CN105040100A - 一种具有红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备方法，包括如下步骤：在油酸、油胺、乙醇和水的反应体系中，加入硝酸钙和磷酸盐在120～200?C进行第一次水热反应获得纯的羟基磷灰石纳米棒；待第一次水热反应温度降至室温后，加入硝酸铕进行二次水热反应，获得具有红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒。本发明所制备的具有荧光标记的纳米棒可应用于活体细胞的荧光标记，亦可作为无机原料用于制备可降解的人工骨、骨水泥等生物医用材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有红色荧光标记性能的羟基磷灰石单分散单晶纳米棒的制备方法。
背景技术
随着生命科学的发展，人们希望能够获得丰富详细的关于组织、细胞等的直观信息，促使各种成像技术迅速发展。其中，生物荧光成像以其破坏性小、灵敏度高、选择性好等优点，一直是人们关注的焦点。而荧光成像的发展受到了荧光探针性能的制约。
羟基磷灰石（Ca10(OH)2(PO4)6,
HAp）具有优异的生物相容性、骨诱导性、非免疫原性、可降解性等性能，被广泛用于组织工程、药物和基因传递和其他生物领域。同时，羟基磷灰石也是一种很好的离子掺杂的基体材料，常被杂质离子赋予新的理化特性。
羟基磷灰石具有优良的生物相容性和好的生物可降解性，但是常规稀土离子掺杂的羟基磷灰石荧光探针易被晶格中的羟基引起淬灭现象，因此常被加入氟离子等取代晶格里的羟基提高材料的荧光性能，而材料中大量的氟离子的存在使材料的应用受到了一定的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光强度良好、形貌尺寸可控并具有良好生物相容性的可降解的铕掺杂的羟基磷灰石纳米荧光探针的制备方法。
本发明的实现过程如下：
一种铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备方法，包括如下步骤：
（1）在油酸、油胺、乙醇和水的反应体系中，加入硝酸钙和磷酸盐在120～200˚C进行第一次水热反应获得纯的羟基磷灰石纳米棒，其中油酸、油胺、乙醇和水的体积比为（2～6）: （0.5～2）: （10～20）: （10～20），所述磷酸盐选自磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠，硝酸钙与磷酸盐的摩尔比为：1:1.67；
（2）待第一次水热反应温度降至室温后，加入硝酸铕进行二次水热反应，获得具有红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒。
上述步骤（1）和（2）中，反应的时间为5～20 h。
上述步骤（2）中，待第一次水热反应温度降至室温后，离心得沉淀，将沉淀分散至环己烷中，使用乙醇助沉离心；所述硝酸铕与硝酸钙的摩尔比为0.05:1
~ 0.2:1。
上述方法制备得到的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒直径为6~9 nm，其长约为140~160nm。
上述方法制备得到的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒作为纳米荧光探针应用于活体细胞荧光标记。
本发明基于离子交换作用，利用两步水热法和羟基磷灰石晶体表面铕离子的吸附和铕-钙置换效应，实现离子在晶格中置换掺杂和晶格缺陷，并因两者的协同作用获得了铕掺杂的羟基磷灰石纳米棒红色荧光探针。该探针不仅避免了一步水热掺杂时晶格中羟基的淬灭负影响，还避免了一步水热掺杂时纳米晶长径比随掺杂量而变化的问题，使获得的荧光探针具有荧光强度和形貌尺寸可控的优点。
本发明的积极效果：本发明制备方法原料廉价易得，成本低，合成工艺简单易实现，产品质量稳定，工艺放大容易且重现性能好；本方法所制备的具有荧光标记的纳米棒可应用于活体细胞的荧光标记，亦可作为无机原料可用于制备可降解的人工骨、骨水泥等生物医用材料。本发明所制备的单晶纳米棒在生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。
附图说明
图 1 是实施例 1 制备的羟基磷灰石单分散单晶纳米棒的TEM图: A) 纯的纳米羟基磷灰石; B) 铕掺杂的纳米羟基磷灰石；
图 2 是实施例 1 制备的具有红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单分散单晶纳米棒的XRD图；
图 3 是实施例1制备的具有红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单分散单晶纳米棒的HRTEM图（A）和傅里叶变换图（B）；
图 4 是实施例 1制备的具有红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单分散单晶纳米棒的EDS图；
图 5是实施例 1制备的具有红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单分散单晶纳米棒的荧光扫描图；
图6 为实施例 6 一步法制备的铕掺杂羟基磷灰石单分散单晶纳米棒的TEM图；
图7为实施例6（a）和1（b）制备的铕掺杂羟基磷灰石单分散单晶纳米棒的荧光扫描图；
图 8 是实施例7制备的红色荧光纳米棒用于细胞标记的荧光照片图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例 1 红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备
第一步水热反应：在50mL的聚四氟乙烯水热釜中，加入4mL油酸，1mL油胺，16mL乙醇，搅拌均匀，然后再加入0.25 M的硝酸钙8mL和0.15 M的磷酸钠8mL，搅拌均匀密封，在150℃水热反应10h，然后降温至室温。（若水热实验至此结束后进行离心收集沉淀，并用环己烷和乙醇洗涤数次，可获得纯的羟基磷灰石纳米棒。）
第二步水热反应：将0.25 M的硝酸铕1.2 mL加入上述水热体系中搅拌均匀后，再次密封，在150℃水热反应10h。反应结束后，离心收集沉淀，并用环己烷和乙醇洗涤数次获得终产物。
通过透射电镜检测显示一步水热反应和两步水热反应的产物形貌没有明显变化，均为直径约8nm和长约150nm的纳米棒，如图1所示；经X射线粉末衍射鉴定第二步水热后产物为羟基磷灰石，如图2所示；从高分辨透射电镜（HRTEM）检测和相关的傅里叶变换图知制备的纳米棒为单晶结构，如图3；元素分析知所得单晶纳米棒中含有元素铕，如图4所示；进一步对样品进行荧光扫描知其具有良好的红色荧光特性，如图5所示。
实施例 2 红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备
第一步水热反应：在50mL的聚四氟乙烯水热釜中，加入4mL油酸，1mL油胺，16mL乙醇，搅拌均匀，然后再加入0.25 M的硝酸钙8mL和0.15 M的磷酸钠8mL，搅拌均匀密封，在120℃水热反应20h，然后降温至室温。
第二步水热反应：将0.25 M的硝酸铕1.6 mL加入上述水热体系中搅拌均匀后，再次密封，在120℃水热反应20h。反应结束后，离心收集沉淀，并用环己烷和乙醇洗涤数次获得终产物。
实施例 3 红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备
第一步水热反应：在50mL的聚四氟乙烯水热釜中，加入4mL油酸，1mL油胺，16mL乙醇，搅拌均匀，然后再加入0.25 M的硝酸钙8mL和0.15 M的磷酸钠8mL，搅拌均匀密封，在180℃水热反应10h，然后降温至室温。
第二步水热反应：将0.25 M的硝酸铕0.8 mL加入上述水热体系中搅拌均匀后，再次密封，在180℃水热反应10h。反应结束后，离心收集沉淀，并用环己烷和乙醇洗涤数次获得终产物。
实施例 4 红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备
第一步水热反应：在50mL的聚四氟乙烯水热釜中，加入4mL油酸，1mL油胺，16mL乙醇，搅拌均匀，然后再加入0.25 M的硝酸钙8mL和0.15 M的磷酸钠8mL，搅拌均匀密封，在200℃水热反应5h，然后降温至室温。
第二步水热反应：将0.25 M的硝酸铕0.4 mL加入上述水热体系中搅拌均匀后，再次密封，在200℃水热反应5h。反应结束后，离心收集沉淀，并用环己烷和乙醇洗涤数次获得终产物。
实施例 5 红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备
第一步水热反应：在500mL的聚四氟乙烯水热釜中，加入40mL油酸，10mL油胺，160mL乙醇，搅拌均匀，然后再加入0.25 M的硝酸钙80mL和0.15 M的磷酸钠80mL，搅拌均匀密封，在150℃下水热反应10h，然后降温至室温。
第二步水热反应：将0.25 M的硝酸铕12 mL加入上述水热体系中搅拌均匀后，再次密封，在150℃下水热反应10h。反应结束后，离心收集沉淀，并用环己烷和乙醇洗涤数次获得终产物。
实施例 6对比实例
与实施例1类似，不同的是稀土离子一步掺杂。
在50mL的聚四氟乙烯水热釜中，加入4mL油酸，1mL油胺，16mL乙醇，搅拌均匀，然后再加入0.25 M的硝酸钙8mL和0.15 M的磷酸钠8mL，再加入0.25 M的硝酸铕1.2 mL，搅拌均匀密封，在150℃水热反应10h，然后降温至室温。反应结束后，离心收集沉淀，并用环己烷和乙醇洗涤数次获得终产物。
从图6可见，一步法制备得到的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米线长达0.5-1μm，尺寸不适于作为荧光标记；与实施例1对比，一步法制备得到的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米荧光非常弱。
实施例 7 红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的应用
第一步，纳米棒表面的亲疏水性转换。取18 mg的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒分散于2ml的环己烷中，并加入到溶有20mg Pluronic
F127的10ml水溶液中，然后再加入6ml四氢呋喃，震荡混匀后，获得浑浊的悬浮液。然后通过减压旋转蒸发移除混合液中的有机溶剂，再用水洗去多余的Pluronic
F127后获得亲水性铕掺杂羟基磷灰石单晶荧光纳米粒子。
第二步，红色荧光的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的细胞标记。
在37℃的CO2含量为5%的细胞培养箱中，用含有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养液培养A549细胞，维持在指数生长状态。把灭菌的玻璃底片放入24孔板中，然后加入已经计数的A549细胞悬浮液，使每个玻璃片上有 1×105的细胞数，培养24h, 再加入150 µg/ml荧光纳米粒子溶液在 37℃ 培养4 h，再用灭菌的PBS洗去未摄取的纳米粒子，取出玻璃片立刻用4%多聚甲醛在室温下固定10min, 固定好的细胞用激光扫描共焦显微镜观察形貌，结果如图8所示。
Claims (6)
1.一种铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）在油酸、油胺、乙醇和水的反应体系中，加入硝酸钙和磷酸盐在120～200˚C进行第一次水热反应获得纯的羟基磷灰石纳米棒，其中油酸、油胺、乙醇和水的体积比为（2～6）: （0.5～2）: （10～20）: （10～20），所述磷酸盐选自磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠，硝酸钙与磷酸盐的摩尔比为：1:1.67；
（2）待第一次水热反应温度降至室温后，加入硝酸铕进行二次水热反应，获得直径为6~9
nm、长度为140~160nm的具有红色荧光标记的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中，反应的时间为5～20 h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，待第一次水热反应温度降至室温后，离心得沉淀，将沉淀分散至环己烷中，使用乙醇助沉离心。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述硝酸铕与硝酸钙的摩尔比为0.05:1 ~ 0.2:1。
5.权利要求1所述方法制备得到的铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒。
6.权利要求5所述铕掺杂羟基磷灰石单晶纳米棒作为纳米荧光探针应用于活体细胞荧光标记。
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