CN105039416B

CN105039416B - 一种提高厌氧食气微生物发酵效率的方法

Info

Publication number: CN105039416B
Application number: CN201510534441.4A
Authority: CN
Inventors: 谢彬涛; 韩一凡; 郭亚琼; 王兴彪; 王敬敬; 张小霞; 黄志勇
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2015-08-27
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2035-08-27
Also published as: CN105039416A

Abstract

本发明的目的是提供一种提高厌氧食气微生物发酵效率的方法,是对发酵体系中对厌氧食气微生物的菌液用中空纤维素膜进行过滤截留，再用培养基进行反向冲洗后，对截留菌体再次进行发酵。本发明在厌氧食气微生物气体发酵过程中，实现发酵罐与中空纤维素膜组件之间的互联，使发酵液在中空纤维素膜内腔和发酵罐之间形成循环，同时利用连接在中空纤维素膜组件外壁的蠕动泵，进行抽排，实现对发酵液的抽滤，截留菌体，后用新鲜培养基将附着在中空纤维素膜腔体内的菌体冲洗到发酵罐中，进行多次连续发酵。本发明能够提高厌氧食气梭菌在气体发酵过程中的生物量积累，有效增加利用合成气生产乙醇、丁醇和正己醇的产量。

Description

一种提高厌氧食气微生物发酵效率的方法

技术领域

本发明属于厌氧微生物气体发酵技术领域，具体涉及一种提高厌氧食气微生物发酵效率的方法。

技术背景

合成气是一种主要包含CO、H₂以及少量CO₂等其他组分的混合气体，来源广泛，如煤、石油、天然气、工业废气(如焦炉煤气、炼厂气)、城市固体废弃物以及生物质等。自然界中存在一类厌氧食气微生物，能以合成气(CO、CO₂以及H₂)作为唯一的碳源和能量源进行生长，并且将其转化为多种有机酸和醇类物质，包括乙酸、丁酸、2,3-丁二醇等高附加值化学品和乙醇、正丁醇、正己醇等生物燃料。目前，化石能源的过度使用以及城市垃圾、秸秆等的燃烧造成大气中CO、CO₂、CH₄等气体含量的不断攀升，损害人体健康，造成了全球范围内的温室效应，加剧了厄尔尼诺现象，导致气候异常、海平面上升、农作物产量下降等诸多严重的社会环境和经济问题。因此，将合成气利用微生物应用到工业发酵过程中，不仅可以形成一条可持续发展的能源和化学品开发的绿色通道，节省企业的运行成本，进一步创造经济效益，还可以减少含碳气体排放，加速地球碳循环，减轻温室效应，创造社会和环境效应。

虽然合成气的利用也有化学方法，但是微生物气体发酵技术在多个方面均具有明显优势：首先，微生物发酵可以在低温低压条件下完成，降低了能量和设备成本，增强了生产安全性；其次，微生物转化具有较高的选择性，可以转化成一种主要产品；再次，合成气流量和气体组成比对反应过程影响不大；最后，发酵过程没有催化剂中毒的情况。然而目前，食气厌氧菌在发酵过程中较低的生长浓度，抑制了其对气体的利用效率、高附加值产物的合成，从而阻碍了微生物发酵技术在工业生产实际中的应用。因此，如何提高食气厌氧菌的细胞浓度，是合成气生物发酵工程技术领域的一项关键技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高厌氧食气微生物发酵效率的方法,即一种提高厌氧食气微生物发酵时的生物量积累和C4、C6产物合成的方法。

本发明的方法，是对发酵体系中对厌氧食气微生物的菌液用中空纤维素膜进行过滤截留，再用培养基进行反向冲洗后，对截留菌体再次进行发酵，

作为实施例的优选，中空纤维素膜的规格为孔径小于0.22微米，材料为聚丙烯，比表面积大于0.54平方米；

进一步的，所述的厌氧食气微生物优选为厌氧食气梭菌；

更进一步的，所使用的培养基包括有2％-4％的mineral solution stock(V/V)，0.05％的酵母提取物(M/V)，0.5％的吗啉乙磺酸(M/V)，0.5％的reducing agent Stock(V/V)，0.1％的微量元素储存液(V/V)；

其中Mineral solution stock(M/V)的组成为：8％氯化钠，10％氯化铵，1％氯化钾，1％的磷酸二氢钾，2％的硫酸镁和0.4％的氯化钙。

Reducing Agent Stock(M/V)的组成为0.9％的氢氧化钠，4％的L-半胱氨酸盐酸盐和4％的九水硫化钠。

微量元素液储存液(M/V)的组成为1％的氨三乙酸，0.5％的硫酸镁，0.4％的硫酸亚铁铵，0.1％的氯化钴，0.1％的硫酸锌，0.01％的氯化铜，0.01％的氯化镍，0.01％的钼酸钠，0.01％的硒酸钠和0.01％的钨酸钠。

本发明在厌氧食气微生物气体发酵过程中，实现发酵罐与中空纤维素膜组件之间的互联，使发酵液在中空纤维素膜内腔和发酵罐之间形成循环，同时利用连接在中空纤维素膜组件外壁的蠕动泵，进行抽排，实现对发酵液的抽滤，截留菌体，后用新鲜培养基将附着在中空纤维素膜腔体内的菌体冲洗到发酵罐中，进行多次连续发酵。本发明能够提高厌氧食气梭菌在气体发酵过程中的生物量积累，有效增加利用合成气生产乙醇、丁醇和正己醇的产量。

附图说明

图1：本发明方法中空纤维素膜示意图；

图2：不使用本发明方法中空纤维素膜时的生物量和醇类物质产量；

图3：使用本发明的中空纤维素膜在平台期截留反冲发酵液后的生物量和醇类物质产量；

图4：使用本发明的中空纤维素膜在对数后期截留反冲发酵液后的生物量和醇类物质产量。

具体实施方式

本发明使用中空纤维素膜可有效的将发酵液中的菌体截留在内腔中，将发酵废液排出，解除发酵产物对细菌生长和产物合成的负反馈抑制；通过厌氧培养基储存罐中的新鲜培养基，可将附着在中空纤维素膜内腔上的菌体有效的冲洗回生物反应器中，实现菌体高活性的反复发酵。

本发明使用的发酵系统，包括厌氧培养基储存罐、中空纤维素膜组件和生物反应器三部分：厌氧培养基储存罐的大小与容量视发酵体积而定，罐口设定三个接头，分别为氮气进气口、氮气出气口和培养基出口，通过鼓吹氮气实现罐内的无氧环境，培养基出口与中空纤维素膜组件之间通过软橡胶管进行连接，利用蠕动泵实现培养基对中空纤维素膜组件的冲洗；生物反应器的大小与容量视具体发酵规模而定，具有搅拌桨以及控温、控pH、控氧化还原电势装置，可控制发酵过程中的温度、pH以及氧化还原电势(ORP)，反应器顶盖设置合成气进气口、合成气出气口、液体循环进口和液体循环出口，液体循环进口和液体循环出口分别与中空纤维素膜组件的上端和下端通过橡胶软管进行连接，利用蠕动泵实现发酵液在生物反应器和中空纤维素膜组件之间的循环。中空纤维素膜位于厌氧培养基储存罐和生物反应器中间(图1)，具有上端、下端两个接口和外壁两个接口，于外壁接口设置两台蠕动泵，当发酵液开始循环时，通过与外壁相连的两台蠕动泵进行抽滤，将发酵液排出，使发酵菌体附着在中空纤维素膜上，抽滤完毕后，启动新鲜培养基的冲洗程序，冲洗完毕后，于生物反应器中进行再次发酵，可有效提高厌氧食气微生物的生物量积累和醇类物质产量。

本发明使用的微生物为厌氧食气微生物，如Clostridium carboxidivorans菌株P7(DSM15243)购买自德国布伦瑞克的莱布尼兹研究所的德国微生物与细胞培养物保藏中心。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：

使用中空纤维素膜对平台期的发酵液进行截留反冲：在1L的发酵体系中，加入20ml的mineral solution stock，0.5g的酵母提取物和5g的吗啉乙磺酸，50ml reducingagent Stock，在121度高温灭菌20min。灭菌后冷却至70度左右，再加入1ml的微量元素储存液，用纯度为99.999％的氮气置换发酵罐以及新鲜培养基储存罐内的气体，氮气通入速度控制在500ml/min。等待发酵罐温度降低至37摄氏度左右时，安装好加热套、搅拌控制器，用耐压软管连接好中空纤维素膜组件、发酵罐以及新鲜培养基储存罐，关闭与发酵罐相连的氮气，始终保持与新鲜培养基储存罐相连的氮气。向发酵罐内通入模拟合成气(气体组成：50％CO、35％CO2、15％H2),气体流速控制在500 ml/min，将发酵罐温度控制在37摄氏度，搅拌速度控制在200rpm。完成发酵体系构建后，接入培养至对数生长期的Clostridiumcarboxidivorans P7菌株100mL，每隔一定时间取样进行菌体浓度和发酵产物检测。

当发酵到平台期时，开启发酵罐与中空纤维素膜组件之间的液体循环，同时开启中空纤维素膜组件外壁的蠕动泵，将滤出液排出，使菌体附着在中空纤维素膜内腔。

效果检测：

1、使用中空纤维素膜对平台期的发酵液进行截留反冲

生物量的检测采用紫外分光光度计，检测指标为600nm处吸光值。发酵液中的乙醇、丁醇浓度采用高效液相色谱进行测定，正己醇浓度采用高效气相色谱进行检测。

结果表明：当不使用中空纤维素膜进行发酵时，指数生长期维持总共3天，3天后进入平台期，最高的细胞浓度为1.2Abs，如图2所示；当不使用中空纤维素膜时，丁醇和己醇的产量非常低，几乎检测不到；当不使用中空纤维素膜时，乙醇的产量最高为0.6g/L。

而当使用中空纤维素膜对生长到平台期的发酵液进行截留，并用新鲜培养基进行冲洗和再发酵后，首先，细菌的有效发酵周期延长至10天，最高的细胞浓度为2.7Abs，相较于不使用中空纤维素膜提高了225％；其次，乙醇产量最高可达1.8g/L，相较于不使用中空纤维素膜，提高了300％；最后，丁醇产量最高达到了0.7g/L，己醇产量最高达到了0.25g/L，相较于不使用中空纤维素膜，实现了从无到有。

实施例2：

使用中空纤维素膜对指数后期的发酵液进行截留反冲：

培养基配制方法和步骤、装置连接方法和操作步骤与实施例1中一致，不同点在于将菌体截留的时间点提前到细菌生长状态的指数生长后期。

效果检测：

当使用中空纤维素膜对生长到指数后期的发酵液进行截留，并用新鲜培养基进行冲洗和再发酵之后，首先，细菌的有效发酵周期也延长到了10天，但是最高的细胞浓度达到了4.7Abs，是不使用中空纤维素膜时的3.9倍，乙醇产量最高达到了1.6g/L，相较于不使用中空纤维素膜，提高了2.7倍；丁醇产量最高达到了0.9g/L，相比于在平台期进行截留再发酵时，进一步提高了29％；正己醇产量最高达到了0.5g/L，相比于在平台期进行截留再发酵时，进一步提高了100％。

上述实施例中使用的培养基是申请人根据Clostridium carboxidivorans菌株P7(DSM15243)的理化特性进行配制的，相比于其它培养基能更有效的提高厌氧食气微生物Clostridium carboxidivorans菌株P7的发酵效率。

Claims

1.一种提高厌氧食气微生物发酵效率的方法,其特征在于，所述的方法是在发酵体系中对厌氧食气微生物的菌液用中空纤维素膜进行过滤截留，再用培养基对吸附于中空纤维素膜上的菌体进行反向冲洗后，对截留菌体再次进行发酵；

所述的培养基包括有2％-4％的mineral solution stock，0.05％的酵母提取物，0.5％的吗啉乙磺酸，0.5％的reducing agent Stock，0.1％的微量元素储存液；

所述的Mineral solution stock的组成为：8％氯化钠，10％氯化铵，1％氯化钾，1％的磷酸二氢钾，2％的硫酸镁和0.4％的氯化钙；

所述的Reducing Agent Stock的组成为0.9％的氢氧化钠，4％的L-半胱氨酸盐酸盐和4％的九水硫化钠；

所述的微量元素液储存液的组成为1％的氨三乙酸，0.5％的硫酸镁，0.4％的硫酸亚铁铵，0.1％的氯化钴，0.1％的硫酸锌，0.01％的氯化铜，0.01％的氯化镍，0.01％的钼酸钠，0.01％的硒酸钠和0.01％的钨酸钠；

所述的中空纤维素膜的孔径小于0.22微米；

所述的厌氧食气微生物为厌氧食气梭菌；

所述的方法使用的发酵系统，包括厌氧培养基储存罐、中空纤维素膜组件和生物反应器三部分：其中厌氧培养基储存罐的罐口设定三个接头，分别为氮气进气口、氮气出气口和培养基出口，通过鼓吹氮气实现罐内的无氧环境，培养基出口与中空纤维素膜组件之间通过软橡胶管进行连接，利用蠕动泵实现培养基对中空纤维素膜组件的冲洗；生物反应器具有搅拌桨以及控温、控pH、控氧化还原电势装置，反应器顶盖设置合成气进气口、合成气出气口、液体循环进口和液体循环出口，液体循环进口和液体循环出口分别与中空纤维素膜组件的上端和下端通过橡胶软管进行连接，利用蠕动泵实现发酵液在生物反应器和中空纤维素膜组件之间的循环；中空纤维素膜位于厌氧培养基储存罐和生物反应器中间，具有上端、下端两个接口和外壁两个接口，于外壁接口设置两台蠕动泵，当发酵液开始循环时，通过与外壁相连的两台蠕动泵进行抽滤，将发酵液排出，使发酵菌体附着在中空纤维素膜上，抽滤完毕后，启动新鲜培养基的冲洗程序，冲洗完毕后，于生物反应器中进行再次发酵。