CN105075857A - 一种无刺黑莓杂交种质培育及分子辅助鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物杂交育种领域，涉及一种无刺黑莓杂交种质培育及分子辅助鉴定方法，包括去雄套袋、花粉采集、人工辅助授粉、授粉后管理、果实采收、种子收获及贮藏、种子沙藏与播种、播后田间管理、优株分子标记鉴定、优株抚育与评价筛选等步骤。本发明利用无刺与有刺黑莓品种间杂交，对获得的杂交种子进行播种、苗木培育及分子标记辅助鉴定，获得了兼具双亲优良特征的无刺杂交新品种。该方法得到的杂交后代背景真实清楚，为培育不同类型适于生产的黑莓新品种提供一种有效的杂交方法。利用分子标记辅助优质无刺黑莓杂交新种质鉴定的育种方法的建立，对于培育我国自主知识产权的黑莓新品种具有重要意义。

Description

一种无刺黑莓杂交种质培育及分子辅助鉴定方法

技术领域

本发明属于植物杂交育种技术领域，具体涉及黑莓品种间杂交育种及其分子标记辅助鉴定方法。

背景技术

黑莓（Blackberry）为蔷薇科悬钩子属（RubusL.）的一种特色浆果类果树，其果实富含维生素E、花色苷和酚类物质，成为极具发展潜力的特种经济林树种。我国含有以黑莓和树莓为代表的丰富的悬钩子属植物资源，但由于对其果实研究起步较晚，致使适于生产的新品种极少。

国内目前黑莓主要栽培品种基本上引自欧美国家，这些品种大多通过杂交手段育种得到，一些性状优良品种引进国内后存在有刺不便人工管理、果熟期遭遇高温多雨天气致使果实品质差、产量低等问题。目前国外对适于生产的优良新品种的产权保护尤为重视，国内已很难引进理想的品种类型，培育具有自主知识产权的黑莓新品种迫在眉睫。国内黑莓育种工作近几年才逐渐得到重视，但由于悬钩子植物遗传背景较为复杂及不同倍性种质的亲和性较低致使普通常规育种工作进展较慢，建立一套高效的杂交育种方法、对引进黑莓品种进行种质改良显得尤为必要。SSR（SimpleSequenceRepeats）又称简单序列重复，是20世纪80年代发展起来的一种新型DNA标记，具有可靠性强、重复性好、多态性丰富、呈共显性等优点，在不同树种上被广泛用于优株辅助选择、亲本确认、资源比较鉴定及品种鉴定等。在江苏现有表现较好的黑莓引进品种中，Kiowa品种具有生长量最大、单果最重和产量最高的特性，唯一缺点是枝蔓有刺，Hull品种高产果优但果实较小，因此通过相同倍性的品种间杂交，有望选育出生长量大、单果重高、产量高的优质无刺黑莓杂交新品种。

黑莓为自交授粉结实类型，当雄蕊外露散粉时已完成授粉过程。要进行杂交配制，掌握合适的开花授粉时间非常必要。根据申请人多年开展黑莓杂交育种工作发现，花瓣从萼片中外露后2天即可完全完成授粉。因此，在看到花瓣外露后花药并不散粉，此时进行去雄即可避免自交授粉。基于此，申请人总结出一套有效的杂交育种及其杂交优株SSR标记辅助鉴定技术，该体系的建立对于培育具有自主知识产权的黑莓新品种和促进我国黑莓产业的持续发展具有重要意义。

发明内容

1、本发明的目的在于提供一种无刺黑莓杂交种质培育及分子辅助鉴定方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：在4月下旬以后黑莓品种花苞初始显露花瓣期间，在晴天上午8:00~10:00点剥开即将开放的花蕾去除雄蕊后套袋。下午3:00~5:00点取即将开放的花蕾，带回室内用双面刀片将花药轻轻剥离花丝，置于防水透气的硫酸纸上常温干燥2d以充分散粉，之后将花药和花粉收集于密封干燥瓶中。2~3d后，将套袋花序解开，待雌蕊柱头呈青绿色且有亮光光泽时，将已经散出粉的花粉用毛笔尖轻轻刷到柱头上使其充分授粉，操作完成后继续套袋。套袋1个月左右后，检查果实成熟情况，适时采集果实防止掉落。收获后将果实用果胶酶浸泡，洗出种子，在晴天通风处阴干后冷藏，于12月初低温沙藏。于第2年3月初整地播种，加强墒情查看和除草管理，获得黑莓品种间杂交后代幼苗。第3年2~3月将杂交后代幼苗及其亲本一同移栽和定植，冬季营养生长停止时调查比较生长量和病虫害抗性情况。第4年2月开始，密切观察杂交幼苗物候期、开花情况和结实情况，果实收获后测定营养成分，初步优选出优点突出的杂交优株，同时利用SSR分子标记将杂交优株进行真实性鉴定，确定亲本来源。第5年开始连续3年将第3年同步扩繁的优株进行区域试验和生产试验评价，获得适应性强的性状优于双亲的杂交黑莓新品种（系）。

由于目前未见无刺黑莓杂交育种种质培育研究的报道，本发明首次对黑莓的杂交育种技术进行了探索，发明了一种适于无刺黑莓新种质创制的新技术。

附图说明

1、图1：黑莓无刺杂交新品系‘6-6-3’无刺结果穗枝条与其有刺亲本‘Kiowa’比较；

2、图2：黑莓无刺杂交新品系‘6-6-3’及其双亲亲本果实特征；

3、图3：亲本多态性引物鉴定无刺黑莓杂交品系‘6-6-3’亲本来源；

P4-P61为12对有多态的引物，3个甬道为同一组，分别扩增的是母本‘Kiowa’、父本‘Hull’和‘6-6-3’的基因组DNA。M，50bpDNAladder。

具体实施方式

实施例1.无刺黑莓杂交种质培育及分子辅助鉴定方法

1、黑莓品种间杂交组合配制

1）去雄套袋

黑莓Kiowa品种于2005年引入江苏，在引进品种中植株整体表现出生长势强、产量高、果实大（是目前果实最大的黑莓品种）等优势，唯一不足之处是枝蔓具刺，极不利于田间管理。2006年5月Kiowa品种开花期间，在晴天上午8:00~10:00点选择花瓣初始显露且紧密闭合的花蕾，用镊子剥开花瓣和萼片，仔细、彻底地去除所有紧密环绕柱头的花药（雄蕊），确认无花药残留后一并去除周围花蕾，立即套上防水透气的硫酸纸纸袋，用别针固定防止枝条弯曲和受损，完成去雄套袋工作。

2）花粉采集

黑莓Hull品种为1988年引入我国，植株表现出生长势强、枝条无刺且产量高，果实表现出硬度高和甜度高，唯一不足为单个果实偏小。2006年5月Hull品种开花期间的下午3:00~5:00点，采集其花瓣即将展开的花蕾带回室内，用镊子固定后，用双面刀片将花药轻轻剥离花丝，将花药收集到铺一层防水透气硫酸纸的培养皿中，常温放置干燥2d，待充分散粉后收集于密封干燥的瓶中备用。

3）杂交配制

去雄完成后2d，在上午9:00~10:00点解开硫酸纸纸袋，发现柱头有亮绿光泽时，迅速用毛笔蘸取密封瓶中的花药在柱头上均匀涂抹，结束后立即套袋和固定，在杂交袋上注明杂交组合名称。共完成100朵花的杂交授粉。

4）果实采收与种子处理

黑莓果实果熟期一般历经1个月左右。在果实完全成熟前一周，撕开硫酸纸一角，给与果实充分透气和光照，并注意病虫害防治。在母本Kiowa果实成熟期间，采收完全成熟的杂交果实。将每次采下的果实进行冷冻贮藏，直至所有套袋的果实采收结束，共获得杂交果实86个。果实采收全部结束后，将其置于少量果胶酶中浸泡2h，用力搓洗去除果皮果肉，流水冲洗洗出种子，在晴天通风处阴干数日后冷藏于4^oC，共获得4088粒杂交种子。

2、杂交种子播种及无刺杂交单株抚育

1）种子沙藏

将充分干燥密闭保存的杂交种子于2006年12月初从4^oC冰箱中取出，平铺在敞口烧杯底部，根据前期研究结果，将98%浓硫酸沿玻壁缓缓倒入，将杂交种子用98%浓硫酸处理20min，期间不停搅拌使热量充分扩散，用流水将浓硫酸冲洗5min，之后贮藏于湿润细沙中，细沙和种子比例为8~10:1，湿沙严格控制水分过多，以握紧松开后沙团松散为宜，结束后装在自封袋中保存于4^oC冷藏箱中，冷藏3个月。

2）种子播种

2007年3月初，将年前下基肥的地块进行起垄和平整，将沙藏的杂交种子连细沙一起直接播种在苗圃地，播种深度为1cm左右，播种后用泥炭土：原土=1:1的土层覆盖。完成后搭园艺支架，用塑料薄膜覆盖保湿保温。

3）田间管理与出苗调查

播种后及时查看墒情和除草，观察出苗情况，出苗后及时记载出苗日期。该杂交组合共获得杂交苗168株。调查杂交苗有刺情况，将其中25株无刺单株精心抚育和加强肥水管理。

3、杂交优株抚育与新品系筛选

经过1年田间抚育，2008年3月初将无刺杂交苗定植于育种选育圃，加强田间肥水管理。于2008年底调查生长性状和病虫害抗性情况，2009年进行物候期、结果性状和营养品质评价后，筛选出1株兼具双亲优良特征的优株‘6-6-3’，主要表现为无刺和适应性强，单果穗（图1）及果实品质性状优于双亲，果实大小（图2）、单果重及单株产量优于父本Hull品种（大面积推广品种）。2008年采用压条和组培方式进行同步快速繁殖，获得无性系200余株。

4、分子标记辅助杂交优株鉴别及亲本确定

取黑莓新品系‘6-6-3’及其母本和父本幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因组DNA。PCR扩增采用10μL反应体系，包括1μLbuffer,0.2μL2.5mmol/LdNTPs,2μL5pmol/μL引物，0.1μL5U/μLTaq酶，1μLDNA模板，ddH₂O5.7μL。PCR反应程序为，94^oC预变性5min，94^oC变性30s，45^oC退火30s，72^oC延伸30s，35个循环后72^oC延伸10min。PCR反应在MultiGeneThermalCycler（TC9600-G-230V）PCR扩增仪（Labnet，美国）上进行。反应产物经6×Loadingbuffer终止反应后备用。反应产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=19：1）电泳分离1h后，经0.2%硝酸银快速染色，观察、拍照。

首先利用悬钩子上已公布的78对引物对品系的亲本进行多态性筛选，分别找出亲本间的多态性引物。78对引物在双亲亲本中有73对可扩出清晰条带，其中有12对在母本和父本间具有多态，将12对在亲本中具有多态的引物再次与杂交优株再次进行同时扩增验证。

12对多态引物（比例15.38%）对母本‘Kiowa’、父本‘Hull’及优良株系‘6-6-3’的扩增结果显示（图3），P4（Rubus6a）、P15（Rubus45c）、P21（Rubusr76b）、P60（Rubus275a）等引物的扩增条带与父本相同，P5（Rubus12a）、P31（Rubus123a）、P39（Rubus166b）、P40（Rubus167a）、P48（Rubus251a）、P50（Rubus253a）、P59（Rubus270a）、P61（Rubus277a）等显示为双亲的杂合类型，确定品系‘6-6-3’在大多遗传位点上表现为与父本相同或为父母本的杂合类型。

5、杂交优株区域试验和生产试验

于2010年分别在本所黑莓育种圃和溧水黑莓种植基地定植同时进行区域试验和生产试验。2010~2013年期间，以两个亲本品种及生产主栽品种‘Chester’为对照，开展了连续3年品比试验，进行了生长量、适应性、物候期、果实大小与品质、产量等性状指标的调查与分析。三年的评价结果表明，‘6-6-3’部分性状明显优于亲本，部分性状结合了双亲的优点，于2014年已成功通过江苏省林木品种审定委员会良种认定，命名为‘宁植4号’。

Claims (6)

1.一种无刺黑莓杂交种质培育及分子辅助鉴定方法，其特征在于根据其开花习性，建立了一套黑莓无刺种质杂交育种方法，包括以下5个步骤：（1）黑莓品种间杂交组合配制；（2）杂交种子播种及无刺杂交单株抚育；（3）杂交优株抚育与新品系筛选；（4）分子标记辅助杂交优株鉴别及亲本确定；（5）新品系区域试验和生产试验。

2.根据权利要求1所述的黑莓品种间杂交组合配制，其特征在于将母本去雄时选择花瓣初始显露且紧密闭合的花蕾，采集父本花粉时选择花瓣即将展开而未展开的花蕾，去雄2~3d后待母本柱头发育为有光泽的亮绿色和父本花药充分散粉时完成授粉。

3.根据权利要求1所述的杂交种子播种及无刺杂交单株抚育，其特征在于用以浓硫酸处理和沙藏的种子需保证充分干燥，以防止在浓硫酸处理时遇过量水份导致释放大量热量烧伤种子，用于沙藏的沙子水分不宜过多以防止种子霉变；种子播种于田间后，务必常检查土壤墒情防止土壤干旱板结导致种子死亡和过湿导致种子霉变。

4.根据权利要求1所述的杂交优株抚育与新品系筛选，其特征在于在无刺杂交苗定植于育种圃后，在其停止生长调查完生长性状后即开始对初筛潜力优株进行扦插或组培扩繁育苗，为后续区域和生产试验节约时间。

5.根据权利要求1所述的分子标记辅助杂交优株鉴别及亲本确定，其特征在于先利用可以鉴别杂交优株为杂合子的SSR标记找到亲本间有多态的多态引物，之后再次与杂交优株同时扩增显示杂交优株的带型。

6.根据权利要求1所述新品系区域试验和生产试验，其特征在于将无刺新品系与亲本品种、生产主栽品种同时进行不同区域试验点和不同年份的特征评价，总结新品系优良性状，进行品种审（认）定。