CN105092556A - G-sers基底的制备方法及癌细胞检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种G-SERS基底的制备方法及癌细胞检测方法，G-SERS基底的制备方法步骤1：金纳米结构的制备：步骤2：制备石墨烯-金纳米结构基底；步骤3：银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件的制备。癌细胞检测方法，利用表面增强拉曼的原理设计并开发出一种简单、通用、快捷、成本低的方法实现了对癌细胞的检测。尺寸小：该方法制备的微纳结构器件尺寸可以小到微米。测试效率高：利用金属微纳结构对表面拉曼进行增强，增加入射光与物质的作用几率，能够使癌细胞的结构信息更为灵敏的表达出来，提高了检测和诊断的效率。不需要对癌细胞进行预处理和标记：克服了现有技术需要提前对癌细胞进行标记的困难，同时提高了检测诊断的准确性和可靠性。

Description

G-SERS基底的制备方法及癌细胞检测方法

技术领域

本发明涉及集成光学及医学，尤其涉及银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件的制备方法及癌细胞检测方法。

背景技术

癌症是医学上一个重大难题，从癌症的发现到确诊不仅浪费较多的时间而且花费巨额的金钱，这些问题困扰癌症患者和医务工作者多年。开发一种可靠、简单、有效、低成本的手段对癌细胞和正常细胞进行检测和诊断是很有必要的。拉曼光谱利用光学的非弹性散射效应发展而来的技术，经过多年的发展，表面拉曼光学增强得到广泛研究，可以用于生物检测、成像、分子选择等领域。但是，目前研究表明对癌细胞的检测和诊断需要标签物质标记癌细胞，标签物质标记癌细胞在其过程中可能对细胞有所破坏，这不仅提高了其成本，同时也增加了相应的难度。

利用生物荧光蛋白对癌细胞标记，在荧光显微镜下能够实现对癌细胞的观察，但生物荧光蛋白的成本较高且需要对癌细胞的提前预知。这种方式成本高，工艺复杂，需要对细胞的培育导致培育周期长，效率较低。

活性纳米材料导入癌细胞，利用表面增强拉曼光谱鉴别癌细胞的方式提供了一种有效的检测方式(专利公开号CN103487425A)，活性纳米粒子的制备和导入是一种繁琐、高成本的过程，电穿孔导入纳米材料可能对活细胞带来破坏，导致细胞信息的丢失，对细胞的鉴别和检测带来不可控的因素。

随着表面增强拉曼光谱(SurfaceenhancedRamanspectra,SERS)的不断发展，科研工作者开发出越来越多的基底材料。据文献报道，虽然这些基底材料利用不同工作原理增强表面拉曼信息各有优势，但是对癌细胞进行标记是必须经历的处理手段，这使得利用基底对表面拉曼光谱的增强远离了实际应用。

石墨烯是近年来发展较为迅速的新型碳材料，由于其良好的化学稳定性和良好的物理特性已经被广泛的应用于不同领域。石墨烯具有良好的生物相容性，被视为一种优秀的生物结构材料。石墨烯的拉曼特性研究已经较为成熟，根据石墨烯与生物质的化学相互作用可以很好的了解生物质的结构信息，但是石墨烯的拉曼信号较弱，生物灵敏度较低，阻碍了其在生物探测上的应用。由于石墨烯结构特征——单原子层厚度，光作用路径短，利用其特性从而开发出了一种能够有效增强石墨烯拉曼信号的方式——石墨烯表面增强拉曼光谱(GraphenesurfaceenhancedRamanspectra,G-SERS)。这是利用表面结构对光电场局域以及表面等离子波增加光和石墨烯有效作用，从而增强石墨烯拉曼强度提高其灵敏度。虽然表面增强拉曼光谱能够提高石墨烯拉曼信号的灵敏度，但是对单纯生物质/癌细胞的信号的增强有限，也限制了其实际应用。

发明内容

针对现有技术的缺陷，降低癌细胞检测成本，提高检测的可靠度，利用表面增强拉曼的原理设计并开发出一种简单、通用、快捷、成本低的方法实现了对癌细胞的检测。该方法能够有效提高石墨烯表面增强拉曼的信号，由于癌细胞与石墨烯的相互作用使石墨烯拉曼特征峰发生变化，从而实现对癌细胞的检测，利用癌细胞和正常细胞与石墨烯之间相互作用不同所提供了特征峰发生变化，从而实现对癌细胞与正常细胞的诊断。该方法在增强石墨烯拉曼的同时也能增强癌细胞和正常细胞的拉曼信号，癌细胞和正常细胞在该基底上产生不同的拉曼特征峰，该特征峰也为癌细胞的诊断提供有利可靠的证据。

为了解决现有技术中问题，本发明提供了一种G-SERS基底的制备方法，G-SERS基底为银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件，其制备方式如下：

步骤1：金纳米结构的制备：

通过镀膜机电子束蒸镀的方式，超低真空度条件下，将高纯金蒸镀在硅基底上，蒸镀速率0.5-5埃/秒，形成1-10nm厚度的金膜，从而在硅基底上形成不同的金纳米结构；

步骤2：制备石墨烯-金纳米结构基底；

步骤3：银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件的制备：将步骤2中得到的石墨烯-金纳米结构基底置于电子束蒸镀腔中，低真空度条件下，蒸镀速率0.5-5埃/秒，控制时间5-20秒，在石墨烯-金纳米结构基底上蒸镀得到1-10nm厚度的银纳米结构，从而得到银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件。

作为本发明的进一步改进，步骤1中所述超低真空度为低于8e-7torr，步骤3中低真空度为低于5e-7torr。

作为本发明的进一步改进，在硅基底上形成不同的金纳米结构为纳米颗粒和/或纳米条。

作为本发明的进一步改进，步骤2中，制备石墨烯-金纳米结构基底的方法为：将氧化石墨烯溶解在去离子水中形成4-10mg/ml的溶液，将其溶液利用匀胶机甩膜的方式在上述步骤1的基底上形成均匀的氧化石墨烯薄膜，制备成氧化石墨烯-金纳米结构基底，将得到的氧化石墨烯-金纳米结构基底置于高温管式炉中在惰性气体600-1000摄氏度退火处理0.5-2小时，制备成石墨烯-金纳米结构基底。

作为本发明的进一步改进，成膜条件：低速600转/秒，经历45秒；高速2000转/秒，经历12秒。

作为本发明的进一步改进，步骤2中，制备石墨烯-金纳米结构基底的方法为：将化学气相沉积得到石墨烯通过快速转移的方式转移到上述步骤1的基底上得到石墨烯-金纳米结构基底。

一种癌细胞的检测方法，

步骤A：

将肝癌细胞和正常肝细胞各自培养瓶中的培养液倒出，并用滴管滴加0.05-1毫升的胰酶清洗残留的培养液；接着用去离子水清洗3～5次并倒出；再向培养瓶中加入0.05-1毫升胰酶用于将细胞从培养瓶壁解离下来，并用1～500毫升去离子水将其稀释得到肝癌细胞和正常细胞的稀释液；

步骤B：

分别将肝癌细胞和正常肝细胞的稀释液分别滴加在银纳米结构-石墨烯-金纳米结构G-SERS器件和硅基底上，所述G-SERS基底为权利要求1至6任意一种制备方法所得到的G-SERS基底，将其烘干得到样品：肝癌细胞/G-SERS、正常肝细胞/G-SERS、肝癌细胞/Si和正常肝细胞/Si，用于拉曼检测；

步骤C：

采用雷尼绍inVia拉曼光谱仪，采用1800线/毫米光栅，激发波长514.5nm作为入射光照射上述步骤A的样品得到相应的拉曼光谱；正常细胞/Si和肝癌细胞/Si的拉曼光谱没有任何区别；将肝癌细胞/G-SERS通过与G-SERS器件和正常肝细胞/G-SERS的拉曼光谱对比，由于癌细胞的特异性基团与石墨烯化学作用从而使石墨烯拉曼特征峰发生变化：石墨烯的D峰(～1350cm-1)半峰宽变窄，同时G峰(～1580cm-1)半峰宽变宽，2D峰(～2650cm-1)退化，2G峰(～2980cm-1)增强，并发生了峰形状的畸化；同时在～1200cm-1、～1500cm-1、～3100cm-1处出现一个较强的癌细胞特征峰，这些为癌细胞的检测和诊断提供了可靠的依据，而从而实现对癌细胞的检测和鉴别。

本发明的有益效果是：

尺寸小：该方法制备的微纳结构器件尺寸可以小到微米。

测试效率高：利用金属微纳结构对表面拉曼进行增强，增加入射光与物质的作用几率，能够使癌细胞的结构信息更为灵敏的表达出来，提高了检测和诊断的效率。

不需要对癌细胞进行预处理和标记：克服了现有技术需要提前对癌细胞进行标记的困难，同时提高了检测诊断的准确性和可靠性。

附图说明

图1不同金属纳米结构微观图；

图2金属纳米结构在石墨烯表面的微观图；

图3不同结构及材料的反射吸收谱；

图4表面增强石墨烯拉曼光谱；

图5细胞在G-SERS基底上的光学照片；

图6肝癌细胞和正常肝细胞在硅基底上的拉曼光谱；

图7是银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

如图7所示，为银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件，其制备方式如下：

步骤1：金纳米结构的制备。

通过镀膜机(SyskeyTechnology)电子束蒸镀的方式，超低真空度(低于8e-7torr)条件下，将高纯金(99.999％)蒸镀在硅基底(Si，～8mmX10mm)上，蒸镀速率0.5-5埃/秒，形成1-10nm厚度的金膜，从而在硅基底上形成不同的金纳米结构(纳米颗粒，纳米条)。

步骤2：石墨烯-金纳米结构基底的制备。

方法一：将氧化石墨烯溶解在去离子水中形成大约4-10mg/ml的溶液，将其溶液利用匀胶机(KW-4B智能匀胶机)甩膜的方式在上述步骤1的基底上形成均匀的氧化石墨烯薄膜，制备成氧化石墨烯-金纳米结构基底。成膜条件：低速600转/秒，经历45秒；高速2000转/秒，经历12秒。具有梯度转速的成膜条件更有利于形成均匀平整的氧化石墨烯膜。将得到备的氧化石墨烯-金纳米结构基底置于高温管式炉(OTF-1200X-100，合肥科晶材料技术有限公司)中在惰性气体(如高纯氩气，99.999％)600-1000摄氏度退火处理0.5-2小时，制备成石墨烯-金纳米结构基底。

方法二：将化学气相沉积得到石墨烯通过快速转移的方式转移到上述步骤1的基底上得到石墨烯-金纳米结构基底。

步骤3：银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件的制备。

将步骤2中得到的石墨烯-金纳米结构基底置于电子束蒸镀腔中，低真空度(低于5e-7torr)条件下，蒸镀速率0.5-5埃/秒，控制时间5-20秒，在石墨烯-金纳米结构基底上蒸镀得到1-10nm厚度的银纳米结构，从而得到银纳米结构-石墨烯-金纳米结构的石墨烯表面拉曼增强器件(G-SERS)。

癌细胞的检测方法：

步骤A：

将肝癌细胞7402和正常肝细胞L02各自培养瓶中的培养液倒出，并用滴管滴加0.05-1毫升的胰酶清洗残留的培养液；接着用去离子水清洗3～5次并倒出；再向培养瓶中加入0.05-1毫升胰酶用于将细胞从培养瓶壁解离下来，并用1～500毫升去离子水将其稀释得到肝癌细胞和正常细胞的稀释液。

步骤B：

分别将肝癌细胞和正常肝细胞的稀释液分别滴加在银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件(命名为G-SERS)和硅基底上，并用低温吹风机将其烘干得到样品：肝癌细胞/G-SERS、正常肝细胞/G-SERS、肝癌细胞/Si和正常肝细胞/Si，用于拉曼检测。

步骤C：

采用雷尼绍inVia拉曼光谱仪，采用1800线/毫米光栅，激发波长514.5nm作为入射光照射上述步骤(A)的样品得到相应的拉曼光谱。正常细胞/Si和肝癌细胞/Si的拉曼光谱没有任何区别；将肝癌细胞/G-SERS通过与G-SERS器件和正常肝细胞/G-SERS的拉曼光谱对比，由于癌细胞的特异性基团与石墨烯化学作用从而使石墨烯拉曼特征峰发生变化：石墨烯的D峰(～1350cm-1)半峰宽变窄，同时G峰(～1580cm-1)半峰宽变宽，2D峰(～2650cm-1)退化，2G峰(～2980cm-1)增强，并发生了峰形状的畸化；同时在～1200cm-1、～1500cm-1、～3100cm-1处出现一个较强的癌细胞特征峰，这些为癌细胞的检测和诊断提供了可靠的依据，而从而实现对癌细胞的检测和鉴别。这是由于G-SERS器件较强的局域了光电场，增强了光与物质的作用，能够更加灵敏的将癌细胞的结构信息通过表面增强石墨烯拉曼光谱表达出来。

将通过电子束蒸镀等微纳制备技术在目标基底上(如硅，二氧化硅等)制备出金属(如金，银等)纳米结构(纳米颗粒，纳米圆盘，纳米柱，纳米条等)，将石墨烯层置于金属纳米结构上，最后利用微纳制备技术在石墨烯基底上制备出金属(如金，银等)纳米结构(纳米颗粒，纳米圆盘，纳米柱，纳米条等)。其微结构如图所示(附图1和图2)，

该方法制备结构的上、下两层是金属纳米金属层，该结构能有效局域入射光并在其表面产生表面等离子波，这使得该结构对光的吸收增强并产生两个较强的吸收峰(如图3)，这提高了入射光的与表面物质石墨烯的作用。

石墨烯拉曼光谱的获得是采用雷尼绍inVia拉曼光谱仪，激发波长514.5nm,采用1800线/毫米光栅。通过金属纳米结构在石墨烯上下表面的场局域和表面等离子波的作用，对石墨烯的拉曼信号有明显的提高，如图4所示。随着金属结构的加入，石墨烯表面拉曼增强高达～50倍，使其灵敏度也得到进一步提升。

在现有的技术对癌细胞检测和诊断中，都需要利用标签物质对癌细胞进行标记，给检测和鉴别带来困难和不可控的因素。我们利用石墨烯表面增强拉曼光谱，与现有技术有很大的不同，即不需要对癌细胞预处理，能有效的将癌细胞结构信息通过拉曼光谱表达出来，减少对不可控因素以及消除对细胞的损害，增强可靠性，大大降低了检测成本。石墨烯的D峰(～1350cm-1)、G峰(～1580cm-1)以及2D峰(2650cm-1)和2G峰(2980cm-1)由于癌细胞与其相互化学作用，使得特征峰发生变化。

采用肝癌细胞7402和参比正常肝细胞作为实验对象，首先利用胰酶将细胞从样品瓶上解离下来，用纯净水稀释，利用微量注射器将细胞溶液滴涂到G-SERS基底和硅基底上(如图5所示)，并用低温吹风机将其烘干，利用上述拉曼对其进行测试。首先通过对比肝癌细胞和正常细胞在硅基底上的拉曼光谱，如图6所示，没有明显区别，难以判别。通过与G-SERS和正常肝细胞的对比，癌细胞使得石墨烯的D峰半峰宽变窄，同时G峰半峰宽变宽，2D峰退化，2G峰增强，并发生了峰形状的畸化，同时在～3100cm-1处出现一个较强的癌细胞特征峰，这些为癌细胞的检测和诊断提供了可靠的依据。

该方法特有的优势如下：

1、方法简单、有效，克服癌细胞提前预处理和标记的技术困难，减少不必要的不可控因素，增强可靠性。

2、该方法提供的G-SERS基底具有良好普适性，金属微纳结构-石墨烯-金属微纳结构适用于多数器件，金属材料适用范围广，金属层厚度可控(1～1000nm)，结构多样化，石墨烯制备方式简单，可以通过化学气相沉积、氧化还原、机械剥离、外延生长法、液相剥离等手段得到石墨烯。

3、该方法制备出的微纳结构不仅表面增强了石墨烯拉曼光谱，同时将癌细胞的结构信息详细的表达出来，从而区别于正常细胞，能够比较快速且有效对其进行检测和诊断。

4、该方法制备出的器件尺寸小，能够提供更为方便精确快速测量，降低成本，有利于实际应用。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种G-SERS基底的制备方法，其特征在于：G-SERS基底为银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件，其制备方式如下：

步骤1：金纳米结构的制备：

通过镀膜机电子束蒸镀的方式，超低真空度条件下，将高纯金蒸镀在硅基底上，蒸镀速率0.5-5埃/秒，形成1-10nm厚度的金膜，从而在硅基底上形成不同的金纳米结构；

步骤2：制备石墨烯-金纳米结构基底；

步骤3：银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件的制备：将步骤2中得到的石墨烯-金纳米结构基底置于电子束蒸镀腔中，低真空度条件下，蒸镀速率0.5-5埃/秒，控制时间5-20秒，在石墨烯-金纳米结构基底上蒸镀得到1-10nm厚度的银纳米结构，从而得到银纳米结构-石墨烯-金纳米结构器件。

2.根据权利要求1所述的G-SERS基底的制备方法，其特征在于：步骤1中所述超低真空度为低于8e-7torr，步骤3中低真空度为低于5e-7torr。

3.根据权利要求1所述的G-SERS基底的制备方法，其特征在于：在硅基底上形成不同的金纳米结构为纳米颗粒和/或纳米条。

4.根据权利要求1所述的G-SERS基底的制备方法，其特征在于：步骤2中，制备石墨烯-金纳米结构基底的方法为：将氧化石墨烯溶解在去离子水中形成4-10mg/ml的溶液，将其溶液利用匀胶机甩膜的方式在上述步骤1的基底上形成均匀的氧化石墨烯薄膜，制备成氧化石墨烯-金纳米结构基底，将得到的氧化石墨烯-金纳米结构基底置于高温管式炉中在惰性气体600-1000摄氏度退火处理0.5-2小时，制备成石墨烯-金纳米结构基底。

5.根据权利要求4所述的G-SERS基底的制备方法，其特征在于：成膜条件：低速600转/秒，经历45秒；高速2000转/秒，经历12秒。

6.根据权利要求1所述的G-SERS基底的制备方法，其特征在于：步骤2中，制备石墨烯-金纳米结构基底的方法为：将化学气相沉积得到石墨烯通过快速转移的方式转移到上述步骤1的基底上得到石墨烯-金纳米结构基底。

7.一种癌细胞的检测方法，其特征在于：

步骤A：

将肝癌细胞和正常肝细胞各自培养瓶中的培养液倒出，并用滴管滴加0.05-1毫升的胰酶清洗残留的培养液；接着用去离子水清洗3～5次并倒出；再向培养瓶中加入0.05-1毫升胰酶用于将细胞从培养瓶壁解离下来，并用1～500毫升去离子水将其稀释得到肝癌细胞和正常细胞的稀释液；

步骤B：

分别将肝癌细胞和正常肝细胞的稀释液分别滴加在银纳米结构-石墨烯-金纳米结构G-SERS器件和硅基底上，所述G-SERS基底为权利要求1至6任意一种制备方法所得到的G-SERS基底，将其烘干得到样品：肝癌细胞/G-SERS、正常肝细胞/G-SERS、肝癌细胞/Si和正常肝细胞/Si，用于拉曼检测；

步骤C：

采用雷尼绍inVia拉曼光谱仪，采用1800线/毫米光栅，激发波长514.5nm作为入射光照射上述步骤A的样品得到相应的拉曼光谱；正常细胞/Si和肝癌细胞/Si的拉曼光谱没有任何区别；将肝癌细胞/G-SERS通过与G-SERS器件和正常肝细胞/G-SERS的拉曼光谱对比，由于癌细胞的特异性基团与石墨烯化学作用从而使石墨烯拉曼特征峰发生变化：石墨烯的D峰(～1350cm-1)半峰宽变窄，同时G峰(～1580cm-1)半峰宽变宽，2D峰(～2650cm-1)退化，2G峰(～2980cm-1)增强，并发生了峰形状的畸化；同时在～1200cm-1、～1500cm-1、～3100cm-1处出现一个较强的癌细胞特征峰，这些为癌细胞的检测和诊断提供了可靠的依据，而从而实现对癌细胞的检测和鉴别。