真空干燥24h，制得检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2
将Pt-二氧化锰/四氧化三铁分散于10mL、0.01mol/L的十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液中，搅拌30min，加入检测抗体Ab2，在4?C反应12h，检测抗体Ab2负载在Pt-二氧化锰/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2，分散于pH为7.4的PBS溶液中，4℃下保存备用。
3．胰腺癌标志物CA19-9或CA242的测定步骤
（1）采用电化学工作站的三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4V，运行时间400s；
（2）在10mL、pH=7.4的PBS溶液中，对0.0005~20ng/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液进行测试，记录电流变化，根据所得电流差值与胰腺癌标志物CA19-9或CA242的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
（1）四氧化三铁具有较大的比表面积、好的磁分离能力以及负载能力，另外，四氧化三铁与二氧化锰大的比表面积能够结合大量的捕获抗体，增加了传感器的灵敏度和稳定性。
（2）Pt基催化剂对双氧水具有较好的催化性能，被广泛应用于传感器领域，Pt纳米粒子和二氧化锰材料的结合能够更加提高材料的催化活性。
（3）本发明制备的电化学免疫传感器用于直肠癌肿瘤标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1
1．一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将6μL、0.5mg/mL的氨基化石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）将6μL、5μg/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242捕获抗体Ab1滴至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3μL、5mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6μL、0.0005~20ng/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将4μL检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1h，清洗后，晾干，制得一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器。
实施例2
1．一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将6μL、1.0mg/mL的氨基化石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）将6μL、10μg/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242捕获抗体Ab1滴至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3μL、10mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6μL、0.0005~20ng/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将5μL检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1h，清洗后，晾干，制得一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器。
实施例3
1．一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将6μL、2mg/mL的氨基化石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）将6μL、15μg/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242捕获抗体Ab1滴至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3μL、15mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6μL、0.0005~20ng/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将6μL检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1h，清洗后，晾干，制得一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器。
实施例4检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液的制备
（1）四氧化三铁的制备
将2.4g的FeCl3·6H2O溶解在54mL的乙二醇中，振荡制得混合物溶液，加入8.1g醋酸钠和27mL的乙二胺，均匀搅拌30min，置入200?C的高温反应釜内反应8h，冷却至室温，通过外置磁铁磁分离方法得到黑色物质，用超纯水清洗3次，用磁分离方法分离干燥后制得约50nm的四氧化三铁颗粒；
（2）氨基化四氧化三铁/二氧化锰的制备
将四氧化三铁加到90mL、0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中，继续加入50mL、10mmol/L的KMnO4溶液，超声40min，形成棕黑色沉淀物，利用磁分离方法清洗沉淀物三次，干燥制得四氧化三铁/二氧化锰；将该四氧化三铁/二氧化锰加到含1mL3-氨丙基三甲氧基硅烷的80mL无水甲苯中回流4h，制得壳厚度约10-20nm的核壳氨基化四氧化三铁/二氧化锰；
（3）检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁的制备
将氨基化四氧化三铁/二氧化锰分散到10mL水中制得水悬浮液，向溶液中滴加5.5mL、0.020mol/L的氯铂酸溶液，超声1h，振荡12h，使氯铂酸和氨基化四氧化三铁/二氧化锰完全反应；将混合物用磁分离方法分离得到固体物质；将固体物质加入到6mL、0.1mol/L的硼氢化钠的溶液中反应1h，用磁分离方法分离固体物质并洗涤3次，50?C真空干燥24h，制得检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2
将Pt-二氧化锰/四氧化三铁分散于9.0mL、0.01mol/L的十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液中，搅拌30min，加入检测抗体Ab2，在4?C反应12h，检测抗体Ab2负载在Pt-二氧化锰/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2，分散于pH为7.4的PBS溶液中，4℃下保存备用。
实施例5检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液的制备
（1）四氧化三铁的制备
将2.7g的FeCl3·6H2O溶解在54mL的乙二醇中，振荡制得混合物溶液，加入8.1g醋酸钠和27mL的乙二胺，均匀搅拌30min，置入200?C的高温反应釜内反应8h，冷却至室温，通过外置磁铁磁分离方法得到黑色物质，用超纯水清洗3次，用磁分离方法分离干燥后制得约50nm的四氧化三铁颗粒；
（2）氨基化四氧化三铁/二氧化锰的制备
将四氧化三铁加到100mL、0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中，继续加入60mL、10mmol/L的KMnO4溶液，超声40min，形成棕黑色沉淀物，利用磁分离方法清洗沉淀物三次，干燥制得四氧化三铁/二氧化锰；将该四氧化三铁/二氧化锰加到含1mL3-氨丙基三甲氧基硅烷的80mL无水甲苯中回流4h，制得壳厚度约10-20nm的核壳氨基化四氧化三铁/二氧化锰；
（3）检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁的制备
将氨基化四氧化三铁/二氧化锰分散到10mL水中制得水悬浮液，向溶液中滴加6.0mL、0.020mol/L的氯铂酸溶液，超声1h，振荡12h，使氯铂酸和氨基化四氧化三铁/二氧化锰完全反应；将混合物用磁分离方法分离得到固体物质；将固体物质加入到6mL、0.1mol/L的硼氢化钠的溶液中反应1h，用磁分离方法分离固体物质并洗涤3次，50?C真空干燥24h，制得检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2
将Pt-二氧化锰/四氧化三铁分散于10mL、0.01mol/L的十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液中，搅拌30min，加入检测抗体Ab2，在4?C反应12h，检测抗体Ab2负载在Pt-二氧化锰/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2，分散于pH为7.4的PBS溶液中，4℃下保存备用。
实施例6检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液的制备
（1）四氧化三铁的制备
将3.0g的FeCl3·6H2O溶解在54mL的乙二醇中，振荡制得混合物溶液，加入8.1g醋酸钠和27mL的乙二胺，均匀搅拌30min，置入200?C的高温反应釜内反应8h，冷却至室温，通过外置磁铁磁分离方法得到黑色物质，用超纯水清洗3次，用磁分离方法分离干燥后制得约50nm的四氧化三铁颗粒；
（2）氨基化四氧化三铁/二氧化锰的制备
将四氧化三铁加到110mL、0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中，继续加入70mL、10mmol/L的KMnO4溶液，超声40min，形成棕黑色沉淀物，利用磁分离方法清洗沉淀物三次，干燥制得四氧化三铁/二氧化锰；将该四氧化三铁/二氧化锰加到含1mL3-氨丙基三甲氧基硅烷的80mL无水甲苯中回流4h，制得壳厚度约10-20nm的核壳氨基化四氧化三铁/二氧化锰；
（3）检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁的制备
将氨基化四氧化三铁/二氧化锰分散到10mL水中制得水悬浮液，向溶液中滴加6.5mL、0.020mol/L的氯铂酸溶液，超声1h，振荡12h，使氯铂酸和氨基化四氧化三铁/二氧化锰完全反应；将混合物用磁分离方法分离得到固体物质；将固体物质加入到6mL、0.1mol/L的硼氢化钠的溶液中反应1h，用磁分离方法分离固体物质并洗涤3次，50?C真空干燥24h，制得检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2
将Pt-二氧化锰/四氧化三铁分散于11mL、0.01mol/L的十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液中，搅拌30min，加入检测抗体Ab2，在4?C反应12h，检测抗体Ab2负载在Pt-二氧化锰/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2，分散于pH为7.4的PBS溶液中，4℃下保存备用。
实施例7胰腺癌标志物CA19-9的测定
（1）采用电化学工作站的三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4V，运行时间400s；
（2）在10mL、pH=7.4的PBS溶液中，对0.0005~20ng/mL的胰腺癌标志物CA19-9标准溶液进行测试，记录电流变化，根据所得电流差值与胰腺癌标志物CA19-9的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替胰腺癌标志物CA19-9标准溶液进行检测，测得线性范围为0.0005~20ng/mL，检测限为0.12pg/mL。
实施例8胰腺癌标志物CA242的测定
按照实施例7的步骤绘制检测CA242的工作曲线，将待测样品溶液代替胰腺癌标志物CA242标准溶液进行检测，测得线性范围为0.00045~20ng/mL，检测限为0.10pg/mL。

Claims (3)

1.一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将6μL、0.5~2mg/mL的氨基化石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）将6μL、5~15μg/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242捕获抗体Ab1滴至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3μL、5~15mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6μL、0.0005~20ng/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将4~6μL检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1h，清洗后，晾干，制得一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器。
2.如权利要求1所述的一种Pt-二氧化锰/四氧化三铁胰腺癌标志物的生物传感器的制备方法，所述检测抗体标记物孵化溶液Pt-二氧化锰/四氧化三铁-Ab2溶液，其特征在于，制备步骤如下：
（1）四氧化三铁的制备
将2.4~3.0g的FeCl3·6H2O溶解在54mL的乙二醇中，振荡制得混合物溶液，加入8.1g醋酸钠和27mL的乙二胺，均匀搅拌30min，置入200?C的高温反应釜内反应8h，冷却至室温，通过外置磁铁磁分离方法得到黑色物质，用超纯水清洗3次，用磁分离方法分离干燥后制得50nm的四氧化三铁颗粒；
（2）氨基化四氧化三铁/二氧化锰的制备
将四氧化三铁加到90~110mL、0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中，继续加入50~70mL、10mmol/L的KMnO4溶液，超声40min，形成棕黑色沉淀物，利用磁分离方法清洗沉淀物三次，干燥制得四氧化三铁/二氧化锰；将该四氧化三铁/二氧化锰加到含1mL3-氨丙基三甲氧基硅烷的80mL无水甲苯中回流4h，制得壳厚度10-20nm的核壳氨基化四氧化三铁/二氧化锰；
（3）检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁的制备
将氨基化四氧化三铁/二氧化锰分散到10mL水中制得水悬浮液，向溶液中滴加5.5~6.5mL、0.020mol/L的氯铂酸溶液，超声1h，振荡12h，使氯铂酸和氨基化四氧化三铁/二氧化锰完全反应；将混合物用磁分离方法分离得到固体物质；将固体物质加入到6mL、0.1mol/L的硼氢化钠的溶液中反应1h，用磁分离方法分离固体物质并洗涤3次，50?C真空干燥24h，制得检测抗体标记物Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2
将Pt-二氧化锰/四氧化三铁分散于9.0~11mL、0.01mol/L的十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液中，搅拌30min，加入检测抗体Ab2，在4?C反应12h，检测抗体Ab2负载在Pt-二氧化锰/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Pt-氨基化二氧化锰/四氧化三铁-Ab2，分散于pH为7.4的PBS溶液中，4℃下保存备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备得到的生物传感器在测定胰腺癌标志物CA19-9或CA242中的应用，步骤如下：
（1）采用电化学工作站的三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4V，运行时间400s；
（2）在10mL、pH=7.4的PBS溶液中，对0.0005~20ng/mL的胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液进行测试，记录电流变化，根据所得电流差值与胰腺癌标志物CA19-9或CA242的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替胰腺癌标志物CA19-9或CA242标准溶液进行检测。
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