CN105040280A - 聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜及其制备方法和应用。聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜通过以下步骤制备：1)制备壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶；2)制备包埋碱性成纤维因子bFGF的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球；3)制备静电纺丝液；4)电纺丝法制备聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜。本发明创造性的将聚丙烯网片与纳米纤维膜进行复合，利用纳米纤维膜改善聚丙烯网片的生物相容性，利用聚丙烯网片改善纳米纤维膜的抗张强度，两者相辅相成，再引入微球实现药物控释，可填补临床现有的聚丙烯网片的诸多不足。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械领域，涉及聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜及其制备方法和应用。
背景技术
二次世界大战至阿富汗与伊拉克局部战争中的战伤救治经验与教训表明，腹部战伤发生率始终无明显下降，而且始终是第三位致死性战伤。爆炸伤所致的腹部损伤可导致不同程度的腹壁毁损，腹腔脏器暴露、肠管脱出。失血性休克与创伤性休克复苏后合并的腹腔高压可导致腹部切口裂开，导致腹腔被动开放。为治疗休克合并的腹腔间隙综合征(ACS)常需采用主动的腹腔开放。无论是腹腔主动开放还是被动开放，均会成腹壁的相对缺损。
目前应用于腹部战创伤合并的腹壁毁损与缺损的材料均为临时关腹材料。这些临时关闭腹材料包括早期的碗、盆，后期的涤纶布、塑料袋。近来则采用聚丙烯网片、猪浆肌层网片和脱细胞基质的人皮或猪皮，这些人工合成全成材料不可降解，关腹后均会不同程度的磨损腹腔脏器。迄今为止，在腹腔开放领域，尚无一种修补材料既能保护裸露的肠管，又能促进机体组织增生，同能又能提供足够的修补作用。理想的创面保护材料应该能够模拟机体的有机组织，具有促进患者自身机体组织增生、良好的生物相容性、利于细胞长入，并且提供足够的强度，甚至具有防粘连效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜。
本发明的另一目的是提供该用于腹腔开放创面保护的聚丙烯网片/纳米纤维膜的制备方法，将聚丙烯网片与静电纺丝相结合，并以水凝胶为粘合剂，纳米纤维膜中亦加入含生长因子的微球，实现药物控释。
本发明的又一目的是提供聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜的应用。
本发明的上述目的可通过以下技术方案实现：
一种聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶；
(2)制备包埋碱性成纤维因子bFGF的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球；
(3)制备静电纺丝液；
(4)电纺丝法制备聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜。
其中，所述的制备壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶方法优选如下步骤：
1)聚乙二醇PEG于20‐28℃氮气环境下溶解在二氯甲烷中，溶液中PEG终浓度为8‐12％(g/100ml)；
2)将4‐二甲氨基吡啶与三乙胺溶解在的二氯甲烷中得混合溶液A，使混合溶液A中4‐二甲氨基吡啶和三乙胺浓度均为0.35‐0.4mol/L，然后将混合溶液A加入到上一步制备的含PEG的二氯甲烷溶液中搅拌10‐15min得混合溶液B，所述的混合溶液A与含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:3‐8；
3)将混合溶液B逐滴加入到含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中，在室温氮气环境下反应20‐24h；其中，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中p‐氨甲酸苯酯的浓度为0.1‐0.5mol/L，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液与步骤2)中所述的含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:1‐2；
4)将上述溶液在冷乙醚中蒸干沉淀析出，将沉淀过滤然后在真空中干燥，最终获得PNC‐PEG‐PNC；
5)将PNC‐PEG‐PNC在室温氮气环境下溶解在二甲亚砜中使其终浓度为5‐10％(g/100ml)；
6)取酪胺溶解在二甲亚砜中，得到浓度为3‐5mol/L的酪胺二甲亚砜溶液，然后将酪胺二甲亚砜溶液逐滴加入到上一步制备的PNC‐PEG‐PNC溶液中，在氮气环境下反应5‐7h，形成PNC–PEG–TA溶液；其中，酪胺二甲亚砜溶液与PNC‐PEG‐PNC溶液的体积比为1:1‐2；
7)壳聚糖用pH5的盐酸溶液然后加入到二甲亚砜中形成壳聚糖浓度为0.5‐0.7％(g/100ml)的溶液，然后将上述PNC‐PEG‐TA溶液加入到该溶液中在室温氮气环境下搅拌24h混合反应；其中，壳聚糖溶液与上一步酪胺二甲亚砜溶液的体积比为10‐15:1；
8)将上述溶液用氧化铝垫过滤，去除PNC盐，然后用0.01M，pH7.4的PBS溶液透析三天再用蒸馏水透析2天，来截留分子量为12–14kDa的材料；
9)将透析液冻干，获得Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末，其中Chitosan‐PEG‐TA浓度为7‐10wt％；
10)将Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末溶解在含HRP0.002–0.063mg/ml和H2O20.04‐0.08wt.％的0.01M，pH7.4的PBS溶液中得到壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶。
所述的制备壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶方法进一步优选如下步骤：
1)PEG于20‐28℃氮气环境下溶解在二氯甲烷中，溶液中PEG终浓度为10％(g/100ml)；
2)将4‐二甲氨基吡啶与三乙胺溶解在的二氯甲烷中得混合溶液A，使混合溶液A中4‐二甲氨基吡啶和三乙胺浓度均为0.375mol/L，然后将混合溶液A加入到上一步制备的含PEG的二氯甲烷溶液中搅拌10‐15min得混合溶液B，所述的混合溶液A与含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:5；
3)将混合溶液B逐滴加入到含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中，在室温氮气环境下反应24h；其中，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中p‐氨甲酸苯酯的浓度为0.125mol/L，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液与步骤2)中所述的含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:2；
4)将上述溶液在冷乙醚中蒸干沉淀析出，将沉淀过滤然后在真空中干燥，最终获得PNC‐PEG‐PNC；
5)将PNC‐PEG‐PNC在室温氮气环境下溶解在二甲亚砜中使其终浓度为8％(g/100ml)；
6)取酪胺溶解在二甲亚砜中，得到浓度为4mol/L的酪胺二甲亚砜溶液，然后将酪胺二甲亚砜溶液逐滴加入到上一步制备的PNC‐PEG‐PNC溶液中，在氮气环境下反应6h，形成PNC–PEG–TA溶液；其中，酪胺二甲亚砜溶液与PNC‐PEG‐PNC溶液的体积比为1:2；
7)壳聚糖(低分子量，75‐85％脱乙酰化)用pH5的盐酸溶液然后加入到二甲亚砜中形成壳聚糖浓度为0.667％(g/100ml)的溶液，然后将上述PNC‐PEG‐TA溶液加入到该溶液中在室温氮气环境下搅拌24h混合反应；其中，壳聚糖溶液与上一步酪胺二甲亚砜溶液的体积比为12:1；
8)将上述溶液用氧化铝垫过滤，去除PNC盐，然后用0.01M，pH7.4的PBS溶液透析三天再用蒸馏水透析2天，来截留分子量为12–14kDa的材料；
9)将透析液冻干，获得Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末，其中Chitosan‐PEG‐TA浓度为10wt％；
10)将Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末溶解在含HRP0.002–0.063mg/ml和H2O20.06wt.％的0.01M，pH7.4的PBS溶液中得到壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶。
所述的包埋碱性成纤维因子bFGF的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球制备方法优选如下步骤：将水溶性的碱性成纤维因子bFGF按90‐120ng/ml溶于生理盐水中作为内水相W1，聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA溶于二氯甲烷中作为油相O，油相中PLGA浓度为8‐12mg/mL，质量百分含量2％的聚乙烯醇PVA水溶液作为外水相W2，W1：O：W2的体积比为15∶2∶40‐60；将W1逐滴滴入O中，以高速匀浆机在30,000r/min下乳化1‐2min形成初乳W1/O，待初乳稳定后，将初乳液滴入外水相W2中，15,000r/min下搅拌3min形成复乳W1/O/W2；然后将复乳液倒入烧杯中，20‐28℃下磁力搅拌挥发3‐5h，过滤，3,500‐5,000r/min离心15‐20min，去离子水洗涤、过滤后再离心，如此反复操作3‐5遍，直至将多于的PVA清除，将样品‐20℃冷冻保存至少48h；冷冻干燥22‐26h得所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球。
所述的包埋碱性成纤维因子bFGF的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球制备方法进一步优选如下步骤：
将水溶性的碱性成纤维因子bFGF按100ng/ml溶于生理盐水中作为内水相W1，聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA溶于二氯甲烷中作为油相O，油相中PLGA浓度为10mg/mL，质量百分含量2％的聚乙烯醇PVA水溶液作为外水相W2，W1：O：W2的体积比为15∶2∶50；将W1逐滴滴入O中，以高速匀浆机在30,000r/min下乳化1‐2min形成初乳W1/O，待初乳稳定后，将初乳液滴入外水相W2中，15,000r/min下搅拌3min形成复乳W1/O/W2；然后将复乳液倒入烧杯中，20‐28℃下磁力搅拌挥发3‐5h，过滤，3,500‐5,000r/min离心15‐20min，去离子水洗涤、过滤后再离心，如此反复操作3‐5遍，直至将多于的PVA清除，将样品‐20℃冷冻保存至少48h；冷冻干燥24h得所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球。
所述的静电纺丝液优选通过以下方法制备：把壳聚糖CS和聚乙二醇PEO质量比为2‐6：1的混合粉末溶于90％的冰醋酸水溶液中配制成总质量百分含量4％的溶液，然后加入聚己内酯PCL,磁力搅拌溶解,配制成CS与PCL质量比为1:1‐3的混合溶液C；再溶入制备的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球；所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球在混合溶液C中的质量百分含量为3‐6％；其中，所述的壳聚糖CS和聚乙二醇PEO质量比进一步优选4：1，混合溶液C中CS与PCL质量比进一步优选1:2，所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球在混合溶液C中的质量百分含量进一步优选4％。
所述的壳聚糖CS的重均分子量优选(3‐8)×105，进一步优选5×105，脱己酰度为90％；聚己内酯PCL平均分子量优选(5‐10)×104，进一步优选8×104；聚乙二醇PEO的重均分子量优选(0.8‐1.2)×104，进一步优选1×104。
步骤(4)中电纺丝法制备聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜的方法优选：将聚丙烯网片浸泡壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶，然后将表面带水凝胶的聚丙烯网片置于静电纺丝仪接收板上，将配制好的电纺丝液溶液注入注射器,注射器固定于静电纺丝装置的微量注射泵上,电源阳极输出端与针头相连,阴极输出端与金属接收板相接,混合溶液在静电力的作用下从针尖喷出,聚丙烯网片表面通过水凝胶粘附所纺的纳米纤维膜，从而制备含载药微球的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜初品，将聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜初品置于真空冷冻干燥机中冻干得聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜成品；其中，静电纺丝条件进一步优选:电压10‐20kV，推进速度3‐8mL/min，距离15‐20cm，温度<30℃，湿度<45％；静电纺丝条件更进一步优选电压15kV，推进速度5mL/min，距离15～20cm，温度,<30℃，湿度<45％。
按照上述制备方法制备的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜。
本发明所述的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜在制备用于腹腔开放创面保护的复合补片中的应用。
有益效果：
静电纺丝法是目前制备纳米纤维的一种成熟的方法，其制备的纤维膜具有纤维直径小、体表面积大的特点，在形态结构上与天然细胞外基质(ECM)极其类似，有利于细胞粘附和增值，促进创面修复，且纳米纤维膜质地柔软，不易磨损肠管，同时纳米纤维还有较高的表面积-体积比率，有利于活性细胞及生长因子的吸附和释放，从而大幅度提高复合材料的生物学性能，而且纳米纤维结构制备简单，价格低廉，其纤维结构可调，可以满足不同的临床应用需要。
通过物理或化学的方法将药物分散、吸附或者溶解在高分子载体材料中，形成微小球状实体称微球。微球用于药物载体的研究始于20世纪70年代中期，作为药物缓释体系来治疗许多疾病，它既能够保护药物免遭破坏，又能与某些细胞组织具有特殊的亲和性，集中在靶区逐步释放药物或被溶酶体中的酶降解而释放药物，不同类型的微球具有不同的药物控释特点，可以通过改变微球的类型和性质来使其具备特定组织及器官的靶向性，使得药物在局部的浓度提升，作用时间延长，提高治疗效果，减轻对人体的毒副作用。生长因子可调节组织的创伤修复，而在复杂创伤修复微环境中生长因子介导组织再生面临着许多挑战，生长因子的在伤口中的活性、持续作用时间、浓度难以保持。所以很多研究着眼于改善现有的药物释放体系来实现创面修复过程中生长因子的长期缓释。
本发明创造性的将聚丙烯网片与纳米纤维膜进行复合，利用纳米纤维膜改善聚丙烯网片的生物相容性，利用聚丙烯网片改善纳米纤维膜的抗张强度，两者相辅相成，再引入微球实现药物控释，可填补临床现有的聚丙烯网片的诸多不足。
附图说明
图1腹壁缺损模型单纯聚丙烯网片组(a)及聚丙烯网片复合纳米纤维膜组(b)修补后形成的肉芽厚度。
图2免疫荧光法测定肉芽组织中成纤维细胞的量，a图为聚丙烯网片组，b图为聚丙烯网片复合纳米纤维膜组。
图3植入补片7d后肉芽组织的血管新生情况，A图为使用单纯聚丙烯网片修补腹壁缺损，B图为聚丙烯网片复合纳米纤维膜修补腹壁缺损。
具体实施方式
实施例1
1、聚丙烯网片购于美国巴德公司。即由聚丙烯单丝编织的不可吸收材料，包括一张长方形网片约6cm×4cm。
2、制备壳聚糖-聚乙二醇水凝胶：
1)聚乙二醇PEG(分子量3000，4000gmol‐1)于20‐28℃氮气环境下溶解在二氯甲烷中，溶液中PEG终浓度为10％(g/100ml)；
2)将4‐二甲氨基吡啶与三乙胺溶解在的二氯甲烷中得混合溶液A，使混合溶液A中4‐二甲氨基吡啶和三乙胺浓度均为0.375mol/L，然后将混合溶液A加入到上一步制备的含PEG的二氯甲烷溶液中搅拌15min得混合溶液B，所述的混合溶液A与含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:5；
3)将混合溶液B逐滴加入到含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中，在室温氮气环境下反应24h；其中，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中p‐氨甲酸苯酯的浓度为0.125mol/L，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液与步骤2)中所述的含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:2；
4)将上述溶液在冷乙醚中蒸干沉淀析出，将沉淀过滤然后在真空中干燥，最终获得PNC‐PEG‐PNC；
5)将PNC‐PEG‐PNC在室温氮气环境下溶解在二甲亚砜中使其终浓度为8％(g/100ml)；
6)取酪胺溶解在二甲亚砜中，得到浓度为4mol/L的酪胺二甲亚砜溶液，然后将酪胺二甲亚砜溶液逐滴加入到上一步制备的PNC‐PEG‐PNC溶液中，在氮气环境下反应6h，形成PNC–PEG–TA溶液；其中，酪胺二甲亚砜溶液与PNC‐PEG‐PNC溶液的体积比为1:2；
7)壳聚糖(低分子量，75‐85％脱乙酰化)用pH5的盐酸溶液然后加入到二甲亚砜中形成壳聚糖浓度为0.667％(g/100ml)的溶液，然后将上述PNC‐PEG‐TA溶液加入到该溶液中在室温氮气环境下搅拌24h混合反应；其中，壳聚糖溶液与上一步酪胺二甲亚砜溶液的体积比为12:1；
8)将上述溶液用氧化铝垫过滤，去除PNC盐，然后用0.01MPBS溶液(pH7.4)透析三天再用蒸馏水透析2天，来截留分子量为12–14kDa的材料；
9)将透析液冻干，获得Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末，其中Chitosan‐PEG‐TA浓度为10wt％；
10)将Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末溶解在含HRP0.002–0.063mg/ml和H2O20.06wt.％的0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液中得到壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶。
3、包埋bFGF的PLGA微球制备：将水溶性的碱性成纤维因子bFGF按100ng/ml溶于生理盐水中作为内水相W1，聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA溶于二氯甲烷中作为油相O，油相中PLGA浓度为10mg/mL，质量百分含量2％的聚乙烯醇PVA水溶液作为外水相W2，W1：O：W2的体积比为15∶2∶50；将W1逐滴滴入O中，以高速匀浆机在30,000r/min下乳化1‐2min形成初乳W1/O，待初乳稳定后，将初乳液滴入外水相W2中，15,000r/min下搅拌3min形成复乳W1/O/W2；然后将复乳液倒入烧杯中，20～28℃下磁力搅拌挥发5h，过滤，3,500‐5,000r/min离心15min，去离子水洗涤、过滤后再离心，如此反复操作5遍，直至将多于的PVA清除，将样品‐20℃冷冻保存至少48h；冷冻干燥24h得所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球。
4、静电纺丝液准备：壳聚糖(CS,Mw＝5×105),脱己酰度(DD)为90％,购自SIGMA公司；聚己内酯(PCL)购自SIGMA公司,平均分子量为8×104；聚乙二醇(PEO),Mw＝1×104,购于SIGMA试剂公司；实验室自备冰醋酸、氯仿、乙醇等溶剂。把CS和PEO的混合粉末(CS和PEO的质量比为4)溶于90％的冰醋酸水溶液中配置成4％的溶液。然后加入一定的PCL,磁力搅拌溶解,配置成CS与PCL质量比分别为0.5的混合溶液C，再溶入制备的含bFGF的微球，聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA微球与混合溶液C的质量百分含量为4％。
5、电纺丝法制备聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜：聚丙烯网片浸泡壳聚糖-聚乙二醇水凝胶，然后将表面带水凝胶的聚丙烯网片置于静电纺丝仪接收板上，将配制好的混合溶液注入5mL的注射器,注射器固定于静电纺丝装置的微量注射泵上,电源阳极输出端与针头相连,阴极输出端与金属接收板相接,混合溶液在静电力的作用下从针尖喷出,聚丙烯网片表面通过水凝胶粘附所纺的纳米纤维膜，从而制备含载药微球的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜初品，将聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜初品置于真空冷冻干燥机中冻干得表面含bFGF微球的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜成品。其中，静电纺丝条件:电压,15kV，推进速度5mL/min，距离18cm，温度<30℃，湿度<45％。
实施例2
1.动物与分组:雄性SD大鼠20只(购于中国科学院上海实验动物中心),体重
230～270g,随机分为2组。实验组：实施例1制备的聚丙烯网片/纳米纤维膜裁剪成适宜规格得到的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜复合补片组(简称聚丙烯网片复合纳米纤维膜组)，对照组:聚丙烯网片组。
2.手术方法：动物术前禁食8h,腹腔内注射1％氯胺酮10ml/kg。麻醉成功后,建立盲肠结扎穿孔(CLP)致腹腔感染合并腹高压(IAH)后腹壁缺损的模型，具体如下：取腹部正中切口,距回盲部20cm,切断小肠周径1/3,距穿孔处上下各1cm处用3-0缝线将对系膜缘肠壁悬吊于右侧腹壁,1号丝线分两层关腹。即靠近回盲部结扎大部分盲肠,18号针头盲肠末端戳2孔，缝合手术切口。硅树脂导管(外径0.8mm)置入大鼠腹腔内用于鼓入氮气，建立腹高压，维持腹内压20mmHg,4小时后打开腹壁的缝合线，吻合结肠缺损(5/0)，用10ml生理盐水冲洗腹腔，移去全层腹壁，形成2cm×3cm的缺损。实验组及对照组分别用聚丙烯网片/纳米纤维膜复合补片和聚丙烯网片对缺损部位进行缝合，外面贴上医用透明敷料保护，于7d取标本进行病理，PCR等相关检测，结果见图1-图3。图1显示复合补片实验组肉芽更厚，图2免疫荧光法测定肉芽组织中成纤维细胞的量，结果显示复合补片形成肉芽肿成纤维细胞含量更高。图3显示了对照组和实验组的血管新生情况，由图可见实验组复合补片能促进血管新生。促炎因子、抗炎因子等表达量测定结果见表1，由表1中的数据可看出实验组复合补片的抗炎性能更佳。
表1
Claims (10)
1.一种聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶；
(2)制备包埋碱性成纤维因子bFGF的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球；
(3)制备静电纺丝液；
(4)电纺丝法制备聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶制备方法如下：
1)聚乙二醇PEG于20‐28℃氮气环境下溶解在二氯甲烷中，溶液中PEG终浓度为8‐12％(g/100ml)；
2)将4‐二甲氨基吡啶与三乙胺溶解在的二氯甲烷中得混合溶液A，使混合溶液A中4‐二甲氨基吡啶和三乙胺浓度均为0.35‐0.4mol/L，然后将混合溶液A加入到上一步制备的含PEG的二氯甲烷溶液中搅拌10‐15min得混合溶液B，所述的混合溶液A与含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:3‐8；
3)将混合溶液B逐滴加入到含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中，在室温氮气环境下反应20‐24h；其中，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中p‐氨甲酸苯酯的浓度为0.1‐0.5mol/L，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液与步骤2)中所述的含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:1‐2；
4)将上述溶液在冷乙醚中蒸干沉淀析出，将沉淀过滤然后在真空中干燥，最终获得PNC‐PEG‐PNC；
5)将PNC‐PEG‐PNC在室温氮气环境下溶解在二甲亚砜中使其终浓度为5‐10％(g/100ml)；
6)取酪胺溶解在二甲亚砜中，得到浓度为3‐5mol/L的酪胺二甲亚砜溶液，然后将酪胺二甲亚砜溶液逐滴加入到上一步制备的PNC‐PEG‐PNC溶液中，在氮气环境下反应5‐7h，形成PNC–PEG–TA溶液；其中，酪胺二甲亚砜溶液与PNC‐PEG‐PNC溶液的体积比为1:1‐2；
7)壳聚糖用pH5的盐酸溶液然后加入到二甲亚砜中形成壳聚糖浓度为0.5‐0.7％(g/100ml)的溶液，然后将上述PNC‐PEG‐TA溶液加入到该溶液中在室温氮气环境下搅拌24h混合反应；其中，壳聚糖溶液与上一步酪胺二甲亚砜溶液的体积比为10‐15:1；
8)将上述溶液用氧化铝垫过滤，去除PNC盐，然后用0.01M，pH7.4的PBS溶液透析三天再用蒸馏水透析2天，来截留分子量为12–14kDa的材料；
9)将透析液冻干，获得Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末，其中Chitosan‐PEG‐TA浓度为7‐10wt％；
10)将Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末溶解在含HRP0.002–0.063mg/ml和H2O20.04‐0.08wt.％的0.01M，pH7.4的PBS溶液中得到壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶制备方法如下：
1)PEG于20‐28℃氮气环境下溶解在二氯甲烷中，溶液中PEG终浓度为10％(g/100ml)；
2)将4‐二甲氨基吡啶与三乙胺溶解在的二氯甲烷中得混合溶液A，使混合溶液A中4‐二甲氨基吡啶和三乙胺浓度均为0.375mol/L，然后将混合溶液A加入到上一步制备的含PEG的二氯甲烷溶液中搅拌10‐15min得混合溶液B，所述的混合溶液A与含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:5；
3)将混合溶液B逐滴加入到含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中，在室温氮气环境下反应24h；其中，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液中p‐氨甲酸苯酯的浓度为0.125mol/L，所述的含p‐氨甲酸苯酯的二氯甲烷溶液与步骤2)中所述的含PEG的二氯甲烷溶液的体积比是1:2；
4)将上述溶液在冷乙醚中蒸干沉淀析出，将沉淀过滤然后在真空中干燥，最终获得PNC‐PEG‐PNC；
5)将PNC‐PEG‐PNC在室温氮气环境下溶解在二甲亚砜中使其终浓度为8％(g/100ml)；
6)取酪胺溶解在二甲亚砜中，得到浓度为4mol/L的酪胺二甲亚砜溶液，然后将酪胺二甲亚砜溶液逐滴加入到上一步制备的PNC‐PEG‐PNC溶液中，在氮气环境下反应6h，形成PNC–PEG–TA溶液；其中，酪胺二甲亚砜溶液与PNC‐PEG‐PNC溶液的体积比为1:2；
7)壳聚糖用pH5的盐酸溶液然后加入到二甲亚砜中形成壳聚糖浓度为0.667％(g/100ml)的溶液，然后将上述PNC‐PEG‐TA溶液加入到该溶液中在室温氮气环境下搅拌24h混合反应；其中，壳聚糖溶液与上一步酪胺二甲亚砜溶液的体积比为12:1；
8)将上述溶液用氧化铝垫过滤，去除PNC盐，然后用0.01M，pH7.4的PBS溶液透析三天再用蒸馏水透析2天，来截留分子量为12–14kDa的材料；
9)将透析液冻干，获得Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末，其中Chitosan‐PEG‐TA浓度为10wt％；
10)将Chitosan‐PEG‐TA冻干粉末溶解在含HRP0.002–0.063mg/ml和H2O20.06wt.％的0.01M，pH7.4的PBS溶液中得到壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的包埋碱性成纤维因子bFGF的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球制备方法如下：
将水溶性的碱性成纤维因子bFGF按90‐120ng/ml溶于生理盐水中作为内水相W1，聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA溶于二氯甲烷中作为油相O，油相中PLGA浓度为8‐12mg/mL，质量百分含量2％的聚乙烯醇PVA水溶液作为外水相W2，W1：O：W2的体积比为15∶2∶40‐60；将W1逐滴滴入O中，以高速匀浆机在30,000r/min下乳化1‐2min形成初乳W1/O，待初乳稳定后，将初乳液滴入外水相W2中，15,000r/min下搅拌3min形成复乳W1/O/W2；然后将复乳液倒入烧杯中，20‐28℃下磁力搅拌挥发3‐5h，过滤，3,500‐5,000r/min离心15‐20min，去离子水洗涤、过滤后再离心，如此反复操作3‐5遍，直至将多于的PVA清除，将样品‐20℃冷冻保存至少48h；冷冻干燥22‐26h得所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的包埋碱性成纤维因子bFGF的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球制备方法如下：
将水溶性的碱性成纤维因子bFGF按100ng/ml溶于生理盐水中作为内水相W1，聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA溶于二氯甲烷中作为油相O，油相中PLGA浓度为10mg/mL，质量百分含量2％的聚乙烯醇PVA水溶液作为外水相W2，W1：O：W2的体积比为15∶2∶50；将W1逐滴滴入O中，以高速匀浆机在30,000r/min下乳化1‐2min形成初乳W1/O，待初乳稳定后，将初乳液滴入外水相W2中，15,000r/min下搅拌3min形成复乳W1/O/W2；然后将复乳液倒入烧杯中，20‐28℃下磁力搅拌挥发3‐5h，过滤，3,500‐5,000r/min离心15‐20min，去离子水洗涤、过滤后再离心，如此反复操作3‐5遍，直至将多于的PVA清除，将样品‐20℃冷冻保存至少48h；冷冻干燥24h得所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的静电纺丝液通过以下方法制备：把壳聚糖CS和聚乙二醇PEO质量比为2‐6：1的混合粉末溶于90％的冰醋酸水溶液中配制成总质量百分含量4％的溶液，然后加入聚己内酯PCL,磁力搅拌溶解,配制成CS与PCL质量比为1:1‐3的混合溶液C；再溶入制备的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球；所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球在混合溶液C中的质量百分含量为2‐6％；其中，所述的壳聚糖CS和聚乙二醇PEO质量比为4：1，混合溶液C中CS与PCL质量比为1:2，所述的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物PLGA微球在混合溶液C中的质量百分含量为4％。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖CS的重均分子量为(3‐8)×105，脱己酰度为90％；聚己内酯PCL平均分子量为(5‐10)×104；聚乙二醇PEO的重均分子量为(0.8‐1.2)×104。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中电纺丝法制备聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜的方法为：将聚丙烯网片浸泡壳聚糖‐聚乙二醇水凝胶，然后将表面带水凝胶的聚丙烯网片置于静电纺丝仪接收板上，将配制好的电纺丝液溶液注入注射器,注射器固定于静电纺丝装置的微量注射泵上,电源阳极输出端与针头相连,阴极输出端与金属接收板相接,混合溶液在静电力的作用下从针尖喷出,聚丙烯网片表面通过水凝胶粘附所纺的纳米纤维膜，从而制备含载药微球的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜初品，将聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜初品置于真空冷冻干燥机中冻干得聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜成品；其中，静电纺丝条件优选:电压10‐20kV，推进速度3‐8mL/min，距离15‐20cm，温度<30℃，湿度<45％。
9.根据权利要求1‐8中任一项所述的制备方法制备的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜。
10.权利要求9所述的聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜在制备用于腹腔开放创面保护的复合补片中的应用。
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