CN105087546B - 用于肿瘤等疾病诊断的外泌体液体活检试剂盒 - Google Patents

用于肿瘤等疾病诊断的外泌体液体活检试剂盒 Download PDF

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CN105087546B CN201510508129.8A CN201510508129A CN105087546B CN 105087546 B CN105087546 B CN 105087546B CN 201510508129 A CN201510508129 A CN 201510508129A CN 105087546 B CN105087546 B CN 105087546B
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Abstract

本发明涉及提取RNA的方法、试剂盒以及RNA的应用。该方法包括：S1、将生物样品离心以获得上清液；S2、在上清液中加入外泌体沉淀溶液，在混匀、离心之后获得外泌体沉淀物；S3、在外泌体沉淀物中加入总RNA抽提试剂以及等体积的酒精，剧烈混合之后加入吸附柱；S4、离心吸附柱，且之后加入RNA预洗液、RNA清洗缓冲液以及去离子水反复冲洗并离心以获得总RNA。还涉及从体液的外泌体中提取的融合RNA和其他肿瘤特异性RNA在肿瘤早期诊断、筛查、诊治方面的应用。通过从外泌体中提取融合RNA和其他肿瘤特异性RNA，从而将其用于例如食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤的早期诊断、筛查，从而简单地实现了创伤小，病人依从性好、收集储存方便的癌症液体诊断。

Description

用于肿瘤等疾病诊断的外泌体液体活检试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种从生物样品中提取RNA的方法、试剂盒以及采用该方法提取的RNA的应用。
背景技术
由于血液、唾液等生物样品能够反应整个机体的生理病理状态。以血清唾液为例的液体诊断具有以下优点：1、创伤小，病人依从性好；2、收集方便，利于存储；3、简单方便易操作，成本低廉。因此曾有研究者试图从血清、唾液等生物样品中提取RNA用做肿瘤的早期诊断、筛查及诊治等，但由于RNA在提取过程中容易降解，且直接从生物样品如血清、唾液中等提取难度较大，因此，需要一种能够从生物样品中方便、准确地提取RNA的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种能够从生物样品中方便、准确地提取RNA的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种提取RNA的方法，包括：
S1、将生物样品离心以获得上清液；
S2、在所述上清液中加入外泌体沉淀溶液，在混匀、离心之后获得外泌体沉淀物；
S3、在所述外泌体沉淀物中加入总RNA抽提试剂以及等体积的酒精，剧烈混合之后加入吸附柱；
S4、离心所述吸附柱，且之后加入RNA预洗液、RNA清洗缓冲液以及去离子水反复冲洗并离心以获得总RNA。
在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S2包括：
S21、在所述上清液中加入ExoQuick外泌体沉淀溶液混匀，室温孵育或低温混匀过夜，然后以1000-2000g/分钟的速度离心20-40分钟，以形成外泌体沉淀物；
S22、移除上清液，再次离心剩余混合溶液，以1000-2000g/分钟的速度离心2-10分钟；
S23、移除所有液体，以1000-2000g/分钟的速度离心空转2-10分钟，以获得所述外泌体沉淀物。
在本发明所述的提取RNA的方法中，在所述步骤S2中，所述生物样品和所述ExoQuick外泌体沉淀溶液的体积比为3.5-4.5：1，所述室温孵育时间为10-40分钟。
在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S3进一步包括：
S31、确认所述外泌体沉淀物；
S32、在所述外泌体沉淀物中加入Trizol溶液形成混合溶液；
S33、根据所述混合溶液的体积加入等体积酒精，剧烈混合5-20秒；
S34、将混匀的溶液加入吸附柱中。
在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S31包括：
S311、采用电镜确认所述外泌体沉淀物；
S31a、采用免疫印迹确认所述外泌体沉淀物；或
S31A、采用NanoSight确认所述外泌体沉淀物。
在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S4进一步包括：
S41、将所述吸附柱放入收集管中，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟；
S42、将所述吸附柱放入新的收集管中，加入RNA预洗剂，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液，且重复此步骤1-5次；
S43、在吸附柱中加入RNA清洗缓冲液，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液；
S44、在吸附柱中加入去离子水，以离心机的最大转速旋转1-2分钟以获得所述RNA。
在本发明所述的提取RNA的方法中，所述RNA包括GOLM1-MAK10、ASTN2-PAPPA、FAM18B2-CDRT4、HSP90B1-C12orf73、PTPRO、CoAA、CoAM、β-Actin、GAPDH。
本发明解决其技术问题采用的另一技术方案是，构造一种提取RNA的试剂盒，包括：ExoQuick外泌体沉淀溶液、Trizol溶液、酒精和RNA预洗剂。
本发明还涉及采用本发明的提取RNA的方法所获得的PTPRO在用于乳腺癌诊断和治疗的药物中的应用。
本发明还涉及采用本发明的提取RNA的方法所获得的GOLM1-MAK10在用于食管癌诊断和治疗的药物中的应用。
实施本发明的提取RNA的方法、试剂盒，能够从生物样品中方便、准确地提取RNA，并且通过本发明获得的PTPRO，可以诊断乳腺癌，而通过本发明获得的GOLM1-MAK10，能够诊断食管癌，因此本发明中运用血清、唾液等生物样品提取外泌体，并从中准确的提取RNA，能够对肿瘤进行早期诊断、筛查、治疗等。且本发明提取的RNA可用于基因二代测序，能够实时监测全面了解被检者的基因状态，达到精确检测，精确诊治，并能预测罹患疾病的可能性或指导临床诊治，对患者进行个体化靶向性的治疗。实施本发明提供了一种优化简单的液体诊断方法。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明的提取RNA的方法的优选实施例的流程图；
图2示出了电镜下观察到的外泌体；
图3示出了两例食管癌患者外周血中提取的外泌体特异性标记CD9的免疫印迹，患者编号分别为NO.109、NO.107；
图4示出了不同食管癌以及良性食管疾病或正常患者外周血血清中融合RNA的GOLM1-MAK10的定量分析结果；
图5示出了融合RNAGOLM1-MAK10特异性敏感性示意图；
图6示出了NanoSight分析出的唾液外泌体的大小及浓度；
图7示出了食管癌患者以及正常受试者的唾液中提取的外泌体中融合RNA的GOLM1-MAK10的定量分析结果；
图8示出了放化疗敏感食管癌患者以及放化疗耐受食管癌的唾液中提取的外泌体中PTPRO的PCR结果，其中S代表放化疗敏感的食管癌患者；R代表放化疗耐受的食管癌患者；
图9示出了乳腺癌早期、晚期患者以及正常受试者的唾液中提取的外泌体中PTPRO的PCR分析结果；
图10示出了乳腺癌患者术前术后PTPRO的表达差异；
图11示出了乳腺癌术前PTPRO表达差异与患者预后的关系。
具体实施方式
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，是人类疾病三大主要死亡原因之一，占所有疾病死因的四分之一。
食管癌是消化系统最常见的肿瘤之一，根据世界卫生组织(WHO)报道，2012年全球因为食管癌死亡患者为40万例，位居肿瘤第六位。2014年我国食管癌其死亡率位居我国恶性肿瘤的第四位。早期食管癌的症状不显著，大多数病人发现时或出现临床症状时已经临近中晚期，尽管随着科技医疗技术的发展，食管癌的诊疗水平有所提高，但5年生存率依旧较低。而早期食管癌经手术等治疗后，5年生存率能达到80％以上。故而食管癌的早期诊断显得十分重要，能显著提高食管癌患者的生存预后。目前的细胞和组织病理学检测包括细胞活检因此需要采用穿刺或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害。
根据我们团队的研究表明，融合RNA，这种由不同染色体上各自的RNA在转录水平切割和错读所导致的RNA，在食管癌中普遍存在，其中GOLM1-MAK10、ASTN2-PAPPA、FAM18B2-CDRT4、HSP90B1-C12orf73等在食管鳞癌中显著的高表达，而且有些融合RNA如GOLM1-MAK10可以分泌到细胞外，参与细胞间通信，影响细胞的功能等。大样本数据显示其中GOLM1-MAK10的表达与食管癌患者的淋巴结转移、肿瘤的分化等密切相关，可以作为食管鳞癌的特异性分子标志物。
此外，我们的团队还发现食管癌、乳腺癌中的特异性的基因如PTPRO等与食管癌、乳腺癌患者的放疗敏感性关系密切，且在食管癌常用化疗药物耐药机制中起重要作用，这具有潜在的对病人放化疗敏感性进行分层的价值，从而指导制定个体化的放疗方案，提高食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤的疗效。
由于食管癌、乳腺癌的诊断目前主要以细胞和组织病理学检测为主，包括细胞活检，因此需要采用穿刺或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害，我们还希望可以寻找一种简单方便的无创性的液体诊断。
外泌体是由多种活细胞分泌的，天然存在于体液中，由双层脂质膜所包围的扁平型半球体，其直径约为30-100nm。这种普遍存在于机体内的被膜结构，在30年前被人们所发现，以往普遍认为其仅仅执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。
然而，近期的研究发现外泌体还可以运输核酸，参与细胞间通讯，参与细胞间的物质交换和信息交流，影响细胞的生理状态，并与多种疾病的发生与进程密切相关。目前的研究表明：外泌体在血液、唾液、尿液、腹水、胸水、母乳和汗液、泪液、脑脊液等体液中均具有较高的丰度，且其中含有蛋白质、RNA和脂肪成分。外泌体不仅可以保护细胞分泌的RNA稳定存在，还可以保护细胞合成过程中的中间产物，还能够作为有效的载体将RNA转运到特定的靶细胞中，发挥重要的调控作用。肿瘤细胞分泌的外泌体，可进入淋巴系统和肿瘤组织内的毛细血管，发挥对恶性肿瘤抑制或促进的双重调控作用，且外泌体能与肿瘤抑制因子相互作用，共同参与对肿瘤生长的调控。由于肿瘤细胞分泌的外泌体是调控肿瘤发生发展的重要机制，对肿瘤外泌体进行分析和检测从而可以辅助肿瘤的早期诊断、筛查、疗效评价和预后分析。此外，人体内抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)分泌的外泌体还可以刺激T细胞的体外增殖和诱导体内的抗肿瘤免疫反应。因此外泌体在肿瘤临床中无论是从肿瘤免疫治疗，或是靶向给药、以及肿瘤机制的研究均有重要的开发空间，其在医疗市场具有巨大的商业价值。仅2013年，美国就投入了1700万美元来主要探究exRNA作为潜在的生物标志物和疗法的临床实用性。美国癌症协会专门召开外泌体研究转化的会议。
针对现有技术中的食管癌等恶性肿瘤的早期诊断、筛查、诊治难的困境，本申请人致力于开发非创伤性，不以解剖结构为基础的液体检测方法，将研究目光放在容易获得，临床日常体检就能收集到的血液、唾液等体液。由于血液、唾液等体液能够反应整个机体的生理病理状态，而目前血液运用在疾病的诊断中，仅仅局限于血液中的多种蛋白，脂质、酶等生化指标，且唾液等运用于诊断中也是有限的。但由于RNA在提取过程中容易降解，且直接从体液如血清、唾液中等提取难度较大，这一难题无形之中增加了诊断的难度以及耗费等。
本申请人在经过大量实验和研究的基础上，首次将外泌体与融合RNA及肿瘤特异性RNA创造性的结合起来，构建了一种有效方便准确的液体诊断方法，有效的解决了以上困境及难题。在本发明中，通过从生物样品中提取的外泌体中获取融合RNA，能够从生物样品中方便、准确地提取RNA。
图1是本发明的提取RNA的方法的优选实施例的流程图。如图1所示，在步骤S1中，将生物样品离心以获得上清液。该生物样品可以是血液(例如外周血)、尿液、唾液、胸水、腹水、泪液、汗液以及脑脊液等等。例如，可以选取外周血血清300uL，2000g/分钟离心10min。用移液器将离心所得上清移至新的离心管。在步骤S2中，在所述上清液中加入外泌体沉淀溶液，在混匀、离心之后获得外泌体沉淀物。例如可以在该上清液中加入适量的ExoQuick外泌体沉淀溶液混匀，室温孵育30min或4℃混匀过夜。然后将孵育或者混合后的液体放入离心管中，1000g/分钟离心10min后，将看到外泌体在离心管底部形成白色沉淀。在本发明的其他实施例中，还可以对外泌体白色沉淀物进行二次离心。在步骤S3中，在外泌体白色沉淀物中加入总RNA抽提试剂，然后加入等体积的酒精，剧烈混合之后加入吸附。例如，可以用移液器加入300ul的TRizol溶液。根据溶液体积加入等体积的酒精，剧烈混匀15s，用移液枪转混匀液于吸附柱中。在步骤S4中，离心所述吸附柱，且之后加入RNA预洗液、RNA清洗缓冲液以及去离子水反复冲洗并离心以获得总RNA。例如，在本发明中，可以采用Direct-zolTM RNAMiniPrep kit中的吸附柱，将吸附柱放入收集管中，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，将所述吸附柱放入新的收集管中，加入RNA预洗剂，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液，且重复此步骤1-5次；在吸附柱中加入RNA清洗缓冲液，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液；然后在吸附柱中加入去离子水，以离心机的最大转速旋转1-2分钟以获得所述RNA。
实施本发明的提取RNA的方法，能够从生物样品中方便、准确地提取RNA。
下面通过实施案例一、二、三、四分别以血清、唾液提取外泌体以及融合RNA中的GOLM1-MAK10、从唾液中分析PTPRO，以及从血清中提取外泌体的PTPRO的RNA，对本发明进行进一步地说明。
在本发明中，除特别定义外，浓度单位均为每升溶液的摩尔浓度。本领域技术人员进一步知悉，本发明下述实施例中的各个浓度，摩尔分数，质量分数均可以根据实际进行调整。本领域技术人员可以实现上述调整。
实验一、通过检测外周血血清中外泌体中的融合RNA GOLM1-MAK10的RNA含量，对于食管癌患者进行诊断。
实施步骤1临床标本的收集
采集对象：60例食管癌患者外周血均来自医院的临床病例资料完整的患者。所有患者均未接受放疗或化疗。同期采集10例食管良性病变或正常的患者食管组织和血浆作为对照组。
具体方法如下：分别抽取食管癌患者及食管良性病变或正常患者抗凝外周血2毫升，使用eppendorf Centrifuge 5417R低温台式离心机，2500转/分钟，离心15分钟，收集上层血清，-80℃保存，做好登记。
实施步骤2外泌体提取制备
取食管癌、良性食管疾病外周血血清各250uL，3000g/分钟离心15分钟。用移液器将离心所得上清移至新的离心管，直接加入适量的ExoQuick外泌体沉淀溶液混匀，室温孵育30分钟或4℃混匀过夜，其中的ExoQuick外泌体沉淀溶液与血清比例如下：
孵育时间 样本性质 样本量 ExoQuick量
30分钟 血清 250uL 63uL
将孵育完后的离心管放入离心机中，1500g/分钟离心30分钟后，将看到外泌体在离心管底部形成白色沉淀。用移液器小心吸除上清液，并将含有剩余ExoQuick溶液的离心管再次离心，1500g/分钟离心5分钟。小心移除离心管内所有的液体，注意不要碰到外泌体白色沉淀物。应注意可继续1500g/分钟空转5分钟，使沉淀尽可能析出。将外泌体白色沉淀物用适量1×PBS重悬得到外泌体重悬液。或用300ul TRizol溶液，-70℃保存。即每250uL的血清可获得约20-25uL的外泌体，颗粒数约为6×1011。可用以电镜以及免疫印迹法确认所提取白色沉淀物是否为所需外泌体，然后进行下一步总RNA提取实验，也可以直接进行下一步的总RNA提取实验。
实施步骤3电镜下确认外泌体
将上述所得到的外泌体重悬液取2-3ul稀释10倍后滴20-30ul的于载样铜网上，室温下静置1分钟，用滤纸从侧面吸干液体，直接滴加20mL/L磷钨酸溶液(pH6.8)约30μL于铜网上，室温下负染1分钟.滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约10分钟，透射电镜下观察照相。(外泌体大小为40～100nm)。图2示出了电镜下观察到的外泌体。
实施步骤4免疫印迹确认外泌体
将上述所得到的外泌体重悬液取适量加入300ul～400ul含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上晃动30分钟，再以12000g/分钟离心15分钟，收集上清液，可于-80℃保存待用。将收集的待测蛋白样品用1×PBS稀释12倍，漩涡混匀；将标准品(常用0.025、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5及2μg/μl)和待测样品分别吸取20μL加入到96孔板中，并设置空白对照。将待测蛋白样品加入96孔板中，每孔20uL，每个样品设置三个重复；将蛋白质定量试剂中Reagent A与Reagent B按50:1的比例混和均匀，现用现配，避光保存，将配好的混和液加入到96孔板中，每孔160μL；37℃培养箱孵育30分钟后，遮挡摇匀，并冷却至室温，用酶标仪测量OD570，并根据标准曲线换算样品蛋白浓度。
准备蛋白样品，20ug/孔计算，加上样缓冲液5*loading，105℃煮5分钟，蛋白变性，形成SDS-蛋白复合物，带负电。配制15％分离胶，混匀后，把分离胶加入板中，用1ml的水压线，室温放置40分钟～1小时。弃除水，且用吸水纸吸干，配制5％浓缩胶2mL，灌胶，插梳。加入电泳缓冲液Tris-Gly buffer，液面过加样孔，外部液面过电极或扣板。注意是否出现漏液。点样后，60V，30分钟浓缩蛋白，蛋白压成一条线；当蛋白进入分离胶后，100V，1.5h；
剪取与胶合适大小的NC膜，使用前双蒸水浸泡5分钟，转入4℃预冷的转膜液10～15分钟。剪滤纸，面积小于NC膜，这样两侧滤纸不会接触导致短路。小心打开制胶板，去掉浓缩胶，放入转膜液。SDS-蛋白复合物带负电，从负极(黑色板)依次铺海绵-滤纸(4层)-胶-NC膜-滤纸(4层)，压紧板子。注意一定不要出现气泡。转膜盒内倒入预冷的转膜液，同时放入冰袋，外面冰水复合物。在300mA，1.5h，取出膜并标记蛋白面，并放入封闭液中室温封闭1～2h，摇床轻轻晃动。
加入一抗，浓度如下：CD9(1:1000，SANTA CRUZ)、CD63(1:1000，SANTA CRUZ)、β-action(1:1000，SANTA CRUZ)，4℃孵育过夜。TBST洗脱未结合的一抗，洗三次，每次5分钟，摇床。用封闭液配制红外荧光二抗：1:5000，室温孵育1小时后，TBST洗脱未结合的一抗，洗三次，每次5分钟，摇床。TBS再洗一次，并最后浸泡在TBS中。
HRP-ECL发光法鉴定蛋白CD9表达：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带(5分钟左右)后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2分钟，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。图3示出了两例食管癌患者外周血中提取的外泌体特异性标记CD9的免疫印迹，患者编号分别为NO.109，NO.107(结果如图3所示)。
实施步骤5总RNA提取
首先准备相关实验材料，并将所用材料如枪头，离心管等用DEPC水浸泡。准备好实验用DEPC水，蒸馏水。在上述实施步骤2中最后得到的外泌体白色沉淀中，用移液器加入300ul的TRizol溶液。根据溶液体积加入等体积的酒精，剧烈混匀15S，用移液枪转混匀液于Direct-zolTM RNA MiniPrep kit中的吸附柱中。将吸附柱放入收集管中，12000g/分钟离心1分钟，弃收集管，放入新的收集管中。加入400ul Direct-zolTM RNA Prewash，12000g/分钟离心1分钟，弃收集管中的废液，重复此步骤多次。在吸附柱中加入700ul的RNA清洗缓冲液，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液；加入25ul的无DNase/Rnase水，离心机最大转速1分钟，即得到所提取RNA。而后可以用获得的含有RNA的无DNase/Rnase水反复冲洗1-2次，离心机最大转速1分钟，以得到较高纯度的RNA。经检测，从外泌体重悬液中提取的总RNA，约100-150ng/ul，共计20-25ul。为保证实验的顺利进行，所得量可进行后续实验约10次，故而实验具有可重复性，可以确保实验的准确性。
实施步骤6反转录合成cDNA
使用Invitrogen公司的SuperScript III Reverse Transcriptase试剂盒，以总RNA为模板，反转录合成cDNA，反应步骤如下：
根据各自RNA浓度计算统一的RNA含量(20uL)体系。Invitrigen试剂盒反转录体系(20uL)：照下述比例配成10uL体系加入PCR管中：
RNA XuL(含1ng-5ugRNA)
dNTP 1uL
DEPC水 9-XuL
提前设置水浴锅到65℃，将上述10uL体系的PCR管置于水浴锅中5分钟，后冰浴至少1分钟，完成上述步骤后，加入如下10uL体系：
缓冲液 4uL
DTT 2uL
OligdT 1uL
DEPC水 2uL
配成20uL体系，体系混匀后，将按照上述方式配置的20uL体系的PCR管置于BIO-RAD S1000温度循环变温器(聚合酶链式反应仪)按如下设定步骤进行
37℃ 50分钟
70℃ 15分钟
反应完成后将反应所得的cDNA放置4℃冰箱保存即可
实施步骤7采用引物GOLM1-MAK10上游引物
5'-CAGGGAATGACAGAAACA-3'以及GOLM1-MAK10下游引物5'-TCTTCGGCAGAGTAGTTG-3'，按以下条件进行Real Time PCR反应。按照下述比例配成25uL Real Time PCR反应体系(Invitrigen with ROX)加入PCR管中：
buffer(2*) 12.5uL
F(10uM) 0.25uL
R(10uM) 0.25uL
cDNA 5uL
灭菌超纯水 7uL
Total 25uL
将按照上述方式配置的25uL体系的PCR管置于ABI7300中按如下设定步骤进行：Real Time PCR反应条件为
使用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System进行实时荧光定量PCR检测，其中从步骤2到步骤4持续40个循环。
图4示出食管癌、良性食管疾病外周血血清中GOLM1-MAK10的表达量:食管癌患者较良性食管疾病外周血中运用外泌体所得GOLM1-MAK10的表达量明显要高，且P值有统计学意义。图中**示P值<0.01。图5示出GOLM1-MAK10对诊断食管癌的特异性以及敏感性。
实验二、通过检测唾液中外泌体中的融合RNA GOLM1-MAK10的RNA含量，对于食管癌患者进行诊断。
采用滴取法收集受试者非刺激性全唾液。唾液收集在早晨、空腹、安静房间里进行。嘱咐受试者用清水30ml漱口以清除口腔内残渣，吐尽残留液体，5分钟后使唾液自然流出。收集其非刺激性全唾液于无菌平板培养皿中，而后迅速分装至无菌1.5ml EP管中，立即置-70℃保存待用。以该方法采集食管癌患者30例，同期采集正常人或食管良性病变10例。
取食管鳞癌患者唾液样本约300ul，3000g/分钟离心15分钟，取上清加入适量的ExoQuick外泌体提取溶液，应注意需4℃过夜或稍延长放置时间后，根据实施案例一中所示的步骤将唾液标本中外泌体提取出来，在使用ExoQuick外泌体提取溶液时，应注意吸除上清后，可继续12000转/分空转5分钟后，使沉淀尽可能的析出。
运用NanoSight分析外泌体成分含量(如图6所示)，即每300ul唾液可获得约20-25uL的外泌体，颗粒数约为6X108，在使用Direct-zolTM RNA MiniPrep kit从外泌体中提取RNA时，应注意最后运用无DNase/RNase-Free水冲洗时，可利用冲洗后的所得液体再次冲洗2-3次，以得到更高浓度及纯度的RNA，浓度约100-150ug/ul，反转录成cDNA，然后运用上述所提到的食管癌特异性诊断标志物GOLM1-MAK10，利用RT-PCR进行检测或通过PCR扩增并使用DNA电泳，使用凝胶成像系统将电泳后的胶拍摄成图像，然后进行分析。如图7所示，食管癌患者较良性食管疾病唾液中运用外泌体所得GOLM1-MAK10的表达量明显要高，且P值有统计学意义。图中**示P值<0.01。
实验三、通过检测唾液中的PTPRO的RNA含量，对于食管癌患者进行分层。
采用滴取法收集受试者非刺激性全唾液。唾液收集在早晨、空腹、安静房间里进行。嘱咐受试者用清水30ml漱口以清除口腔内残渣，吐尽残留液体，5分钟后使唾液自然流出。收集其非刺激性全唾液于无菌平板培养皿中，而后迅速分装至无菌1.5ml EP管中，立即置-70℃保存待用。以该方法采集食管癌患者30例。
取食管鳞癌患者唾液样本约300ul，3000g/分钟离心15分钟，取上清加入适量的ExoQuick外泌体提取溶液，应注意需4℃过夜或稍延长放置时间，根据实施案例一中所示的步骤将唾液标本中外泌体提取出来，在使用ExoQuick外泌体提取溶液时，应注意吸除上清液后，可继续12000转/分空转5分钟后，使沉淀尽可能的析出。运用NanoSight分析外泌体成分含量。即每300ul唾液可获得约20-25uL的外泌体，颗粒数约为4-10X108，在使用Direct-zolTM RNA MiniPrep kit从外泌体中提取RNA时，应注意最后运用无DNase/RNase-Free水冲洗时，可利用冲洗后的所得液体再次冲洗2-3次，以得到更高浓度及纯度的RNA，浓度约100-150ug/ul，反转录成cDNA，然后运用食管癌患者特异性分层标志物PTPRO引物进行RT-PCR检测或通过PCR扩增并使用DNA电泳，使用凝胶成像系统将电泳后的胶拍摄成图像，然后进行分析。
图8示出了两例放化疗敏感患者与两例放化疗抵抗患者的PTPRO的PCR结果。通过总的数据分析得出，PTPRO高表达的食管癌患者较PTPRO低表达食管癌患者对放化疗的敏感性更好。
实验四、通过提取乳腺癌外周血中外泌体的PTPRO的RNA，对乳腺癌进行诊疗。
实施步骤1临床标本收集
采集对象：100例乳腺癌患者手术前外周血及手术后外周血均来自医院的临床病例资料完整的患者，均为女性，平均年龄(47±9)岁。其中，早期乳腺癌病人40例，晚期乳腺癌病人60例，所有患者术前均未接受放疗或化疗。同期采集30例正常人的外周血作为对照组。
具体方法如下：分别抽取乳腺癌患者及乳腺良性病变或正常患者抗凝外周血2毫升，使用eppendorf Centrifuge 5417R低温台式离心机，2500转/分钟，离心15分钟，收集上层血清，-80℃保存，做好登记。
实施步骤2外泌体提取制备
取乳腺癌、良性乳腺疾病患者以及正常人外周血约250ul，3000g/分钟离心15min。用移液器将离心所得上清液移至新的离心管，直接加入适量的ExoQuick外泌体沉淀溶液混匀，室温孵育30分钟或4℃混匀2-3小时后静置过夜，其中的ExoQuick外泌体沉淀溶液与外周血比例如下：
孵育时间 样本性质 样本量 ExoQuick量
30min 血清 250uL 60uL
将孵育完后的离心管放入离心机中，1500g/分钟离心30分钟后，可以看到外泌体在离心管底部形成白色沉淀。用移液器小心吸除上清，并将含有剩余ExoQuick溶液的离心管再次离心，1500g/分钟离心5分钟。小心移除离心管内所有的液体，注意不要碰到外泌体白色沉淀物。应注意可继续1500g/分钟空转5分钟，使沉淀尽可能析出。将外泌体白色沉淀物用适量1×PBS重悬得到外泌体重悬液，或用300ul TRizol溶液，-70℃保存。即每300uL的外周血可获得约20-25uL的外泌体，颗粒数约为6X1011，可用以电镜以及免疫印迹法确认所提取白色沉淀物是否为所需外泌体，或者进行下一步总RNA提取实验。
实施步骤3电镜下确认外泌体
将上述所得到的外泌体重悬液取2-3ul稀释10倍后滴20-30ul的于载样铜网上，室温下静置1分钟，用滤纸从侧面吸干液体，直接滴加20mL/L磷钨酸溶液(pH6.8)约30μL于铜网上，室温下负染1分钟.滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约10分钟，透射电镜下观察照相。(外泌体大小为40～100nm)。
实施步骤4免疫印迹确认外泌体
将上述所得到的外泌体重悬液取适量加入300ul～400ul含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上晃动30分钟，再以12000g/分钟离心15分钟，收集上清液，可于-80℃保存待用(Reagent A)。将收集的待测蛋白样品用1×PBS稀释12倍，漩涡混匀；将标准品(常用0.025、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5及2μg/μl)和待测样品分别吸取20μL加入到96孔板中，并设置空白对照。将待测蛋白样品加入96孔板中，每孔20uL(Reagent B)，每个样品设置三个重复；将蛋白质定量试剂Reagent A与Reagent B按50:1的比例混和均匀，现用现配，避光保存。将配好的混和液加入到96孔板中，每孔160μL；37℃培养箱孵育30分钟后，遮挡摇匀，并冷却至室温，用酶标仪测量OD570，并根据标准曲线换算样品蛋白浓度。
准备蛋白样品，20ug/孔计算，加上样缓冲液5*loading，105℃煮5分钟，蛋白变性，形成SDS-蛋白复合物，带负电。配制15％分离胶，混匀后，把分离胶加入板中，用1ml的水压线，室温放置40分钟～1小时。弃除水，且用吸水纸吸干，配制5％浓缩胶2mL，灌胶，插梳。加入电泳缓冲液Tris-Gly buffer，液面过加样孔，外部液面过电极或扣板。注意是否出现漏液。点样后，60V，30分钟浓缩蛋白，蛋白压成一条线；当蛋白进入分离胶后，100V，1.5h；
剪取与胶合适大小的NC膜，使用前双蒸水浸泡5分钟，转入4℃预冷的转膜液10～15分钟。剪滤纸，面积小于NC膜，这样两侧滤纸不会接触导致短路。小心打开制胶板，去掉浓缩胶，放入转膜液。SDS-蛋白复合物带负电，从负极(黑色板)依次铺海绵-滤纸(4层)-胶-NC膜-滤纸(4层)，压紧板子。注意一定不要出现气泡。转膜盒内倒入预冷的转膜液，同时放入冰袋，外面冰水复合物。在300mA，1.5h，取出膜并标记蛋白面，并放入封闭液中室温封闭1～2h，摇床轻轻晃动。
加入一抗，浓度如下：CD9(1:1000，SANTA CRUZ)、CD63(1:1000，SANTA CRUZ)、β-action(1:1000，SANTA CRUZ)，4℃孵育过夜。TBST洗脱未结合的一抗，洗三次，每次5分钟，摇床。用封闭液配制红外荧光二抗：1:5000，室温孵育1小时后，TBST洗脱未结合的一抗，洗三次，每次5分钟，摇床。TBS再洗一次，并最后浸泡在TBS中。
HRP-ECL发光法鉴定蛋白CD9表达：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带(5分钟左右)后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2分钟，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
实施步骤5总RNA提取
准备相关实验材料，并将所用材料如枪头，离心管等用DEPC水浸泡。准备好实验用DEPC水，蒸馏水。在上述实施步骤2中最后得到的外泌体白色沉淀中，用移液器加入300ul的TRizol溶液。根据溶液体积加入等体积的酒精，剧烈混匀15S，用移液枪转混匀液于Direct-zolTM RNA MiniPrep kit中的吸附柱中，将吸附柱放入收集管中，12000g/分钟离心1min，弃收集管，放入新的收集管中。加入400ul Direct-zolTM RNA Prewash，12000g/分钟离心1min，弃收集管中的废液，重复此步骤。在吸附柱中加入700ul的RNA清洗缓冲液，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液；加入25ul的无DNase/RNase水，离心机最大转速1分钟，即得到所提取RNA，后可以用获得的含有RNA的无DNase/RNase水反复冲洗1-2次，离心机最大转速1分钟，以得到较高纯度的RNA。检测从外泌体重悬液中提取的总RNA，约100-150ng/ul，共计20-25ul，为保证实验的顺利进行，所得量可进行后续实验约10次，故而实验具有可重复性，可以确保实验的准确性。
实施步骤6反转录合成cDNA
使用Invitrogen公司的SuperScript III Reverse Transcriptase试剂盒，以总RNA为模板，反转录合成cDNA，反应步骤如下：
根据各自RNA浓度计算统一的RNA含量(20uL)体系。Invitrigen试剂盒反转录体系(20uL)：照下述比例配成10uL体系加入PCR管中：
RNA XuL(含1ng-5ugRNA)
dNTP 1uL
DEPC水 9-XuL
提前设置水浴锅到65℃，将上述10uL体系的PCR管置于水浴锅中5min，后冰浴至少1分钟，完成上述步骤后，加入如下10uL体系：
配成20uL体系，体系混匀后，将按照上述方式配置的20uL体系的PCR管置于BIO-RAD S1000温度循环变温器(聚合酶链式反应仪)按如下设定步骤进行
37℃ 50分钟
70℃ 15分钟
反应完成后将反应所得的cDNA放置4℃冰箱保存即可
实施步骤7PTPRO上游引物5'-CAGGCGACATCTATAACC-3'和PTPRO下游引物5'-CCTAAGAATAATGAGGGTAA-3'，按以下条件进行Real Time PCR反应。
按照下述比例配成25uL Real Time PCR反应体系(Invitrigen with ROX)加入PCR管中：
buffer(2*) 12.5uL
F(10uM) 0.25uL
R(10uM) 0.25uL
cDNA 5uL
灭菌超纯水 7uL
Total 25uL
将按照上述方式配置的25uL体系的PCR管置于ABI7300中按如下设定步骤进行：Real Time PCR反应条件为
使用Applied Biosystems 7500Real Time PCR System进行实时荧光定量PCR检测，其中从步骤2到步骤4持续40个循环。本步骤本领域技术人员应注意，本专利中涉及的定量PCR等适用于各种DNA的定量。本领域技术人员在不脱离本专利的范围内可进行调整，如引物的改变、时间温度的设定等。
实施步骤8外泌体内提取检测的PTPRO与乳腺癌的早期诊断的关系。
通过对100例乳腺癌患者手术前外周血，根据乳腺癌分期进行分组，以及以同期采集30例正常人的外周血为对照组，进行提取外周血中外泌体PTPRO的RNA提取以及检测，运用统计学分析得出PTPRO可以运用于乳腺癌的早期诊断，如图9所示。
实施步骤9外泌体内提取检测的PTPRO与乳腺癌的术前术后的关系。
通过对100例乳腺癌患者手术前外周血以及手术后外周血中外泌体PTPRO的RNA提取以及检测，运用统计学分析得出如图10及图11的结果，说明PTPRO可以运用于乳腺癌的术前术后疗效的判定以及术前PTPRO表达高低可以预测病人的预后。
虽然本发明是通过具体实施案例唾液、血清中提取外泌体检测GOLM1-MAK10和PTPRO进行说明的，本领域技术人员应当明白，在不脱离本发明范围的情况下，还可以对本发明进行各种变换及等同替代。因此，本发明不局限于所公开的具体实施案例，而应当包括落入本发明权利要求范围内的全部实施方式。

Claims (6)

1.一种提取外泌体RNA的方法，其特征在于，包括：
S1、将唾液样品离心以获得上清液；
S2、在所述上清液中加入外泌体沉淀溶液，在混匀、离心之后获得外泌体沉淀物；
S3、在所述外泌体沉淀物中加入总RNA抽提试剂以及等体积的无水乙醇，剧烈混合之后加入吸附柱；
S4、离心所述吸附柱，且之后加入RNA预洗液、RNA清洗缓冲液以及去离子水反复冲洗并离心以获得总RNA；
所述步骤S3进一步包括：
S31、确认所述外泌体沉淀物；
S32、在所述外泌体沉淀物中加入Trizol溶液形成混合溶液；
S33、根据所述混合溶液的体积加入等体积酒精，剧烈混合5-20秒；
S34、将混匀的溶液加入吸附柱中；
所述步骤S2进一步包括：
S21、在所述上清液中加入ExoQuick外泌体沉淀溶液混匀，室温孵育或低温混匀过夜，然后以1000-2000g/分钟的速度离心20-40分钟，以形成外泌体沉淀物；
S22、移除上清液，再次离心剩余混合溶液，以1000-2000g/分钟的速度离心2-10分钟；
S23、移除所有液体，以1000-2000g/分钟的速度离心空转2-10分钟，以获得所述外泌体沉淀物。
2.根据权利要求1所述的提取外泌体RNA的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述唾液样品和所述ExoQuick外泌体沉淀溶液的体积比为3.5-4.5：1，所述室温孵育时间为10-40分钟。
3.根据权利要求1所述的提取外泌体RNA的方法，其特征在于，所述步骤S31包括：
S311、采用电镜确认所述外泌体沉淀物；
S31a、采用免疫印迹确认所述外泌体沉淀物；或
S31A、采用NanoSight确认所述外泌体沉淀物。
4.根据权利要求1所述的提取外泌体RNA的方法，其特征在于，所述步骤S4进一步包括：
S41、将所述吸附柱放入收集管中，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟；
S42、将所述吸附柱放入新的收集管中，加入RNA预洗剂，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液，且重复此步骤1-5次；
S43、在所述吸附柱中加入RNA清洗缓冲液，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液；
S44、在吸附柱中加入去离子水，以离心机的最大转速旋转1-2分钟以获得所述RNA。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的提取外泌体RNA的方法，其特征在于，所述RNA包括GOLM1-MAK10、ASTN2-PAPPA、FAM18B2-CDRT4、HSP90B1-C12orf73、PTPRO、CoAA、CoAM、β-Actin、GAPDH。
6.一种提取外泌体RNA的试剂盒，其特征在于，包括：ExoQuick外泌体沉淀溶液、Trizol溶液、无水乙醇、RNA预洗剂以及RNA清洗缓冲液。
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