CN105030820A - 纳米硒作为x射线放疗增敏剂的应用 - Google Patents
纳米硒作为x射线放疗增敏剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了纳米硒作为X射线放疗增敏剂的应用，本发明利用PEG溶解单质硒制备得到纳米硒、多糖及壳聚糖修饰的纳米硒、叶酸及转铁蛋白修饰的肿瘤靶向性纳米硒(SeNPs)。SeNPs具有X射线刺激响应特性，并能与X射线协同作用，高效抑制人宫颈癌细胞Hela、黑色素瘤细胞A375、成骨肉瘤细胞MG-63、乳腺癌细胞MCF-7及脑胶质瘤细胞C6等多种细胞的增殖。其机制主要是通过增强细胞内活性氧的累积，进而诱导细胞周期阻滞剂肿瘤细胞凋亡。结果提示，SeNPs可作为新型放疗增敏剂进行开发。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域，尤其是纳米硒作为X射线放疗增敏剂的应用。
背景技术
在过去的十几年里，放疗发展迅速并广泛应用用临床肿瘤治疗中。研究表明，大约50％的肿瘤病人都经历过放疗。然而目前对于放疗抑制肿瘤生长的机制知之甚少。更甚者，放疗治疗中容易导致肿瘤细胞对放疗产生耐受更加阻碍了疾病的治疗。宫颈癌是一种在女性中多发的恶性肿瘤，在宫颈癌的治疗中多采用化疗与放疗相结合的方式即放化疗进行治疗。不幸的是，宫颈癌对化疗药物和放疗都容易产生耐受。
化疗药物所带来的副作用极大地限制了其应用。基于这些缺陷，人们迫切需要寻找新的有效药物。在研发有效药物过程中，如何避免在抑制肿瘤的同时尽可能减少其副作用依然解决问题的重点和难点。其中靶向肿瘤细胞进行治疗是研究颇多然而进展非常有限的。例如，研究人员设计了靶向叶酸受体或者整合素受体的靶向药物或者以肿瘤细胞内特性性激活的前药等。在上述靶向策略中，光动力疗法和射线增敏剂的方案相对于外科手术治疗化疗来说是一种微创且行之有效的方法。其中，因利用临床上使用的计量、位置可控的射线作为协同增敏手段，射线增敏剂协同增敏放疗的方法较控制难、难以穿透机体光动力疗法更具有现实意义。同时，纳米技术的发展也促进了肿瘤细胞靶向和放疗增敏剂的发展。因此，寻找用于化放疗的纳米放疗增敏剂能实现选择性抑制肿瘤细胞和减少对正常组织损伤的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提出了纳米硒作为X射线放疗增敏剂的应用，包括制备放疗增敏剂的应用、制备具有放疗增敏效果的抗肿瘤药物的应用以及制备具有放疗增敏效果的抗肿瘤药物载体的应用。
本发明利用PEG溶解单质硒制备得到纳米硒(PEG-SeNPs)。PEG-SeNPs具有X射线(X-ray)刺激响应特性并能通过X-ray刺激高效抑制人宫颈癌细胞Hela增殖，而对照组PEGW-SeNPs、PVP-SeNPs不具备这种特性。PEG-SeNPs与X-ray协同作用上调ROS的产生并激活p53的磷酸化、抑制p21的方式通过凋亡和进程最终诱导Hela细胞凋亡和G2/M抑制。抑制通过调控与治疗耐受相关的蛋白，如VEGF、VEGF2和XRCC-1等抑制Hela增殖。结果提示，PEG-SeNPs具有潜在的作为有效的新型CRT改善宫颈癌的治疗效果。
本发明通过PEG的修饰，制备了X-ray响应的PEG-SeNPs，增强了X-ray的对Hela细胞增殖抑制效果。进一步的研究表明，PEG-SeNPs与X-ray共同作用在Hela细胞内产生过量的活性氧造成氧化损伤，进而抑制Akt、Erk的磷酸化并活化JNK，同时也激活ATM并最终汇聚放大激活p53，再分别通过p21产生G2/M期周期抑制及通过线粒体信号通路诱导Hela细胞凋亡。
本发明还发现：多糖及壳聚糖修饰的纳米硒、叶酸及转铁蛋白修饰的肿瘤靶向性纳米硒(以下简称SeNPs)均有X射线(X-ray)刺激响应特性，并能与X-ray协同作用，高效抑制人宫颈癌细胞Hela、黑色素瘤细胞A375、成骨肉瘤细胞MG-63、乳腺癌细胞MCF-7及脑胶质瘤细胞C6等多种细胞的增殖。其机制主要是通过增强细胞内活性氧的累积，进而诱导细胞周期阻滞剂肿瘤细胞凋亡。
附图说明
图1为三种纳米硒即PEG-SeNPs、PEGW-SeNPs、PVP-SeNPs的TEM形貌表征；
图2为电子束对三种纳米硒形貌的影响(A1-3)PEG-SeNPs；(B)PEGW-SeNPs；(C)PVP-SeNPs；
图3为PEG-SeNPs的元素分析(A)，晶形表征(B)；
图4中(A)为MTT法检测PEG-SeNPs、PEGW-SeNPs、PVP-SeNPs与X-ray共同对Hela细胞的抑制率；(B)为PEG-SeNPs与X-ray共同处理对Hela细胞活性形态的影响；(C)为Hela细胞对PEG-SeNPs、PEGW-SeNPs、PVP-SeNPs的细胞吸收率；
图5中(A)为流式细胞术分析PEG-SeNPs与X-ray共同作用后对Hela细胞周期的影响；(B)为Westernblotting分析PEG-SeNPs与X-ray共同作用对Hela细胞PARP、Caspase-3、CyclinB1、p21表达水平评估；
图6中(A)为X-ray处理前后对进入Hela细胞内PEG-SeNPs的影响；(B)为X-ray对PEG-SeNPs形貌的影响；
图7为X-ray与纳米硒共同作用对细胞内ROS水平的影响；
图8中(A，B)为荧光染色细胞共定位观察；(C)为ICP-AES检测PEG-SeNPs进入Hela细胞的时间效应；
图9为PEG-SeNPs和X-ray协同诱导Hela细胞的p53磷酸化；
图10为PEG-SeNPs和X-ray协同作用对诱导Hela细胞的MAPKs家族蛋白的影响；
图11为X-ray与纳米硒共同作用对Hela细胞线粒体的影响；
图12为PEG-SeNPs和X-ray协同诱导对Hela细胞的Bcl-2家族蛋白的影响；
图13为PEG-SeNPs和X-ray协同诱导对Hela细胞的NRF2、TrxR、VEGF、XRCC-1的影响。
图14为MG-63细胞经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量(A)4Gy，(B)6Gy处理48h后的细胞存活率对比。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)；
图15为经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量处理48h后MG-63细胞细胞周期的改变；
图16为经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量处理后MG-63细胞内活性氧水平的时间变化。细胞经功能化纳米硒预处理6h后接受放疗，细胞内活性氧水平利用DCFH-DA检测；
图17为HeLa细胞经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量(A)4Gy，(B)6Gy处理48h后的细胞存活率对比。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)；
图18为经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量处理48h后HeLa细胞细胞周期的改变；
图19为A375细胞经不同剂量的多糖纳米硒和不同放射剂量(A)4Gy，(B)6Gy处理后的细胞存活率对比。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)。
图20为经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量处理48h后A375细胞细胞周期的改变；
图21.MCF-7细胞经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量(A)4Gy，(B)6Gy处理48h后的细胞存活率对比。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)。
图22为经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量处理48h后MCF-7细胞细胞周期的改变。
图23为经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量处理后MCF-7细胞内活性氧水平的时间变化。细胞经功能化纳米硒(32μM)预处理6h后接受放疗，细胞内活性氧水平利用DCFH-DA检测。
图24为C6细胞经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量(A)4Gy，(B)6Gy处理72h后的细胞存活率对比。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)。
图25为经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量处理72h后C6细胞细胞周期的改变。
图26为经不同浓度的功能化纳米硒和放射剂量处理后C6细胞内活性氧水平的时间变化。细胞经功能化纳米硒预处理6h后接受放疗，细胞内活性氧水平利用DCFH-DA检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1纳米硒的制备及表征
本实施例设计合成了三种纳米硒，分别是物理法溶解灰硒制备的聚乙二醇(PEG)分散的纳米硒(PEG-SeNPs)，利用维生素C(VC)还原亚硒酸(H2SeO3)或者亚硒酸钠(Na2SeO3)，再利用PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修饰纳米硒，即制得(PEGW-SeNPs，PVP-SeNPs)，并分别检测它们对射线的响应性，选择最优材料进行进一步的活性筛选，并研究其与X射线共作用机制。
(1)PEG-SeNPs制备：参考文献[ZhengSY，LiXL，ZhangYB，XieQ，WongYS，ZhengWJ，etal.PEG-nanolizedultrasmallseleniumnanoparticlesovercomedrugresistanceinhepatocellularcarcinomaHepG2cellsthroughinductionofmitochondriadysfunction.IntJNanomed.2012；7：3939-49]。具体的，在磁力搅拌下，将一定量的灰硒分散于PEG中(比例为1∶10-100)，加热至150-250℃，并维持10-120min，高温体系迅速冷却，得到产物经过透析后得到PEG-SeNPs。
(2)PEGW-SeNPs制备：将H2SeO3或者Na2SeO3(终浓度1-5mM)与PEG(0.5-10mg/ml)混合均匀后，加入Vc(Vc与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物PEGW-SeNPs。
根据以上条件，也可将PEG先与Vc混合，再滴入H2SeO3或者Na2SeO3，同样可制得产物PEGW-SeNPs。
(3)PVP-SeNPs制备：将H2SeO3或者Na2SeO3(终浓度1-5mM)与PVP(0.5-10mg/ml)混合均匀后，加入Vc(Vc与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物PVP-SeNPs。
根据以上条件，也可将PVP先与Vc混合，再滴入H2SeO3或者Na2SeO3，同样可制得产物PVP-SeNPs。
从图1可见，三种纳米硒(PEG-SeNPs、PEGW-SeNPs和PVP-SeNPs)分散较均匀，粒径较均一，为进一步的研究提供了基础。
通过TEM电镜的观察，我们发现PEG-SeNPs对TEM的电子束不稳定。从图2A1-3可见，PEG-SeNPs在电子束的照射下，从黑色光滑的圆球变成形状不规则且中空的结构。从图2B，C可见，在相同的条件下，PEGW-SeNPs和PVP-SeNPs却能在电子束的照射下能稳定存在，且保持原有的形貌。通过这一观察，我们发现了所制备了PEG-SeNPs独特的光电性质即对电子束不稳定。
我们通过HR-TEMEDX-mapping的方法，对所制备的PEG-SeNPs作了进一步的分析。从图3A可见，PEG-SeNPs在元素分析测试过程中依然不稳定，出现了形貌的改变也出现了中空结构，这一现象与前面TEM观测相吻合，且从元素的分析的结果可见，PEG-SeNPs主要含有C、O和Se，其中C布满整个元素分析的选取，这可能是由于背景是碳膜的原因。而氧与硒元素交错在一起，表明了PEG对PEG-SeNPs的修饰和稳定作用，且从图可见氧较硒元素分布更广，我们推测从图2中观察到的空腔白膜可能是由PEG等外层修饰剂构成。进一步通过XRD分析，PEG-SeNPs从作为硒源的灰硒转变成为无定形结构，这可能是由于PEG在体系中穿插造成的。
实施例2PEG-SeNPs与X-ray共作用体外抗宫颈癌肿瘤活性研究
基于PEG-SeNPs的电子射线的敏感性特征，我们期待开发PEG-SeNPs在放疗领域的应用。本实施例我们研究了三种纳米硒PEG-SeNPs、PEGW-SeNPs和PVP-SeNPs与放疗共同作用的体外抗肿瘤活性研究。在Hela细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，在临床的X-ray放疗仪器上施加8Gy的放疗处理。从图4A可见，单独三种纳米硒的处理组发现，PEG-SeNPs、PEGW-SeNPs和PVP-SeNPs对Hela细胞的抑制率相近，没有显著差别。而当与X-ray(8Gy)共同处理后，PEGW-SeNPs和PVP-SeNPs联合处理组的细胞抑制率没有明显的改变，而PEG-SeNPs与X-ray联合作用后，低浓度的PEG-SeNPs有非常明显的细胞抑制作用。从图4B可见，联合PEG-SeNPs与X-ray处理后导致细胞密度明显的减少且呈现剂量效应。有意思的是，通过ICP-AES分析，发现PVP-SeNPs进入Hela细胞内的量是PEG-SeNPs处理组的3倍，然而其细胞抑制率没有明显的改变，且其放疗增敏的效果并不明显。
通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过PEG-SeNPs和X-ray处理的Hela的细胞周期，我们发现单独X-ray处理组引起了明显的G2/M期阻滞，从对照组的15.3％增加至64.6％，但凋亡峰没有明显的增加即从对照组的4.9％改编为3.8％，可见单独的放疗处理主要是引起G2/M期的细胞周期阻滞。而单独的PEG-SeNPs处理组仅仅微弱的引起Sub-G1峰的增加，即从对照组的4.9％增加至9.5％。联合放疗与PEG-SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至36.8％即增加了7倍，且引起了G2/M期的阻滞。流式细胞周期分析的结果提示联合放疗与PEG-SeNPs可能是通过诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的方式抑制Hela细胞的增殖。
通过Westernblotting检测细胞内蛋白表达的改变，我们确认了细胞凋亡和G2/M期周期阻滞的发生。图5B表明，联合放疗与PEG-SeNPs的体系即能更有效激活PARP和Caspase3，且通过活化CyclinB1与p21产生G2/M期的阻滞。上述结果与前述结果相符合即联合放疗与PEG-SeNPs能有效诱导Hela细胞凋亡和发生G2/M期阻滞从而抑制Hela细胞增殖。
实施例3X-ray(8Gy)对PEG-SeNPs的影响
从图6A可见，经过6h的处理，PEG-SeNPs进入Hela细胞并充满细胞质且从核染色的结果可见，PEG-SeNPs主要分布在细胞质而非细胞核。有意思的是，通过8Gy的放疗处理，聚集在Hela细胞内的绿色荧光变淡而细胞核的蓝色依然可见。我们推测这是由于PEG-SeNPs对X-ray敏感后再细胞内解体分散影响了绿色荧光的强度。从图6B的结果可见，经过X-ray(8Gy)处理，我们也观察到PEG-SeNPs的形貌改变。
我们研究了不同纳米硒经过放疗处理以及PEG-SeNPs进入Hela细胞后产生ROS的水平。从图7可见，无细胞的模型中PEG-SeNPs产生的ROS的水平更高，且在细胞模型中PEG-SeNPs在经过放疗处理后产生ROS的水平较无细胞模型的低，我们认为这种降低时由于产生的ROS被细胞部分清除所致。且细胞模型中PEG-SeNPs产生的ROS较无细胞的模型中PEGW-SeNPs和PVP-SeNPs依然为高，我们推测是由于PEG-SeNPs的X-ray敏感特性提供了更大量的ROS所致。
上述结果表明，我们制备得到的PEG-SeNPs具有X-ray敏感的特性，且这一特性在进入细胞后依然存在。且由于这种X-ray响应的特性导致其在细胞内能产生过量的ROS并最终抑制Hela细胞的增殖。
实施例4PEG-SeNPs的细胞吸收及细胞内定位
通过荧光同定位实验，本实施例探讨了Hela细胞对于PEG-SeNPs的吸收过程。从图8A可见，PEG-SeNPs在1h后已经进入细胞，并于6h后扩散至细胞质，并充满整个细胞。从实验结果发现过程中药物的绿色荧光没有与细胞核的蓝色荧光相互重叠，可以认为PEG-SeNPs没有进入细胞核，且这一进入细胞过程呈现时间效应。从图8B放大的图片可见，PEG-SeNPs逐渐增多且未进入细胞核。通过进一步的ICP-AES的细胞内硒含量的分析，我们也确认了在6h后PEG-SeNPs进入细胞接近最大量且随后量的增速降低。
实施例5X-ray与PEG-SeNPs共作用抑制Hela细胞增殖的机制
WesternBlotting结果显示(如图9所示)联合放疗与PEG-SeNPs的体系更有效产造成DNA损伤后激活Histone磷酸化并活化ATM和其下游p53信号通路。且联合放疗与PEG-SeNPs的体系能更有效抑制Akt活化(如图10所示)。通过进一步的研究分析，我们发现联合放疗与PEG-SeNPs的体系能更有效活化JNK并抑制Akt活化(图10)。
研究表明，细胞凋亡的线粒体信号通路和死亡受体信号通路均受p53的调节。前述结果表明，联合放疗与PEG-SeNPs的体系能有效激活p53的磷酸化，故我们采用荧光染色的方法观察Hela细胞线粒体的形态。从图11可见，对照组的线粒体为完整的丝状，而经过X-ray处理后线粒体断裂溶解，表明线粒体的损伤，且在PEG-SeNPs组中也观察到线粒体损伤。通过对比发现联合放疗与PEG-SeNPs会产生更加严重的线粒体断裂溶解现象。有意思的是仅经过放疗处理组在48h后线粒体有一定的恢复，但依然可见处在细胞内存在多细胞核。
经过联合放疗与PEG-SeNPs处理，我们检测到促凋亡蛋白Bax和Bad表达的上调，且Bax上调更强烈，而促生存蛋白的Bcl-2的下降，其中Bcl-xL未见明显改变(如图12所示)。
近年来，研究发现NRF2是机体抵抗内外界氧化和化学等刺激的重要防御性蛋白。经过联合放疗与PEG-SeNPs处理，我们检测到NRF2明显的下调(图13)。Trx、TrxR构成的硫氧还蛋白系统是哺乳动物体内最重要的氧化还原调节系统之一。恶性肿瘤细胞分泌的VEGF表达水平与肿瘤瘤体微血管密度及恶性程度成正相关。XRCC-1广泛参与DNA损伤的修复，且发现在放疗的病人中通常高表达该蛋白的病人治愈率降低。本发明研究也发现，联合处理组对Trx、TrxR均有明显的下调作用，且对血管生成因子受体及XRCC-1均有下调作用。这提示我们，PEG-SeNPs可以作为放疗增敏剂提高放疗的治疗效果。
实施例6PEG-SeNPs与X-ray共作用体外抗成骨肉瘤的活性研究
PEG-SeNPs制备：参考文献[ZhengSY，LiXL，ZhangYB，XieQ，WongYS，ZhengWJ，etal.PEG-nanolizedultrasmallseleniumnanoparticlesovercomedrugresistanceinhepatocellularcarcinomaHepG2cellsthroughinductionofmitochondriadysfunction.IntJNanomed.2012；7：3939-49]。具体的，在磁力搅拌下，将一定量的灰硒分散于PEG中(灰硒和PEG摩尔比例为1∶10-100，以下为作说明的均为摩尔比例)，加热至150-250℃，并维持10-120min，高温体系迅速冷却，得到产物经过透析后得到PEG-SeNPs。
本实验我们研究了PEG-SeNPs与放疗共同作用的体外抗成骨肉瘤活性。在MG-63细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、4和6Gy的放疗处理。从图14可见，细胞经单独SeNPs(4μM)处理后，细胞存活率在最高浓度下才下降至44％。当细胞经X-ray处理后发现，对MG-63细胞的抑制率相近，没有显著差别。SeNPs与X-ray联合处理组中，放射剂量在2和4Gy无明显的增敏效果。但当X-ray的剂量达到6Gy时，联合处理组显现出明显的细胞抑制作用。从图14B可见，SeNPs(1μM)联合X-ray处理后导致细胞存活率由78％降至22％且呈现剂量效应。
通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过SeNPs和X-ray处理的MG-63的细胞周期。从图15可知，单独X-ray处理组引起了不同程度的凋亡，Sub-G1峰从对照组的2.3％增加至20％，而G2/M峰只有轻微的改变，可见单独的放疗处理主要是引起MG-63细胞的凋亡。而单独的SeNPs处理组也仅仅引起了凋亡峰增加，即凋亡峰从对照组的2.3％增加至14.7％。联合放疗与SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至20.6％，同事还引起了G2/M期的阻滞，在6Gy和16μM下可以上升到44％左右。流式细胞周期分析的结果提示联合放疗与SeNPs可能是通过诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的方式抑制MG-63细胞的增殖。
MG-63细胞经SeNPs预处理6h后，经不同放射剂量联合处理后，细胞内活性氧(ROS)水平呈现不同程度的改变(图16)。细胞经处理后，加入DCFH-DA探针孵育30min后，用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平。细胞经单独的SeNPs或X-ray处理后，细胞内ROS水平只有小幅度的升高。相对于2和4Gy，SeNPs(64μM)在放疗剂量为6Gy时，可使细胞内ROS水平大幅提升，最高达到144％左右。ROS水平先急剧升高，后随着时间而下降。
实施例7CS-SeNPs与X-ray共作用体外抗肿瘤活性研究
1、纳米硒的制备：参考文献BoYu，YiboZhang，WenjieZheng*，CundongFan，TianfengChen*.PositiveSurfaceChargeEnhancesSelectiveCellularUptakeandAnticancerEfficacyofSeleniumNanoparticles.InorganicChemistry.2012，51(16)，8956-8963。
将H2SeO3或者Na2SeO3(终浓度1-5mM)与壳聚糖(CS，0.1-10mg/ml)混合均匀后，加入Vc(Vc与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物CS-SeNPs。
根据以上条件，也可将CS先与Vc混合，再滴入H2SeO3或者Na2SeO3，同样可制得产物CS-SeNPs。
2、纳米硒对X-ray的增敏活性
基于SeNPs的电子射线的敏感性特征，我们期待开发SeNPs在放疗领域的应用。本实验我们研究了功能化的纳米硒(SeNPs)与放疗共同作用的体外抗肿瘤活性研究。在HeLa细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、4和6Gy的放疗处理。从图17可见，细胞经单独SeNPs(8μM)处理后，细胞存活率下降至55.95％。当细胞经X-ray处理后发现，对HeLa细胞的抑制率相近，没有显著差别。SeNPs与X-ray联合处理8组中，放射剂量在2和4Gy无明显的增敏效果。但当X-ray的剂量达到6Gy时，联合处理组显现出明显的细胞抑制作用。从图17B可见，SeNPs(8μM)联合X-ray处理后导致细胞存活率由55.95％降至27.35％且呈现剂量效应。
通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过SeNPs和X-ray处理的HeLa的细胞周期。从图18可知，单独X-ray处理组只是引起了轻微的改变，可见单独的放疗处理作用效果不明显。而单独的SeNPs处理组引起了凋亡峰，即凋亡峰从对照组的0.3％增加至15.2％。联合放疗与SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至43.3％，且引起了G2/M期的阻滞，G2/M峰从对照组的16.7％增加至42.7％。流式细胞周期分析的结果提示联合放疗与SeNPs可能是通过诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的方式抑制HeLa细胞的增殖。
实施例8PTR-SeNPs与X-ray抗肿瘤黑素瘤活性研究
1、纳米硒的制备：参考文献：HualianWu，XiaolingLi，WenLiu，TianfengChen＊，YinghuaLi，WenjieZhengandKa-HingWong*.Surfacedecorationofseleniumnanoparticlesbymushroompolysaccharides-proteincomplexestoachieveenhancedcellularuptakeandanticanceractivity.JournalofMaterialsChemistry，2012，22，9602-9610。
将H2SeO3或者Na2SeO3(终浓度1-5mM)与虎奶菇菌核多糖-蛋白复合物(PTR，0.1-10mg/ml)混合均匀后，加入Vc(Vc与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物PTR-SeNPs。
根据以上条件，也可将PTR先与Vc混合，再滴入H2SeO3或者Na2SeO3，同样可制得产物PTR-SeNPs。
在常温常压下，在虎奶菇菌核多糖-蛋白复合物(PTR)水溶液中加入维生素C溶液，混合均匀，然后滴加亚硒酸钠溶液，边滴加边混匀，定容后待产物中所出现的红色不再加深，即可得到具有抗肿瘤活性的虎奶菇菌核多糖-蛋白复合物功能化纳米硒溶胶。此合成方法中反应体系简单、条件温和、反应时间，都是绿色合成方法。通过TEM、SEM、HR-TEM等电镜手段观察对纳米粒子的形貌，用粒度分析仪测试纳米硒稳定性。
2、纳米硒对X-ray的增敏活性
基于SeNPs的电子射线的敏感性特征，我们期待开发SeNPs在放疗领域的应用。本实验我们研究了功能化的纳米硒(SeNPs)与放疗共同作用的体外抗肿瘤活性研究。在A375细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、4和6Gy的放疗处理。从图19可见，细胞经单独SeNPs(8μM)处理后，细胞存活率下降至11.3％。当细胞经X-ray处理后发现，经X-ray2Gy、4Gy、6Gy照射后，细胞存活率分别下降至39.7％、24.8％、18.1％。SeNPs与X-ray联合处理组中，放射剂量在2Gy无明显的增敏效果。但当X-ray的剂量达到4Gy和6Gy时，联合处理组显现出明显的细胞抑制作用。。
通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过SeNPs和X-ray处理的A375的细胞周期。从图20可知，单独X-ray处理组同时引起了凋亡峰与G2/M峰增加，Sub-G1峰从对照组的1.3％增加至3.1％，而G2/M峰从对照组的15.9％增加至24.8％。单独的SeNPs处理组也同时引起了凋亡峰与G2/M峰增加，即凋亡峰从对照组的1.3％增加至7.3％，G2/M峰从从对照组的15.9％增加至29.4％。可见单独的放疗处理和单独SeNPs处理都同时引起A375细胞的凋亡和阻滞。联合放疗与SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至5.2％，G2/M峰增加至46.6％。流式细胞周期分析的结果提示联合放疗与SeNPs可能是通过诱导G2/M期阻滞的方式抑制A375细胞的增殖。
实施例9功能化纳米硒FACS-SeNPs与X-ray体外抗乳腺癌活性研究
1、纳米硒的制备：参考以下文献
BoYu，XiaolingLi，WenjieZheng，*YanxianFeng，Yum-ShingWongandTianfengChen*.pH-ResponsiveCancer-targetedSeleniumNanoparticles：ATransformableDrugCarrierwithEnhancedTheranosticEffects，J.Mater.Chem.B，2014，2(33)，5409-5418。反应步骤如下：
(1)CS偶联叶酸(CS-FA)的制备：称取适量的FA溶解于DMSO中(FA终浓度为10-50毫克/毫升)，加入适量的NHS和EDC(FA∶NHS∶EDC＝1∶0.5-2∶0.5-2)搅拌反应2-24小时以活化叶酸，后加入壳聚糖溶液(终浓度为0.1-10毫克/毫升)混合均匀，搅拌反应12-48小时后，透析12-48小时，得到FACS溶液。
(2)将H2SeO3或者Na2SeO3(终浓度1-5mM)与FACS(0.1-10mg/ml)混合均匀后，加入Vc(Vc与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物FACS-SeNPs。该产物具有叶酸靶向及pH控释的双重功能。
根据以上条件，也可将FACS先与Vc混合，再滴入H2SeO3或者Na2SeO3，同样可制得产物FACS-SeNPs。
2、纳米硒对X-ray的增敏活性
基于SeNPs的电子射线的敏感性特征，我们期待开发SeNPs在放疗领域的应用。本实验我们研究了功能化的纳米硒(SeNPs)与放疗共同作用的体外抗肿瘤活性研究。在MCF-7细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、4和6Gy的放疗处理。从图21可见，细胞经单独SeNPs(8μM)处理后，细胞存活率下降至54.3％。当细胞经X-ray处理后发现，对MCF-7细胞的抑制率相近，没有显著差别。SeNPs与X-ray联合处理组中，放射剂量在2和4Gy无明显的增敏效果。但当X-ray的剂量达到6Gy时，联合处理组显现出明显的细胞抑制作用。
通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过SeNPs和X-ray处理的MCF-7的细胞周期。从图22可知，单独X-ray处理组引起了不同程度的凋亡，Sub-G1峰从对照组的2.3％增加至14.7％，而G2/M峰只有轻微的改变，可见单独的放疗处理主要是引起MCF-7细胞的凋亡。而单独的SeNPs处理组同时引起了凋亡峰与G2/M峰增加，即凋亡峰从对照组的2.3％增加至12.2％，G2/M峰从从对照组的24.2％增加至32.9％。联合放疗与SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至36.4％，且引起了G2/M期的阻滞。流式细胞周期分析的结果提示联合放疗与SeNPs可能是通过诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的方式抑制MCF-7细胞的增殖。
MCF-7细胞经SeNPs预处理6h后，经不同放射剂量联合处理后，细胞内活性氧(ROS)水平呈现不同程度的改变(图23)。细胞经处理后，加入DCFH-DA探针孵育30min后，用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平。细胞经单独的SeNPs或X-ray处理后，细胞内ROS水平只有小幅度的升高。相对于2和4Gy，SeNPs(32μM)在放疗剂量为6Gy时，可使细胞内ROS水平大幅提升，最高达到221.4％。ROS水平先急剧升高，后随着时间而下降。
实施例10功能化TfSeNPs/Dox与X-ray体外抗脑胶质瘤活性研究
1、纳米硒的制备：参考文献
YanyuHuang，LizhenHe，WenLiu，CundongFan，WenjieZheng*，Yum-ShingWong，TianfengChen＊.SelectiveCellularUptakeandInductionofApoptosisofCancer-targetedSeleniumNanoparticles.Biomaterials，2013，34，7106-7116.
(1)将Na2SeO3溶液(终浓度为1-10mM)、CS储备液(终浓度为0.01-0.1mg/mL)和阿霉素的DMSO储备液(终浓度为10mM-100mM)均匀混合后，缓慢滴入Vc溶液(Na2SeO3与Vc的摩尔比为1∶3-10)中，得到CS-SeNPs-DOX溶液。
(2)制备Tf-EDC：EDC溶液与转铁蛋白(Tf)溶液混合(EDC∶Tf＝0.5-4∶1)，在磁力搅拌下充分反应2-24h，透析12-48小时，得到Tf-EDC溶液。
(3)将CS-SeNPs-DOX与Tf-EDC按1∶1-4充分混合反应12-48，透析12-48小时，即得产物TfSeNPs/Dox。
2、纳米硒对X-ray的增敏活性
基于SeNPs的电子射线的敏感性特征，我们期待开发SeNPs在放疗领域的应用。本实验我们研究了功能化的纳米硒(SeNPs)与放疗共同作用的体外抗肿瘤活性研究。在C6细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、4和6Gy的放疗处理。从图24可见，细胞经单独SeNPs(8μM)处理后，细胞存活率下降至45.3％。当细胞经X-ray处理后发现，对MCF-7细胞的抑制率相近，没有显著差别。SeNPs与X-ray联合处理组中，放射剂量在4Gy无明显的增敏效果(图24A)。但当X-ray的剂量达到6Gy时，联合处理组显现出明显的细胞抑制作用。从图24B可见，SeNPs(8μM)联合X-ray处理后导致细胞存活率由45.3％降至14.6％且呈现剂量效应。
通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过SeNPs和X-ray处理的C6的细胞周期。从图25可知，单独X-ray处理组引起了不同程度的凋亡，Sub-G1峰从对照组的1.9％增加至56.1％，而G2/M峰只有轻微的改变，可见单独的放疗处理主要是引起C6细胞的凋亡。联合放疗与SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至80.8％。流式细胞周期分析的结果提示联合放疗与SeNPs可能是通过诱导细胞凋亡抑制C6细胞的增殖。
C6细胞经SeNPs预处理6h后，经不同放射剂量联合处理后，细胞内活性氧(ROS)水平呈现不同程度的改变(图26)。细胞经处理后，加入DCFH-DA探针孵育30min后，用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平。细胞经单独的SeNPs或X-ray处理后，细胞内ROS水平只有小幅度的升高。相对于2和4Gy，SeNPs(32μM)在放疗剂量为6Gy时，可使细胞内ROS水平大幅提升，最高达到190.1％。ROS水平先急剧升高，后随着时间而下降。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.纳米硒作为X射线放疗增敏剂的应用。
2.纳米硒在制备X射线放疗增敏剂中的应用。
3.纳米硒在制备具有X射线放疗增敏效果的抗肿瘤药物中的应用。
4.纳米硒在制备具有X射线放疗增敏效果的抗肿瘤药物载体中的应用。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述纳米硒具有X射线刺激响应特性，所述纳米硒能通过X-ray刺激高效抑制人宫颈癌细胞Hela增殖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纳米硒是利用PEG溶解单质硒制备得到的纳米硒PEG-SeNPs。
7.根据权利要求1-4所述的应用，其特征在于，纳米硒还包括多糖及壳聚糖修饰的纳米硒、叶酸及转铁蛋白修饰的肿瘤靶向性纳米硒。
8.根据权利要求1-4所述的应用，其特征在于，适应的肿瘤包括宫颈癌、黑色素瘤、成骨肉瘤、乳腺癌及脑胶质瘤。
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