CN105067823A - 一种载脂蛋白e免疫比浊法检测试剂盒 - Google Patents

一种载脂蛋白e免疫比浊法检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，属于临床体外检测试剂技术领域。本发明试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品。通过在试剂R1中加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒和在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Kathon-CG，有效的提高了试剂盒的稳定性和分析灵敏度，其线性范围也较好，试剂的准确度高，有利于在市场中进一步的推广使用。

Description

一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒
技术领域
本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒。
背景技术
载脂蛋白E是一种富含精氨酸的碱性蛋白，人ApoE是由299个氨基酸残基组成，分子量为34145D，含32个Arg和12个Lys存在于血浆的CM、VLDL及其残粒和β-VLDL中均含有ApoE，一部分ApoE在血液中与ApoAⅡ形成复合体。
Shore于1973年首先发现ApoE，Rall等于1982年测出ApoE的蛋白质一级结构，其后Taylor建立ApoE的cDNA序列，Breslow和Zannis首先测出ApoE有3个等位基因异构体以及基因在染色体上的定位。据推算和测定，在介质中ApoE有62%的α-螺旋，9%的β-片层，11%的β-转角和18%无规则线团。ApoE分子可以被凝血酶水解为二个区域，N-端区(1~191)为22kD的可溶性球蛋白，此区域较稳定，该片段的136~158位肽段为受体结合位点，富含碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，也属于肝素结合区。此片段为一个反平行的四螺旋束，是α-螺旋蛋白的一般折叠方式。C端区(216~299)分子量为10kD，螺旋程度很高，不稳定，是与脂蛋白的结合区。用截去了末端的变异体及合成多肽片段进行ApoE羧基末端的检测表明，191残基以外羧基端存在三个螺旋，其中两个为A型(203~223和225~266)，第三个(268~289)为一种G型螺旋。与脂类或不同的脂质微粒或二甲基磷脂酰胆碱结合的结果说明，G螺旋和第二螺旋的末端在脂质连结，在ApoE的四聚体化过程中起重要的作用。更精确地说是263~286片段可能在脂连结ApoE与VLDL的结合中起有关键作用。ApoE主要由肝脏合成，近年来发现脑、肾、骨骼、肾上腺及巨噬细胞也能合成。
ApoE生理功能有:①是LDL受体的配体，也是肝细胞CM残粒受体的配体，它与脂蛋白代谢有密切相关性;②ApoE具有多态性，多态性是决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关;③参与激活水解脂肪的酶类，参与免疫调节及神经组织的再生。
人类ApoE主要在肝脏和脑组织合成，在其他组织包括单核细胞(含巨噬细胞)也有合成能力。人的肾上腺、卵巢颗粒细胞也能合成ApoE。脑中ApoE的mRNA表达总量是肝脏的1/3，星形细胞是其主要合成部位。脑中生成的ApoE的作用可能是使细胞内的脂类重新分配而保持脑环境中的胆固醇平衡。脑肿瘤中发现有高浓度的ApoE，推断它可能作为神经胶质细胞瘤的标记。
目前，实验室常用的APOE测定方法有IEF电泳分析、双向PAGE或结合免疫印迹法。IEF电泳分析法需要血清量较多，昂贵、费时，又需要大型设备，不适合大规模研究。免疫印迹法利用抗原-抗体的特异反应，排除了血清其他蛋白质的干扰，不需超速离心分离VLDL，血清用量少，是国内外实验室检测ApoE表型常用的方法之一。但此类方法亦存在一些缺点，如对于存在与普遍异构体具有相同电荷的罕见异构体标本，或在糖尿病等病理状态时，由于转录后修饰引起蛋白质变化的标本检测时，就会给出错误的结果。双向PAGE技术能解决IEF遇到的一些转录后修饰的问题，临床标本用量也很少，并且可以同时进行定性和定量分析，但由于成本昂贵而且费时，有时也难以清晰地分辨表型，故临床上应用较少。
载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒基于APOE特异地与抗血清反应形成不溶性的复合物，引起浊度增加，在340nm波长处检测其浊度变化，其变化程度与样本中的APOE含量成正比。该方法是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂稳定性不好，灵敏度也不高，因而限制了其在临床上的推广应用。
发明内容
针对于现有技术存在的问题，本发明提供了一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性比常规的检测试剂盒要好，分析灵敏度高，有利于试剂在临床上的推广应用。
本发明是通过以下措施实现的：
一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1组成为：100mmol/LpH8.0磷酸缓冲液、0.1%叠氮钠、0.1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒；试剂R2组成为：100mmol/LpH8.0磷酸缓冲液、30ml/L羊抗人APOE抗体、20-40g/L牛血清白蛋白、0.05%Kathon-CG。
所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为Fe3O4/SiO2复合纳米粒子，粒径为20-50nm。
所述试剂R1和试剂R2在使用时的比例为R1：R2=180：60。
本发明所使用的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒是采用以下方法制备的：
采用多元醇法制备Fe3O4纳米粒子，取一定的乙酰丙酮铁和三甘醇加入到回流加热反应装置中，在磁力搅拌和Ar气保护的条件下，将装置缓慢加热至沸腾，并保持回流一段时间。冷却后向反应溶液中加入乙酸乙酯使生成的四氧化三铁纳米粒子产生絮凝，磁性分离黑色产物，清洗数次，分散到乙醇中，即得到稳定的Fe3O4纳米粒子乙醇胶体溶液。之后将所得Fe3O4纳米粒子采用Stober水解法制得SiO2包覆的Fe3O4纳米粒子。所得Fe3O4/SiO2复合纳米粒子的粒径为20-50nm。
本发明所使用的校准品为久峰润达生物技术有限公司生产的APOE校准品。
本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪上进行，其具体使用方法如附图4。
加入生理盐水、样本或校准品3μl，之后再加入R1试剂180μl预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入60μl的试剂R2反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。
本发明的有益效果：
本发明提供的载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，通过在试剂R1中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒，该磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人APOE抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，大大的提高了试剂的分析灵敏度。同时在试剂R2中加入牛血清白蛋白，解决了抗体在稀溶液中不稳定这一难题，在试验中它能使抗体稳定，且相对地中性，但不会影响抗体的性质，而Kathon-CG是一种新型高效环保型广谱杀菌剂、防腐剂，在该试剂盒中使用Kathon-CG有效解决了BSA长时间保存易发霉的缺点，因此BSA与Kathon-CG共同作用有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。
附图说明
图1实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；
图2实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；
图3实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性。
图4本发明在具有双试剂功能的自动生化分析仪上的使用方法。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步详细说明。
实施例1
一种常规的载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中试剂R1组成为：
pH8.0磷酸缓冲液100mmol/L
叠氮钠0.1%
试剂R2组成为：
pH8.0磷酸缓冲液100mmol/L
羊抗人APOE抗体30ml/L
本实施例描述的试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的东芝120自动分析仪，操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品3μl，之后再加入R1试剂180μl预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入60μl的试剂R2反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。
本实施例所使用的校准品为久峰润达生物技术有限公司生产的APOE校准品。
实施例2
一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中试剂R1组成为：
pH8.0磷酸缓冲液100mmol/L
叠氮钠0.1%
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒0.1%
试剂R2组成为：
pH8.0磷酸缓冲液100mmol/L
羊抗人APOE抗体30ml/L
牛血清白蛋白20g/L
Kathon-CG0.05%
具体测定方法同实施例1。
实施例3
一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中试剂R1组成为：
pH8.0磷酸缓冲液100mmol/L
叠氮钠0.1%
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒1%
试剂R2组成为：
pH8.0磷酸缓冲液100mmol/L
羊抗人APOE抗体30ml/L
牛血清白蛋白30g/L
Kathon-CG0.05%
具体测定方法同实施例1。
实施例4
一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中试剂R1组成为：
pH8.0磷酸缓冲液100mmol/L
叠氮钠0.1%
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒2%
试剂R2组成为：
pH8.0磷酸缓冲液100mmol/L
羊抗人APOE抗体30ml/L
牛血清白蛋白40g/L
Kathon-CG0.05%
具体测定方法同实施例1。
对上述实施例1-4中制得的试剂盒分析性能进行实验验证。
准确度验证实验：
将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组，市场上获得认可的一种准确度优异的载脂蛋白E试剂盒（长春某公司生产）作为对照组进行对比实验，对40个样本进行检测，检测的结果如图1-图3。
通过图1-图3的检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与对照检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.9983、0.9982、0.9979，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的载脂蛋白E检测试剂盒有高度一致性，证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。
线性相关性验证实验：
找到载脂蛋白E高值样本为12mg/dL，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为12mg/dL、9.6mg/dL、7.2mg/dL、4.8mg/dL、2.4mg/dL、0mg/dL浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表1所示。
表1实施例1-4线性相关验证实验检测结果
上述检测结果显示，实施例1-4检测结果相关性均大于0.990，但实施例2、3、4的检测结果大于0.999，与实施例1相比具有更好的线性相关性，这说明本发明试剂具有更好的线性相关性。
稳定性验证实验：
在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间。检测数据如表2。
表2稳定性验证实验检测结果
实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而实施例2、3、4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定，说明在试剂中加入牛血清白蛋白和Kathon-CG，二者共同作用有效的提高了载脂蛋白E检测试剂盒的稳定性。
分析灵敏度验证实验：
用本发明载脂蛋白E试剂盒测试已知浓度在3.16mg/dL的样本，记录吸光度差值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表3所示。
表3分析灵敏度实验结果
理论浓度（mg/dL） 实施例1检测结果ΔA 实施例2检测结果ΔA 实施例3检测结果ΔA 实施例4检测结果ΔA
3.16 0.0030 0.0058 0.0059 0.0057
通过检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒的吸光度差值均比实施例1的高，说明在试剂中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人APOE抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，扩大了响应信号，大大的提高了试剂的分析灵敏度。
综合以上分析，本发明提供的载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，在试剂R1中通过加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒和在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Kathon-CG能够有效的提高试剂盒的稳定性和分析灵敏度，线性范围较好，试剂的准确度也较好。因此，本发明提供的载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。

Claims (3)

1.一种载脂蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1组成为：100mmol/LpH8.0磷酸缓冲液、0.1%叠氮钠、0.1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒；试剂R2组成为：100mmol/LpH8.0磷酸缓冲液、30ml/L羊抗人APOE抗体、20-40g/L牛血清白蛋白、0.05%Kathon-CG。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为Fe3O4/SiO2复合纳米粒子，粒径为20-50nm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2在使用时的比例为R1：R2=180：60。
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