CN105026419B - 疫苗组合物定量 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了方法和用于所述方法的质量‑标记的肽,所述方法用于对制剂的样品中存在的一或多种病毒蛋白进行定量,所述制剂的样品中含有结合所述病毒蛋白的物质,其中所述方法使用质谱分析所述样品和含有已知量的标记的和未标记的特征肽的标准物,特别是其中所述病毒蛋白是针对猪圆环病毒的疫苗中的抗原。
Description
背景技术
为了减少动物的压力以及节省劳动力成本,期望用尽可能少的剂量给动物接种疫苗以达到效果。期望有针对多种病原体的组合疫苗递送有效量的针对各病原体的抗原。从业者和生产者可以在即将接种疫苗前通过混合针对多个各种病原体的抗原来实现组合疫苗。但是,本领域的此种制备可以引起混合误差,而且并不确定抗原的组合彼此之间能相容。
期望会有针对多种病原体的预混合的组合疫苗,从而可以降低潜在的剂量误差并且针对各种病原体的有效剂量的抗原能够可靠地递送至对象。
为了降低生产成本,期望疫苗生产流水线化。例如,在收获前或者在将多种免疫原性组合物混合在一起之前检查所期望的免疫原性材料的细胞培养物的质量,能够减少差异和浪费。
为了获得治疗性免疫原性组合物(例如,疫苗)的监管许可,以及基于安全的原因,需要监控抗原质量和组合物稳定性的手段。从历史上来说,该方法都是基于ELISA的。ELISA需要使用针对所要测量抗原的适宜抗体。但是,基于ELISA的方法会遇到一些阻碍:(1)并不是总有适宜的抗体可用;以及(2)这些方法并不总是能够对复杂的生物治疗剂进行可靠的定量和准确的定量(例如±10%的偏差)。在疫苗中存在多种抗原时,后面这种阻碍尤其会成问题。
然而,对于要成为商业产品的组合疫苗,组合抗原的参考稳定性必须在该组合中能够得到确认。也即,各抗原在混合之后其每个的量都必须是随着时间能够确定的,以确保每个剂量中存在期望量的各种抗原。
在一些组合疫苗中,个别疫苗制剂可能含有元件,其干扰其它疫苗成分使用标准技术的检测。例如,组合疫苗可含有第一种和第二种抗原,其中第二种抗原配方中可能包括来自动物的血清,所述动物已暴露于含第一种抗原的生物体,或者所述动物已接受过与第一种抗原相同的或抗原性类似的抗原的接种。在这种情况下,第一种抗原可能已经激发了特异于该第一种抗原的竞争性抗体的产生;因而,第二种抗原配方中存在的血清可能含有针对第一种抗原的抗体并且这些抗体也可存在于所述组合疫苗中。因此,用于在单一组分疫苗中监测第一种疫苗的参考稳定性的标准免疫学手段(也即,ELISA)将不足以确定所得的组合疫苗的稳定性。在缺乏适宜的ELISA测定法的情况下,将在宿主动物中进行临床研究来确定抗原的稳定性和疫苗的效力。所述临床研究会涵盖统计学上相当数量的动物在受攻击之后的疫苗接种。进行临床研究是昂贵的,包括动物的花费、对合适住房(生物容纳)的需求、以及在研究期间对收集的临床样品的测试。需要另外的手段,其适于检测大规模生产以及适于可靠地确定组合疫苗中各种抗原的最终浓度。
发明概述
本发明提供了方法和组合物,例如,优选经标记的特定的肽,用于在所述方法中对样品中的一或多种目标蛋白(优选病毒蛋白)的存在进行定量,优选所述样品是含有结合所述目标蛋白的物质的制剂的样品,其中使用质谱分析所述样品以及优选含有已知量的标记的或未标记的特征肽(signature peptide)的标准物。
在优选的实施方案中,本发明是对制剂样品中的一或多种病毒蛋白的存在进行定量的方法,所述制剂中含有结合所述病毒蛋白的物质,所述方法包括:
(a)用蛋白酶消化所述样品;
(b)加入已知量的至少一种稳定同位素标记的特征肽,其特异于所述样品中的至少一种病毒蛋白,其中所述特征肽是通过确定以下而经过预先选择的:
i.所述特征肽特异于要定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物;
ii.在所述病毒蛋白缺失时,所述特征肽从所述制剂的蛋白酶消化物中特异性缺失;
iii.所述特征肽在质谱分析中产生强信号;和
iv.所述特征肽在质谱分析中产生可区别的信号;
(c)对所述样品和含有已知量的标记的和未标记的特征肽的标准物运行质谱分析;和
(d)通过比较样品质谱分析的结果和标准物的结果确定所述疫苗
制剂样品中所述病毒蛋白的量。
在另外的优选实施方案中,所述蛋白是猪圆环病毒(PCV)的ORF2。
在另外的优选实施方案中,所述蛋白是PCV2的ORF2,所述特征肽是以下的一或多种:
i.NVDHVGLGTAFENS[KC13N15](SEQ ID NO:4),和
ii.VEFWPCSPITQGD[RC13N15](SEQ ID NO:24)。
在另外的实施方案中,蛋白是PCV2亚型,例如,PCV2a和PCV2b的ORF2的混合物。
在另外的优选实施方案中,所述方法还包括:在蛋白酶消化之后,免疫纯化所述病毒蛋白消化物,或者使所述制剂通过尺寸排阻层析柱并基于分子大小从含有制剂中其它化合物的级分中选择出从柱洗脱下的含有病毒蛋白的级分。
在另外的实施方案中,使用至少两种稳定同位素标记的特征肽,其中第一种特征肽用于对制剂中的病毒肽进行定量而第二种特征肽用于对制剂中的肽的稳定性进行定性测定。
另一个实施方案是制备含有一或多种病毒免疫原的疫苗制剂或免疫原性制剂的方法,其中所述疫苗或免疫原性制剂含有结合第一种免疫原性组合物中病毒蛋白的物质,所述方法包括使用多反应监测-质谱(MRM-MS)以用于一或多种制剂的定性和定量测定或者用于质量控制测定。免疫原性组合物可包含病毒抗原和/或细菌抗原。
另一个优选的实施方案包括上文所述的方法,其中MRM-MS包括:
(a)用蛋白酶消化疫苗或免疫原性制剂的样品;
(b)向所述样品中加入已知量的至少一种稳定同位素标记的特征肽,所述特征肽特异于至少一种病毒蛋白,其中所述特征肽是通过确定以下而预先选择的:
i.所述特征肽特异于所要定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物;
ii.在所述病毒缺失时,所述特征肽从所述制剂的蛋白酶消化
物中特异性缺失;
iii.所述特征肽在质谱分析中产生强信号;和
iv.所述特征肽在质谱分析中产生可区别的信号;
(c)对所述样品和含有已知量的标记的和未标记的特征肽的标准物运行质谱分析;和
(d)通过比较样品质谱分析的结果和标准物的结果确定所述疫苗制剂样品中所述病毒蛋白的量
另一优选的实施方案包括上文所述的方法,其中所述运行质谱分析包括:
(a)将所述样品离子化;
(b)根据它们的质量或质荷比来分离多种离子;和
(c)确定对应于所述病毒蛋白的至少一种离子。
在特别优选的实施方案中,本发明是选自由以下组成的组的分离的质量标记的(mass-labeled)肽:
a.NVDHVGLGTAFENS[KC13N15](SEQ ID NO:4),
b.VEFWPCSPITQGD[RC13N15](SEQ ID NO:24),
c.SVPFEYY[RC13N15](SEQ ID NO:27),
d.HTITQPFSYHS[RC13N15](SEQ ID NO:15),
e.TFGYTV[KC13N15](SEQ ID NO:5),
f.ATTVTTPSWAVDMM[RC13N15](SEQ ID NO:6),
g.FNIDDFVPPGGGTNKISIPFEYY[RC13N15](SEQ ID NO:7),
h.ATALTYDPYVNYSS[RC13N15](SEQ ID NO:8),
i.HTIPQPFSYHSR(SEQ ID NO:9),
j.YFTPKPVLDSTIDYFQPNN[KC13N15](SEQ ID NO:10),
k.VTMYVQF[RC13N15](SEQ ID NO:11),
l.MTTVTTPSWNVDMM[RC13N15](SEQ ID NO:12),
m.FNINDFLPPGGGSNPLTVPFEYY[RC13N15](SEQ ID NO:13),
n.ANALTYDPYVNYSS[RC13N15](SEQ ID NO:14),
o.YFTP[KC13N15](SEQ ID NO:16),
p.PVLD[RC13N15](SEQ ID NO:17),
q.LQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNI[RC13N15](SEQ ID NO:18),
r.ITMYVQF[RC13N15](SEQ ID NO:19),
s.EFNL[KC13N15](SEQ ID NO:20),
t.DPPLNP[KC13N15](SEQ ID NO:21),
u.YFTPK PVLD[RC13N15](SEQ ID NO:22),
v.EFNLK DPPLNP[KC13N15](SEQ ID NO:23),
w.VEFWPCSPITQGD[RC13N15](SEQ ID NO:24),
x.GVGSTAVILDDNFVT[KC13N15](SEQ ID NO:25),及其组合。
附图简述
图1来自一组标准曲线数据的肽的引出跃迁(extracted transition)的质量层析图。(a)肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)的跃迁。对跃迁794.4/1023.5的峰面积进行积分(交叉格)。其它三个轨迹(trace)对应跃迁794.4/853.4(粉红)、798.4/1031.5(橙色)、798.4/861.4(绿色);(b)肽VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)的跃迁,对跃迁846.9/1131.5的峰面积进行积分(交叉格)。其它三个轨迹对应跃迁846.9/786.4(粉红)、851.9/1141.5(橙色)、851.9/796.5(绿色)。
图2:ORF2的标准曲线。加标的(spiked in)ORF2浓度标示于x轴。ORF2肽对AQUA肽的峰面积比标示于y轴上。(a)肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)的标准曲线,包括跃迁1(T1)和跃迁2(T2);(b)肽VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)的标准曲线,包括跃迁1(T1)和跃迁2(T2)。
图3:PCV2a与PCV2b ORF2的氨基酸序列比对。针对所述序列的特征肽标注如下:
-橙色框:针对PCV2a和2b两者的共同的肽:VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)
-粉红框:PCV2a-特异的肽:ISIPFEYYR(SEQ ID NO:26)
-蓝色框:PCV2a-特异的肽:NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)
-绿色框:PCV2b-特异的肽:SVPFEYYR(SEQ ID NO:27)
-紫色框:PCV2b-特异的肽:HTITQPFSYHSR(SEQ ID NO:15)
发明详述
本发明基于以下出乎意料的发现:质谱分析(特别是通过使用多反应监测-质谱(MRM-MS))适宜用于以充分的方式对病毒蛋白(特别是病毒样颗粒(VLP)例如由两种不同病毒蛋白组成的VLP)的量进行定量,特别还是在包括结合所述病毒蛋白和VLP的抗体的样品中。
本发明因而涉及在样品中来自传染原(infectious agent)的一或多种蛋白(天然的或重组的)的存在进行定量的方法,所述传染原例如病毒、细菌、支原体、朊蛋白、或寄生虫,所述方法包括
(a)向样品加入已知量的至少一种稳定同位素标记的特征肽,所述特征肽特异于至少一种传染原蛋白;
(b)用蛋白酶消化所述样品;
(c)对所述样品运行质谱分析;和
(d)确定所述样品中传染原蛋白的量。
在一个方面,本发明因而涉及对样品中一或多种病毒蛋白的存在进行定量的方法,包括:
(a)用蛋白酶消化所述样品;
(b)向样品中加入已知量的至少一种稳定同位素标记的特征肽,所述特征肽特异于至少一种病毒蛋白;
(c)运行所述样品的质谱分析,优选通过使用多反应监测-质谱(MRM-MS);和
(d)确定所述样品中病毒蛋白的量。
所述样品特别是制剂的样品,其中优选所述制剂是疫苗制剂。更优选地,所述样品是疫苗制剂样品。
在特别优选的实施方案中,本文所述的制剂含有结合所述一或多种病毒蛋白的物质,其中所述物质优选为抗体。
在本发明的情形中,特别需要理解的是术语“质谱(mass-spectroscopic)”等价于术语“质谱测定(mass-spectrometric)”。
根据本发明优选的实施方案,所述一或多种病毒蛋白能够形成病毒样颗粒,和/或所述样品包括病毒样颗粒,所述病毒样颗粒包含多个所述一或多种病毒蛋白,优选包含PCV2a ORF2和/或PCV2b ORF2。
所述确定所述样品中病毒蛋白的量具体而言包括或由以下组成:通过比较样品质谱分析的结果来确定所述样品中病毒蛋白的量,其中优选在质谱分析中将稳定同位素标记的特征肽的信号与所述样品的蛋白酶消化所产生的一或多种肽的信号进行比较,特别是与所述样品中一或多种病毒蛋白的蛋白酶消化所产生的一或多种肽的信号进行比较。
优选地,所述特征肽通过以下方式而预先选择:确定它们特异于要进行定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物,和/或确定在所述病毒蛋白缺失时它们从所述样品的蛋白酶消化物中特异性缺失。
根据另一优选的方面,本发明对样品中的一或多种病毒蛋白的存在进行定量的方法还包括:通过将样品的质谱分析结果与校准标准曲线比较来确定所述样品中病毒蛋白的量;和/或对含有已知量的标记的和/或未标记的特征肽的标准物运行质谱分析;和通过将样品质谱分析的结果与标准物的结果比较来确定所述样品中病毒蛋白的量,其中优选用标准物的结果生成校准标准曲线并与样品质谱分析的结果进行比较.
在另一方面,本发明还涉及制备含有一或多种病毒疫苗的疫苗制剂的方法,包括使用多反应监测-质谱(MRM-MS)来用于一或多种制剂的定量和/或定性测定或者用于质量控制确定。
优选所述疫苗制剂含有结合病毒疫苗中病毒蛋白的物质,优选抗体。
如本文所述的物质结合病毒蛋白的亲和常数,优选在105mol–1至1012mol–1或更高的范围内。
在优选的方面,制备本发明的疫苗制剂的方法优选包括以下步骤:
(a)向样品中加入已知量的至少一种稳定同位素标记的特征肽,所述特征肽特异于至少一种病毒蛋白;
(b)用蛋白酶消化所述样品;
(c)对所述样品运行质谱分析;和
(d)确定所述疫苗制剂中的病毒蛋白的量。
优选地,所述确定所述疫苗制剂中的病毒蛋白的量包括或由以下组成:通过比较样品质谱分析的结果来确定所述疫苗制剂样品中的病毒蛋白的量,其中优选在质谱分析中将稳定同位素标记的特征肽的信号与样品的蛋白酶消化产生的一或多种肽的信号进行比较,特别是与样品中一或多种病毒蛋白的蛋白酶消化所产生的一或多种肽的信号进行比较。
在制备本发明疫苗制剂的方法的另一个优选方面,所述特征肽通过以下方式而预先选择:确定它们特异于要进行定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物,和/或确定在所述病毒蛋白缺失时它们从所述样品的蛋白酶消化物中特异性缺失。
根据特别优选的方面,制备本发明的疫苗制剂的方法还包括:通过将样品的质谱分析结果与校准标准曲线比较来确定所述疫苗制剂中病毒蛋白的量;和/或对含有已知量的标记的和/或未标记的特征肽的标准物进行质谱分析;和通过将样品质谱分析的结果与标准物的结果进行比较来确定所述疫苗制剂样品中所述病毒蛋白的量,其中优选用标准物的结果生成校准标准曲线并与样品质谱分析的结果进行比较。
根据特别优选的方面,如本文所述的一或多种病毒蛋白,是一或多种病毒衣壳蛋白,优选猪圆环病毒(PCV)的ORF2或猪细小病毒(PPV)的VP2。
优选地,如本文所述的特征肽,是以下稳定同位素标记的肽中的一种或多种:
NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4),
TFGYTVK(SEQ ID NO:5)
ATTVTTPSWAVDMMR(SEQ ID NO:6)
FNIDDFVPPGGGTNKISIPFEYYR(SEQ ID NO:7)
ATALTYDPYVNYSSR(SEQ ID NO:8)
HTIPQPFSYHSR(SEQ ID NO:9)
YFTPKPVLDSTIDYFQPNNK(SEQ ID NO:10)
VTMYVQFR(SEQ ID NO:11)
MTTVTTPSWNVDMMR(SEQ ID NO:12),
FNINDFLPPGGGSNPLTVPFEYYR(SEQ ID NO:13),
ANALTYDPYVNYSSR(SEQ ID NO:14),
HTITQPFSYHSR(SEQ ID NO:15),
YFTPK(SEQ ID NO:16),
PVLDR(SEQ ID NO:17),
LQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIR(SEQ ID NO:18),
ITMYVQFR(SEQ ID NO:19),
EFNLK(SEQ ID NO:20),
DPPLNPK(SEQ ID NO:21),
YFTPK PVLDR(SEQ ID NO:22),
EFNLK DPPLNPK(SEQ ID NO:23),
VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24),
GVGSTAVILDDNFVTK(SEQ ID NO:25),
以及具有与选自SEQ ID NO:4-25的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的任何肽,其中所述肽更优选是经标记的,特别是在C-末端氨基酸残基处,用选自H2、C13和N15的至少一种稳定同位素标记。
如本文所用,特别需要理解的是术语“与SEQ ID NO:X的序列相同”分别等价于术语“在SEQ ID NO:X的长度上与SEQ ID NO:X的序列相同”或术语“在SEQ ID NO:X的完整长度上与SEQ ID NO:X的序列相同”。在此情形中,“X”是选自1-28的任意整数,因而“SEQ IDNO:X”表示了本文提到的任意SEQ ID NO。
如本发明的情形中所述的蛋白酶优选选自由以下组成的组:胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、菠罗蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、因子Xa、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白酶、羧肽酶A、及其组合。
另外,根据本发明另外的方面,本发明对样品中的一或多种病毒蛋白的存在进行定量的方法用于对病毒感染进行诊断或监测,特别是其中所述病毒感染是PCV2感染,更特别是PCV2a和/或PCV2b感染,和/或其中所述动物是猪。
优选所述样品特别是动物材料的样品或动物材料制剂的样品,其中所述动物材料选自体液或组织。
所述动物材料优选选自血液、血清、血浆、尿液、初乳、组织切片、和组织活检物。
本发明优选提供在疫苗(优选组合疫苗)中定量确定组分(优选抗原)的改良的方法和组合物,特别是其中所述疫苗中的另一种组分干扰标准免疫测定法。具体而言,本发明涉及具有第二种疫苗的组合疫苗中第一种疫苗抗原的定量测定,其中所述第二种疫苗包括会干扰标准免疫测定法的生物学成分,例如血清。例如,所述血清可能来自已经暴露于所述第一种抗原的动物,由此所述血清含有干扰第一种抗原的ELISA测定的抗体。例如,猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,M.hyo)和猪圆环病毒2(PCV2)对猪有致病性,因而期望针对这两种病原体进行疫苗接种。用于培养猪肺炎支原体的培养基包含猪血清。因为大多数的猪都针对PCV2进行了免疫,用于培养猪肺炎支原体的培养基包含不同量的抗-PCV2抗体。这些抗-PCV2抗体可干扰标准免疫测定法,所述标准免疫测定法用于对含有治疗量的PCV2抗体和猪肺炎支原体抗原的组合疫苗(在抗原组合在一起后)进行定量或监测其稳定性。
多反应监测-质谱
多反应监测-质谱(MRM-MS、或如本文所用的MRM),与稳定同位素标记的内部标准组合,在制药产业中用于小分子的定量检测。当没有适宜的抗体对可用时MRM-MS理论上是有用的。当需要多路组或者候选蛋白是修饰的蛋白时MRM-MS理论上也是适用的,并且可以测量来自多种来源包括血清和组织的高浓度或低浓度的蛋白。MRM-MS也可以在一个测定中同时测量多个目标蛋白。任选地,稳定的重同位素标记的肽通常用作内部标准。因而,尽管在鉴别和制备适宜的参考肽方面有不确定性,但MRM-MS仍具有潜力可在制造期间和最终加工之后用于疫苗的效价测定,可用于疫苗稳定性测试,用于参考稳定性测试(也即,稳定性的证明),以及新的疾病生物标记物的鉴别。尽管该技术有固有的不确定性,但是在某些应用中MRM-MS理论上可用于解决一些ELISA检测中存在的问题。下表概括性地总结了这两种技术的比较。
ELISA和MRM-MS方法用于对生物治疗物进行定量的比较
ELISA | MRM-MS |
需要特异性抗体对 | 非基于抗体的测定法 |
CV<20% | CV<10% |
抗体可以是交叉反应的 | 特异于蛋白序列的 |
灵敏性:ng/mL | 相同 |
基质:血清或血浆 | 相同 |
每个测定仅可以测量一种蛋白 | 在单一分析中可同时测量1-50种目标蛋白 |
ELISA测定运行时间:4~8hr | 相当 |
在MRM最初开发时,其对于复杂生物样品中的蛋白定量是不适用的,因为MRM测定法需要确定的蛋白以用于效价测定和参考稳定性监测。这个问题在几个特定的例子中得到了解决,其中MRM已被证明能够对商业疫苗中三种流感亚型的血凝素抗原(HA)进行同时的和绝对的定量。参见Williams et al.2008,Quantification of influenza virushemagglutinins in complex mixtures using isotope dilution tandem massspectrometry.Vaccines 26:2510-2520。Williams et al.通过使用MRM方法显示了商业疫苗中H1、H3和B的总HA量被定量为24、16和38微克/0.5ml。然而,该流感疫苗包含部分纯化的抗原,不含有任何佐剂,并且血凝素并不悬浮于复杂基质中。因而,虽然MRM在能够鉴别出适宜的靶标时或许能够对高度复杂的生物治疗物的特定组分进行定量,但是许多靶标由于各种分子相互作用而并不适于用MRM检测,例如,含有某些佐剂的那些,以及其中抗原处于会影响定量的竞争性抗体和/或蛋白质环境的复杂基质中的那些。
在疫苗生产和质量控制分析中有许多可以使用MRM的应用,特别是其中不可能使用标准ELISA测试时(如上文所述)。具体而言,如果发现疫苗和其它组分的复杂混合物中的其它组分,不能使用ELISA,包括例如,其中的多个组分具有相似抗原性的多价疫苗,或者含有来自可能含有干扰抗体(由于之前的感染或接种疫苗)的动物血清的疫苗。在这些情形中,可以鉴别出特异性的肽用作“特征肽”以检测和定量混合物中的抗原的量和性质(例如,完整的或已降解的)。
例如,猪圆环病毒2型(PCV2)已经被鉴别为猪多系统衰竭综合征(PMWS)的致病物质。开放阅读框2(ORF2)编码已被报道具有免疫原性的核衣壳蛋白。ORF2已被克隆至杆状病毒表达系统并且能够在昆虫细胞培养物中生长时被表达。参见例如,U.S.Patent No.7,910,306;7,914,992;和8,025,888。纯化的ORF2蛋白或者制备于单价疫苗基质中的ORF2可以直接通过MRM进行测试;然而,更具体的来说,当其存在时ORF2蛋白抗原是二价疫苗制品的一种组分,另一种组分包含另一种抗原如在含有猪血清的介质中产生的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)。因而组合疫苗在疫苗基质中含有不同量的内源猪血清IgG抗体(PAb),其天然与ELISA抗体竞争结合ORF2-抗原,这继而会干扰ELISA测定。这些疫苗制剂可以直接作为疫苗制品进行测试,或者使用免疫沉淀(IP)措施或尺寸排阻层析(SEC)纯化技术从制品基质中提取出来。
因而存在多种使用特征肽的措施可用于通过使用MRM来对疫苗蛋白进行检测和定量。这些不同的措施包括:
a.使用单一肽对例如PCV2 ORF2进行定量的多反应监测(MRM)
此方法直接对蛋白靶标的量进行定量而无需使用抗体(Ab)。
虽然一些蛋白可以使用LC-MS/MS,(也即,MRM-MS)技术直接进行定量分析,然而其它蛋白,如PCV2 ORF2,则太大而不能进行直接定量分析。因此,此类蛋白可以通过多种方式连续处理以便制备较小的肽以用于MRM分析。
在下文中,讨论了制备PCV2 ORF2样品的一般方法,其包括以下的一般步骤:变性、还原、烷基化和胰蛋白酶化。然而,本领域技术人员会理解可以常规地对这些制备步骤进行变化,特别是使用不同的酶来切割蛋白。对于进行MRM以便对复杂样品(如疫苗基质)中蛋白的量进行定量的一般方法,讨论了典型的蛋白水解酶,胰蛋白酶。
胰蛋白酶特异性地在多肽链精氨酸(R)或赖氨酸(K)之后的肽键处切割,并生成全体的胰蛋白酶肽集合。选择满足以下条件的独特的特征性胰蛋白酶肽:
a.具有独特氨基酸序列的肽,其特异于其被切割下的PCV2 ORF2蛋白;
b.这些肽的量在化学计量上对应于其被切割下的全PCV2 ORF2蛋白的量;
c.此类肽经正电喷雾电离(ESI)很好地电离化。
由此所产生的肽被称为内源“特征”肽。
MRM另外还使用经同位素标记的合成肽同系物(也即,外源“特征”肽)作为内部标准以用来对内源特征肽的丰度进行定量。通过将内源特征肽的量与已知量的相应的外源特征同系物(也即,经同位素标记的合成肽同系物)进行比较来确定蛋白的量。合成同系物上的重标记引起MRM中质谱的迁移,这使得可以直接地与内源特征肽进行比较。
在样品的胰蛋白酶消化之后,将已知量的外源“特征”肽添加至消化测定中。由于可以通过在质谱前进行另外的分离阶段来将复杂肽混合物的分析进行简化,因而首先使肽混合物经过反相高效液相层析(HPLC)并且肽基于其疏水性而分层。该液相层析步骤的目的是将肽向电喷雾元件的递送散布于长的时间段,以增加可以被鉴别出来的肽的数目。
接下来,对两种被洗脱的分析物种类(也即内源和外源特征肽)基于通过三重四极杆质谱的定量进行连续在线分析,所述三重四极杆质谱具有以MRM模式运行的串联的四极杆装置:
所述肽在低pH下(例如,在甲酸中)递送至质谱仪,低pH将它们转化为阳离子形式。用ESI在源区域将肽分别离子化并产生带电的分析物离子。在将肽离子递送至质谱时,第一阶段展示出不同胰蛋白酶肽的始终变化的m/z(质荷比)读数(MS1谱)。峰高(电流)是各肽离子丰度的函数,但是却受到其它物理化学性质的影响。MS1谱中的m/z信息一般不足以鉴别出具体的肽。
为了完成此任务,所选择的肽会经过另一个水平的分析,该分析从选定的“亲代”肽离子的靶向片段化开始。
肽片段化最常用的方法是碰撞诱导解离(CID),其一般破坏单个肽键,将每个肽离子片段化为两段。在给定肽离子中断裂的具体肽键是可变的,然而会产生许多片段。因而,CID产生互补的b-和y-型离子系列的片段。所述b-离子通过切割位点含有NH2末端;所述y-离子通过切割位点含有COOH末端。
质谱显示所谓的“片段化谱”(MS2谱;底部)。此处,相邻的b-或y-系列的峰之间m/z的差异恰好是一个片段中存在而另一个中缺失的氨基酸的残基质量。因而,y1-10峰(m/z=1,276.4)和y1-9峰(m/z=1,147.4)之间的差异中恰好是谷氨酸的残基质量(E;129.0Da)。
理论上,可以从MS2谱直接读取肽序列。然而实际上,计算机使用MS2谱及亲代肽离子的m/z一起来与适宜蛋白种类的所有理论谱比较,以便鉴别胰蛋白酶肽和蛋白的来源。从所有源自适宜的单一种类蛋白测序数据库的氨基酸序列的计算模拟胰蛋白酶消化中产生理论肽谱的数据库。
例如,猪圆环病毒2(PCV2)开放阅读框2(ORF2)具有氨基酸序列:
MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTVKATTVTTPSWAVDMMRFNIDDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSRNVDHVGLGTAFENSKYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLEP(SEQ ID NO:1)
在其中独特的胰蛋白酶肽VEFWPCSPITQGDR(上述中带下划线的;SEQ ID NO:24)具有比来自PCV2 ORF2的其它肽更强的信号,并且被认为是PCV2 ORF2的“特征肽”。此肽可以用重同位素标记,例如,13C和/或15N。已知量的所述经标记的特征肽可用来加标(spike)PCV2(例如, )的胰蛋白酶消化物样品。继而根据标准的方案用所述已加标的样品来运行多反应监测MS(MRM-MS)(参见下文)。
在第一个四极杆中(Q1),所述特征肽被选择通过。随后,在第二个四极杆(Q2)中从PCV2蛋白中将所述特征肽片段化。第三个四极杆(Q3)中仅仅分析在Q2中生成的所选择的片段。结果使得可以对未标记的或者“轻”特征肽与已标记的或者“重”特征肽的比例进行定量。此分析可以用多份已知量的标记的肽与未知的来进行重复,以生成标准曲线用于绝对定量。通过使用重特征肽对轻特征肽的比例,可以计算初始样品中PCV2蛋白的量。
数据显示在监测的MRM通道中没有来自背景的干扰。MRM能够基于蛋白水解肽作为相应完整ORF2的替代的定量来对PCV2 ORF2进行定量。
b.用多种特征肽对例如完整PCV2 ORF2 VLP的定量
使用MRM,多种特征肽可用于直接对固定组合疫苗中的PCV2 ORF2蛋白进行定量,以确保PCV2 ORF2蛋白是完整的。如果一种特征肽的信号降低,那么全长ORF2被降解。特征肽在如下ORF2序列中加了下划线。
MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTVKATTVTTPSWAVDMMRFNIDDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSRNVDHVGLGTAFENSKYDQDYNIRVTMYVQ FREFNLKDPPLEP(SEQ ID NO:1)
例如,三种特征性或特征胰蛋白酶肽可在该测定中用于监测:一种作为首选肽用于定量,而另外两种作为次选肽用于定性确认。对于PCV2,所述肽序列,例如如下:
首选肽:VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)
次选肽1:ISIPFEYYR(SEQ ID NO:26)
次选肽2:NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)
该测定也加入了针对所有三种靶肽的稳定同位素标记的内部标准(IS)(其是特征肽),并且在分析中使用相关分析物/IS的应答比率。该内部标准/特征肽序列如下:
首选I.S.用于定量:ORF2(P1*)(VEFWPCSPITQGDR(+10Da))(SEQ ID NO:24)
次选I.S.定性使用:ORF2(P2*)(ISIPFEYYR(+10Da))(SEQ ID NO:26)
次选I.S.定性使用:ORF2(P3*)(NVDHVGLGTAFENSK(+8Da))(SEQ ID NO:4)
可以通过尺寸排阻层析从疫苗样品中提取PCV2 ORF2 VLP,继而在需要时可使用MRM来对该VLP进行绝对定量。
c.使用IP-MRM对抗原性类似VLP(例如PCV2a和PCV2b)的定量和区分
PCV2a和PCV2b是抗原性相似但不相同的无包膜VLP的抗原性亚型。类似地,PCV2aORF2和PCV2b ORF2 VLP是抗原性相似的,但在氨基酸水平并不相同。期望的PCV2 ORF2疫苗将含有VLP的混合物,所述混合物包含PCV2a ORF2和PCV2b ORF2两种亚型。
通常,会使用ELISA方法来确定疫苗中两种不同的PCV2 ORF2亚型的相对抗原含量(RAC)或相对效价(RP)。然而,能够区分PCV2a和PCV2b的内含物水平的ELISA将会需要两种不同的MAb(一种MAb仅与PCV2a反应,而另一种MAb仅与PCV2b反应)。但是,能够区分两种抗原性相似的PCV2a和PCV2b VLP的两种独特MAb的产生将会是非常困难的,也有可能是无法实现的任务。
IP-MRM允许使用多克隆抗体来结合PCV2a和PCV2b,随后通过MRM进行接下来的区分以及对PCV2a和PCV2b的量进行定量。
在IP方法中,将多克隆抗-ORF2抗体添加至疫苗样品,使其与ORF2结合,并将所得的ORF2-Pab复合物捕获至包被有蛋白G的磁珠上。由于ORF2对于使用LC-MS/MS技术的直接定量分析实践来说太大了,在标准的蛋白变性、还原、和烷基化处理步骤之后,所结合的蛋白需要用胰蛋白酶进行“珠上”蛋白水解。此过程所产生的特征性肽片段继而可以作为ORF2蛋白的替代品由LC-MS/MS(液相层析多反应监测质谱,或MRM)来进行定量,且具有所需的灵敏性、特异性、以及精确度和准确性。
d.通过免疫亲和性(IP)-MRM对例如PCV2 ORF2 VLP的定量
IP-MRM加入使用针对病毒样颗粒(VLP)、核心样颗粒(CLP)、或免疫学相关蛋白/肽的多克隆抗血清或者特异性单克隆抗体(MAb)。此方法可用于疫苗中VLP、CLP、和免疫学相关蛋白的内含物水平的定量和/或相对效价(RP)确定。此方法使用ELISA与MRM的组合。例如,使用标准技术,将生物素化的抗-PCV2 ORF2单克隆Ab附着至链霉抗生物素蛋白包被的ELISA板。所述Ab被封闭,继而装载来自疫苗(例如, 其包含分别针对PCV2和猪肺炎支原体的抗原)的PCV2ORF2,并使其结合至板上。使用标准技术,继而从所述板释放ORF2 VLP,再注射入LC-MRM并定量。
e.通过尺寸排阻层析(SEC)-MRM对例如PCV2 ORF2 VLP的定量
与IP-MRM方法类似但不依赖于抗体的使用,使用SEC作为预先步骤确保要测量的样品中仅存在VLP或内部CLP,因只有完整的VLP或CLP结构会通过而进入空隙级分(voidfraction)。SEC-MRM使得可以将VLP从具有高水平的不相关、外来蛋白的复杂基质中分离。此方法中无抗体。如果存在抗原批次含有完整VLP和降解的VLP两者的可能,那么加入SEC步骤可确保在测定的MRM部分仅测量完整VLP(也即,真的VLP)。
在上述应用中,特别提到的是PCV2的ORF2的鉴别。然而,本发明的方法还可以用于对其它疫苗(包括这些疫苗的非相似蛋白)进行检测和定量,包括但不限于:
f.用IP-MRM对无包膜、单体PPV VP2 VLP的定量
猪细小病毒(PPV)VP2 VLP可以如上文所述进行定量,用于对含有两种抗原的疫苗中抗原性相似但不同的VLP的抗原性亚型的量进行定量(也即,NADL PPV VLP与另一种PPVVLP,IDT27的定量区分)。在IP方法中,将单克隆或多克隆抗-PPV抗体添加至疫苗样品,使其结合至PPV VP2 VLP,而所得到的PPV VP2 VLP-抗体复合物被捕获到包被有蛋白G的磁力珠上。由于PPV VP2 VLP对于使用LC-MS/MS技术的直接定量分析实践来说太大了,在标准的蛋白变性、还原、和烷基化处理步骤之后,所结合的蛋白需要用胰蛋白酶进行“珠上”蛋白水解。
g.用IP-MRM对无包膜、二聚体VLP进行定量
猫嵌环状病毒(FCV)VLP(包含VP1和VP2)-如上,对抗原性相似但不同的VLP的抗原性亚型的量进行定量(也即,FCV DD1与IFCV 666的定量区分)。在IP方法中,将单克隆或多克隆抗-FCV抗体抗体添加至疫苗样品,使其结合至FCV VLP,而所得到的FCV VLP-抗体复合物被捕获到包被有蛋白G的磁珠上。由于FCV VLP对于使用LC-MS/MS技术的直接定量分析实践来说太大了,在标准的蛋白变性、还原、和烷基化处理步骤之后,所结合的蛋白需要用胰蛋白酶进行“珠上”蛋白水解。
诺如病毒(Norovirus)疫苗-对疫苗中抗原性相似但不同的VLP混合物中多个亚型的VLP的定量。在IP方法中,将单克隆或多克隆抗-诺如病毒抗体抗体添加至疫苗样品,使其结合至诺如病毒VLP,而所得到的诺如病毒VLP-抗体复合物被捕获到包被有蛋白G的磁珠上。由于诺如病毒VLP对于使用LC-MS/MS技术的直接定量分析实践来说太大了,在标准的蛋白变性、还原、和烷基化处理步骤之后,所结合的蛋白需要用胰蛋白酶进行“珠上”蛋白水解。
轮状病毒疫苗-对疫苗中抗原性相似但不同的VLP混合物中多个亚型的VLP定量。在IP方法中,将单克隆或多克隆抗-轮状病毒抗体抗体添加至疫苗样品,使其结合至轮状病毒VLP,而所得到的轮状病毒VLP-抗体复合物被捕获到包被有蛋白G的磁珠上。由于轮状病毒VLP对于使用LC-MS/MS技术的直接定量分析实践来说太大了,在标准的蛋白变性、还原、和烷基化处理步骤之后,所结合的蛋白需要用胰蛋白酶进行“珠上”蛋白水解。
h.用IP-MRM或SEC-MRM对非包壳的、多聚VLP进行定量
蓝舌病毒(BTV)VLP包含VP3和VP7制成的内部核心样颗粒(CLP)、以及VP2和VP5的外部衣壳。重要的是,CLP在疫苗接种的动物内并不诱导中和抗体。完整VLP是优选的抗原形式,因为中和抗体是针对构成VLP外层的VP2和VP5。全世界分布有至少24种血清型的BTV,而最佳的BTV VLP疫苗会含有许多不同血清型的VLP。
SEC-MRM或IP-MRM可用于对具有许多BTV VLP的混合物的多价疫苗中的抗原水平进行定量区分。SEC会将CLP和VLP收集至空隙级分中。然而,MRM可用于测量空隙级分中VP3、VP7、VP2和VP5的确切量,而VP3、VP7、VP2和VP5的比例可以用于确定样品中存在的CLP和VLP的百分比。此种区分将会是必需的以便符合监管需求并确保商业产品中适宜的剂量(也即,相对效价)。
i.用IP-MRM对无包膜HepB核心颗粒进行定量
乙肝病毒(HBV)的核蛋白存在两种结构形式。核衣壳,作为肝炎核心抗原(HBcAg),其是自组装成颗粒的蛋白,所述颗粒包裹病毒基因组和聚合酶并且对于病毒体的功能和成熟而言是必需的。核蛋白分泌的、非颗粒的第二种形式是前核心(precore)或乙肝e抗原(HBeAg)。所述HBcAg和HBeAg由抗体分别识别,但是,由于其高度的氨基酸相同性,在T细胞水平具有交叉反应性。
HepB裂解核心(HepBsc)颗粒可用于在HepBsc表面展示免疫原性/免疫调节性蛋白或肽。SEC-MRM或者IP-MRM可用于对疫苗中存在的HepBsc颗粒及其展示的靶标的量和/或比例进行定量。
j.用IP-MRM对无包膜PCV2 ORF2 VLP载体蛋白进行定量
PCV2 ORF2 VLP颗粒可以用作免疫原性/免疫调节性蛋白或肽的载体。SEC-MRM或者IP-MRM可用于对疫苗中存在的PCV2 ORF2 VLP及其展示的靶标的量和/或比例进行定量。
k.用IP-MRM对基于流感病毒M的、有包膜的VLP进行定量
流感的基质(M)蛋白可以形成有包膜的VLP结构。免疫学相关抗原如血凝素(HA)和神经氨酸酶(N)可以经其天然的跨膜结构域锚定在VLP的包膜上。优选地,任何基于流感VLP的疫苗都会含有若干HA和N蛋白(例如,H1或者H3和N1或者N2;与每年人类流感疫苗中发现的类似)。基于M的VLP不局限于仅携带流感抗原,因为这些VLP可以掺杂跨膜结构域锚定的来自其他病毒的蛋白(例如,狂犬病G糖蛋白)。SEC-MRM或者IP-MRM可用于对病毒蛋白抗原的量进行定量。
l.用IP-MRM对杆状病毒-展示的抗原VLP进行定量
免疫学相关的抗原如血凝素(HA)、神经氨酸酶(N)、或狂犬病G可以经其天然的跨膜结构域锚定在杆状病毒的包膜上。此种重组杆状病毒可以是治疗性疫苗的基础。
SEC-MRM或者IP-MRM可用于对疫苗中存在的展示靶标进行定量。以及,SEC-MRM或者IP-MRM可用于对疫苗中存在的杆状病毒-关联的gp64(主要的杆状病毒包膜蛋白)及其展示的靶标的量和/或比例进行定量。
m.用IP-MRM对基于逆转录病毒gag的、有包膜的VLP进行定量
逆转录病毒的gag蛋白可形成有包膜的VLP结构。免疫学相关的抗原如血凝素(HA)、神经氨酸酶(N)、或狂犬病G可以通过其天然跨膜结构域锚定在杆状病毒包膜上。SEC-MRM或者IP-MRM可用于对病毒蛋白抗原的量进行定量。
n.MRM与另外的步骤的组合,例如,预先纯化和/或同时检测另外的蛋白
在检测SEQ ID NO:1的PCV2 ORF2之外,本发明的方法还可用于对例如,在多价疫苗中的所述病毒的亚型进行检测和定量。PCV2a和PCV2b是抗原性相似但不同的VLP的抗原性亚型。类似地,PCV2a ORF2和PCV2b ORF2 VLP亚型在抗原性上相似,但在氨基酸水平并不同。期望的PCV2 ORF2疫苗会含有VLP的混合物(包含PCV2a ORF2和PCV2b ORF2亚型两者)。
通常,ELISA方法会用于确定疫苗中两种不同的PCV2 ORF2亚型的相对抗原含量(RAC)或者相对效价(RP)。然而,能够区分内含物水平的PCV2a和PCV2b的ELISA将会需要两种不同的MAb(一种MAb仅与PCV2a反应,而另一种MAb仅与PCV2b反应)。但是,能够区分两种抗原性相似的PCV2a和PCV2b VLP的两种独特MAb的产生将会是非常困难的,也有可能是无法实现的任务。
IP-MRM允许使用多克隆抗体来结合PCV2a和PCV2b,随后通过MRM进行接下来的区分以及对PCV2a和PCV2b量的定量。
SEQ ID NO:1是PCV2最常见亚型(也即是PCV亚型PCV2a)的全长ORF2的氨基酸序列:
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3是PCV2的ORF2b的氨基酸序列的变体:
和
MTYPRRRFRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTIGYTVKKTTVTTPSWNVDMMRFNINDFLPPGGGSNPLTVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDRTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRITMYVQFREFNLKDPPLNPK(SEQ ID NO:3)
粗体/下划线的序列是各蛋白的“特征肽”。
o.用于MRM鉴别的特征肽的鉴别
本发明的方法依赖于能够在其它组分的混合物中的蛋白靶标内,鉴别出对该混合物中特定蛋白而言具有特异性的序列。
在一个实施方案中,用软件分析蛋白靶标的序列,以确定用各种酶所产生的肽的序列。优选地,与期望的蛋白所存在于的组合物相比,这些肽对于所要检测的期望的肽而言是独特的,并且所述肽不会太小或者太大而不适宜用作特征肽。
虽然有这样的指引用于选择适宜于本发明的特征肽,但是仍然需要试验验证来对特征肽的独特性进行确认。例如,由ABI MultiQuant软件(版本1.0)起初提示的最有可能在本发明中可用的三种胰蛋白酶肽中的两种,其表现正如预期。出乎意料的是,虽然在选择用于初始试验中对ORF2蛋白浓度进行定量的三种肽中,ISIPFEYYR肽(SEQ ID NO:26)具有最强的信号,但是此肽却未能具有定量分析所需的特征,这或许是由于未预计到的由猪血清蛋白带来的干扰。
p.用于MRM鉴别的样品的制备
如果需要的话,可以使用多种样品制备技术来在MRM分析之前纯化样品,以便增强信号质量。这些技术包括,例如,免疫亲和、免疫沉淀、和尺寸排阻层析。
定义
除非另有定义,本文所使用的所有技术和科学术语都具有本发明提交时所属领域内技术人员通常所理解的相同含义。术语的含义和范围应当是清楚的;然而,当有任何潜在的歧义时,本文提供的定义优先于任何字典或者外来的定义。另外,除非上下文另有其它需要,否则单数术语应当涵盖复数以及复数术语也应涵盖单数。在本文中,使用“或”意味着“和/或”,除非另有说明。此外,使用术语“包括”,以及其它的形式如“包含”和“含有”并非是限制性的。
“蛋白质”没有限制地指任何蛋白质,并且优选包括那些至少包含50个氨基酸的蛋白质。
“肽”是指较短的多肽,并且优选包括那些包含50个或者更少氨基酸的多肽,例如4-50个氨基酸之间,或者10-24氨基酸。
“分析物蛋白”和“分析物肽”指要进行定量的特定的蛋白或者肽。
“特征肽”包括:通过蛋白酶或化学切割片段化而从分析物蛋白或者肽制备的内源特征肽;以及含有对应于已知的或者预测的待分析蛋白中的序列的氨基酸序列的外源或合成肽,并且所述氨基酸序列经过标记使得所述外源特征肽与从待分析蛋白生成(经蛋白酶或化合物片段化)的内源肽相同或者几乎相同,而仅仅除了在分子质量方面有微小差异。质量标记的肽内部标准的化学修饰优选是加入稳定的同位素。在这种情况中,外源特征肽和从分析物蛋白片段化得到的内源特征肽将会是相同的,除了在分子质量方面有微小差异。
“疫苗”是指免疫原性组合物,当其施用给动物时,会在动物体内激发或者能够激发(直接或间接的)针对所述组合物中抗原的有效免疫应答,例如,抗原会激发对致病性生物体的免疫应答。优选地,此类免疫应答会减少一或多种临床迹象(与一或多种致病性生物体相关或者由其感所引起)的发病率或者严重性。
“抗原”是指如本文所述激发免疫应答的多肽或者蛋白。“免疫原性”蛋白或者多肽包括本文鉴别的任何蛋白或者多肽的全长序列,或者其类似物或免疫原性片段。术语“免疫原性片段”或者“免疫原性部分”是指抗原性或者免疫原性蛋白或者多肽的片段或者截短的或经取代的形式,其包括一或多个表位并因而会激发本文所述的免疫学应答。一般而言,此类截短的和/或经取代的形式、或者片段将包含来自全长蛋白的至少六个连续的氨基酸。更优选地,所述截短的和/或经取代的形式、或者片段将包含来自全长蛋白的至少10个、更优选15个、更优选19个连续的氨基酸。
“免疫应答”或者“免疫学应答”是指(但不限于),细胞和/或抗体介导的针对感兴趣的组合物或疫苗的免疫应答的发展。通常,免疫或者免疫学应答包括但不限于,一或多种以下效应:抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒T细胞的产生或激活,其特异性的针对感兴趣的组合物或疫苗中所包括的抗原或者多个抗原。优选地,宿主将会展现出治疗性或者保护性免疫学(记忆)应答,从而增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。此种防护将会得到以下证明:症状数目的减少、症状严重性的降低、或者与病原体感染相关联的一或多种症状的消失、病毒血症发作的延缓、病毒持续性的降低、整体病毒载荷的降低和/或病毒排出(excretion)的减少。
“药学-或兽医学-可接受的载体”是指任意的以及所有的溶剂、分散介质、包被、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂等。在一些优选的实施方案中,特别是包括冻干的免疫原性组合物的那些实施方案中,本发明所使用的稳定剂包括用于冻干(lyophilization)或者冷冻干燥(freeze-drying)的稳定剂。
“佐剂”如本文所用,可包括氢氧化铝和磷酸铝,皂苷类例如,Quil A,QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水乳剂、水包油乳剂、油包水乳剂。所述乳剂可以具体而言是基于轻液态石蜡(欧洲药典型);类异戊二烯油如鲨烯或者三十碳六烯;得自烯烃(特别是异丁烯或者癸烯)寡聚化的油;含有线性烃基的酸或者醇的酯,更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或者丙二醇二油酸酯;分支脂肪酸或者醇的酯,特别是异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳剂。所述乳化剂优选非离子型表面活性剂,特别是山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(例如脱水甘露醇油酸酯)、乙二醇的酯、聚丙三醇的酯、丙二醇的酯,以及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或者羟硬脂酸的酯,其任选是经乙氧基化的,和聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物嵌段,特别是Pluronic产物,尤其是L121。参见Hunter et al.,The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),John Wiley and Sons,NY,pp51-94(1995)和Todd et al.,Vaccine 15:564-570(1997)。示例性佐剂有M.Powell和M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunitand Adjuvant Approach”,Plenum Press,1995中第147页中描述的SPT乳剂,以及同样是这本书的笛183页所描述的乳剂MF59。
佐剂的另外的例子有选自以下的化合物:丙烯酸或者甲基丙烯酸的聚合物以及顺丁烯二酸酐和烷基衍生物的共聚物。有利的佐剂化合物有交联的丙烯酸或者甲基丙烯酸的聚合物,特别是用糖或聚醇的聚苯醚。这些化合物已知称为术语卡波姆(carbomer)(Pharmeuropa Vol.8,No.2,June 1996)。本领域技术人员也可参阅U.S.Patent No.2,909,462其中描述了此类丙烯酸聚合物交联了多羟基化的化合物(具有至少3个羟基),优选不超过8个,至少3个羟基的氢原子被不饱和脂肪烃自由基(具有至少2个碳原子)置换。优选的自由基是含有2-4个碳原子的那些,例如乙烯基、烯丙基和其它烯烃不饱和基团。所述不饱和自由基其本身可以含有其它取代,如甲基。以商品名Carbopol出售的产品;(BF Goodrich,Ohio,USA)是特别适宜的。它们与蔗糖交联They are cross-linked with anallylsucrose或者与烯丙基季戊四醇交联。其中,可能提到的有Carbopol 974P、934P和971P。最优选的是使用Carbopol 971P。在顺丁烯二酸酐和烷基衍生物的共聚物中,是EMA共聚物(Monsanto),其是顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解导致酸性溶液,其将会被中和,优选中和至生理pH,以便提供免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身将要加入的佐剂溶液。
另外的适宜的佐剂包括但不限于,RIBI佐剂体系(Ribi Inc.)、Block共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰基脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组的或者不是)的不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或者胞壁酰二肽、或者自然发生的或重组的细胞因子或其类似物或者内源细胞因子释放的刺激物,等等。
“稀释剂”可包括水、盐水、葡聚糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等。
“疫苗基质”或者“制剂基质”或者“背景基质”全都是指佐剂、赋形剂、稀释剂、等渗剂、稳定剂或者配制为向动物注射的疫苗中的其它材料(除特定的抗原之外)。这些材料可以含有干扰对组合疫苗中第二种疫苗抗原的检测和/或准确定量(使用常规测定法)的元素,例如,由于存在来自制备疫苗组分时所使用的血清的抗体,或者与第二种疫苗抗原竞争结合ELISA免疫测定中所使用的抗体的其它材料。
用于鉴别和合成特征肽的方法
用于鉴别和合成特征肽的一般方法是本领域已知的,例如,如WO200600281中所描述的,其公开内容援引加入本文。
本发明提供了使用质量标记的特征肽来定量测量肽的方法,其中所述肽产生自复杂混合物中的疫苗的完整蛋白,所述混合物含有干扰特异性结合配偶体元素如基于抗体的ELISA测定,其中所述肽产生自酶或者化学切割。所述质量标记的特征肽含有与通过此类切割产生的分析物疫苗蛋白片段相同的或者几乎相同的氨基酸序列。分析物疫苗蛋白的切割产生了来自蛋白的可分析的肽,其中从分析的角度来说,所述可分析的肽和质量标记的特征肽之间唯一的区别在于通常2-10道尔顿的质量迁移(mass-shift)。
通过使用质量迁移的特征肽,实现了以下优势:i)内部标准前体可以设计为,在蛋白片段化之前进行的任何各种任选的样品制备步骤期间,与分析物蛋白或者分析物肽一起共纯化;和ii)单一的内部标准前体可以设计为生成内部标准肽以用于分析源于若干不同的分析物蛋白或者分析物肽的肽片段。
质量标记的特征肽可以通过肽合成来生成,期间掺入一个或多个质量标记的氨基酸。优选地,质量标记氨基酸含有一个或多个稳定同位素,包括但不限于13C、15N、18O、2H、和34S。
可以通过固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式来合成肽,如Lu et al.,(1981)J.Org.Chem.46,3433(以及其中的参考文献)中所描述的。临时的N-氨基基团保护是通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团提供的。此种高度碱不稳定的保护基团的重复切割是用N5N-二甲基甲酰胺中20%的哌啶来实现的。侧链功能性可以保护为其丁基醚(对于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的情况)、丁基酯(对于谷氨酸和天冬氨酸的情况)、叔丁氧羟基衍生物(对于赖氨酸和组氨酸的情况)、三苯甲游基衍生物(对于半胱氨酸的情况)和4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基衍生物(对于精氨酸的情况)。当谷氨酰胺或者天冬酰胺是C-末端残基时,使用4,4'-二乙氧基二苯甲基基团来保护侧链的酰胺基功能性。固相支持物是基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物(由三个单体二甲基丙烯酰胺(骨架单体)构成),双丙烯酰乙烯基二胺(交联剂)和丙烯酰肌氨酸甲基酯(官能化剂)。所使用的肽-至-树脂可切割连接剂是酸不稳定的4-羟甲基-苯氧基乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物被添加为其实行的对称酸酐衍生物,只有天冬酰胺和谷氨酰胺除外,这两者是使用反向的N,N-二环己基-碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的偶合过程来添加的。所有的偶联和脱保护反应是使用茚三酮、三硝基苯磺酸或者靛红(isotin)测试过程来监测的。在合成完成时,通过95%三氟乙酸(含有50%清除剂混合配料)处理的伴随去除侧链保护基团从而将肽从树脂支持物上切割下来。常用的清除剂有乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水,确切的选择取决于要所合成的肽的构成氨基酸。三氟乙酸通过在真空中挥发而去除,随后用二乙醚研制(trituration)而提供粗肽。可通过简单的提取过程去除任何存在的清除剂,所述提取过程在水相的冻干上提供没有清除剂的粗肽。肽合成的试剂通常可得自Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd,Nottingham NG7 2QJ,UK。纯化可以通过一种技术或者技术的组合来实现,如尺寸排阻层析、离子交换层析和(主要是)反相高效液相层析。肽的分析可以使用薄层层析、反相高效液相层析、酸水解之后的氨基酸分析和通过快原子轰击(FAB)质谱分析来进行。
质量标记还可以包含氨基酸的其它化学修饰,包括但不限于,乙酰化、甲基化、脱酰胺和羧甲基化。如果质量标记修饰是加入稳定同位素之外的其它修饰,重要的是要避免可能会改变样品制备、分离和离子化期间内部标准肽行为的修饰。
另外,所述质量标记的特征肽可以被合成为相对于分析物蛋白或者肽具有一或多个取代的氨基酸残基;例如,丙氨酸取代甘氨酸。在这种情况下,分析物蛋白或者肽和质量标记的肽内部标准前体的切割将会从蛋白产生可分析的肽以及从内部标准前体产生内部标准肽,从分析的角度来说它们之间唯一的差别在于,由于肽内部标准中存在的丙氨酸相对于分析物蛋白或者肽中存在的甘氨酸而导致的质量迁移。本发明此种实施方案的优点在于,在质量标记的肽内部标准前体的合成期间,用甘氨酸取代丙氨酸比起用同位素标记的丙氨酸更容易。其它适宜的氨基酸取代是本领域技术人员很容易想到的,例如缬氨酸和异亮氨酸可以互相替换。
所述质量标记的肽内部标准前体相对于所述分析物蛋白或肽可具有零个、一个、两个、三个、四个或者五个取代的氨基酸残基,或者可以相对于所述分析物蛋白或者肽在氨基酸残基总数目的5%、10%、15%、20%或25%中有差异。优选所述质量标记的特征肽相对于所述分析物蛋白或肽不具有取代的氨基酸残基或者具有一个取代的氨基酸残基。
如果所述分析物蛋白的片段含有任何翻译后的修饰如磷酸化,那么所述质量标记的特征肽可以被合成为具有同样的修饰。
所述质量标记的肽内部标准前体还可以通过重组蛋白表达来产生,其中存在质量标记的氨基酸作为杂合蛋白的一部分,在这种情况中所述杂合蛋白其本身可构成内部标准前体或者所述杂合蛋白可以被加工以产生一种或多种肽内部标准前体。
在使用重组蛋白表达来制备质量标记的特征肽时,使用本领域技术人员熟知的方法来制备编码所期望肽的DNA分子,所述方法在Sambrook et al.(2001)"MolecularCloning,a Laboratory Manual",3rd edition,Sambrook et.al.(eds),Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA中有示例。
继而在适宜的宿主中表达该DNA以产生质量标记的肽内部标准前体。因而,编码所述肽的DNA可用于根据已知的技术(并基于本文所公开的教导经适当修饰)来构建表达载体,所述表达载体继而可用于转化至适宜的宿主细胞以进行表达和产生所述的肽。此类技术包括下列中所公开的:美国专利号:4,440,859,1984年4月3日授权于Rutter et al.;4,530,901,1985年7月23日授权于Weissman;4,582,800,1986年4月15日授权于Crowl;4,677,063,1987年6月30日授权于Mark et al.;4,678,751,1987年7月7日授权于Goeddel;4,704,362,1987年11月3日授权于Itakura et al.;4,710,463,1987年12月1日授权于Murray;4,757,006,1988年7月12日授权于Toole,Jr.et al.;4,766,075,1988年8月23日授权于Goeddel et al.和4,810,648,1989年3月7日授权于Stalker,所有这些文献均援引加入本文。
编码质量标记的特征肽的DNA可以加入至许多其它的DNA序列以用于引入至适宜的宿主中去。此类伴随DNA将取决于宿主的性质、将DNA引入宿主的方式、以及是期望保持于染色体外还是期望整合于染色体。
一般而言,会以用于表达的适当方向和正确的读框来将DNA插入至表达载体如质粒中。优选的表达载体有杆状病毒,最优选的是商业可用的体系。如果需要的话,可将所述DNA连接至适宜的所期望的宿主中能识别的转录的和翻译的调节控制核苷酸序列,虽然此类控制一般在表达载体中就有。因而,DNA插入物可以是可操纵地连接至适宜的启动子。细菌启动子包括大肠杆菌lad和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、噬菌体λPR和PL启动子、phoA启动子和trp启动子。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。其它适宜的启动子会是技术人员熟知的。还期望表达构建体会含有转录起始和终止的位点,以及在转录区有用于翻译的核糖体结合位点。(Hastings et al.,国际专利号:WO 98/16643,1998年4月23日公开)
继而通过标准技术将载体引入至宿主中。一般而言,并不是所有的宿主都会具有转化的载体,因而需要筛选有转化入的宿主细胞。一种筛选技术涉及将DNA序列标记(以及任何必需的控制元件)加入至表达载体中,该DNA序列标记在转化的细胞中编码可选择性状。这些标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或者新霉素抗性,以及用于大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或者氨苄霉素抗性基因。或者,用于此种选择性状的基因可以在共转化至期望的宿主细胞的另一个载体上。
继而将已经转化有编码质量标记的特征肽的重组DNA的宿主细胞在技术人员熟知的适宜条件下培养足够的时间,以使多肽表达,继而可以回收多肽。
可以通过熟知的方法将质量标记的特征肽从重组细胞培养物中回收并纯化,所述方法包括硫酸铵或者乙醇沉淀、酸萃取、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选地,使用高效液相层析(“HPLC”)进行纯化。
许多表达系统是已知的,包括使用以下的系统:细菌(例如,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))其中转化有,例如,重组噬菌体、质粒或者粘粒DNA表达载体;酵母(例如,酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))其中转化有,例如,酵母表达载体;昆虫细胞系统其中转化有,例如,病毒表达载体(例如,杆状病毒);植物细胞系统其中转染有,例如病毒或者细菌表达载体;动物细胞系统其中转化有,例如,腺病毒表达载体。
可以通过基于蛋白的特异性和分析物蛋白的氨基酸序列使用本领域技术人员已知的计算机模拟方法预测蛋白的片段和产物来确定用作质量标记的肽内部标准的适宜的氨基酸序列。适宜用作肽内部标准前体的氨基酸序列或多个氨基酸序列还可以通过分析物蛋白的片段化和质谱分析以及确定所产生肽片段的实际一级结构来确定
分析物蛋白可以是任意已知的蛋白或者疫苗的核酸序列分析所预测的理论蛋白。
所述质量标记的特征肽可设计为检测和测量经修饰的蛋白和肽,其中所述修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、氧化、法呢酰化、乙酰化、泛素化、脂化、异戊烯化和磺化。它们也可以被设计为检测和测量已知或者预测这样的蛋白和肽种类:mRNA可变剪接所产生的、通过蛋白体内的特异性或非特异性降解蛋白所产生的、或者通过由于单核苷酸多态性的变异所产生的。
单个特征肽可以被设计为和合成为在切割时产生一个、两个、或者更多个特征肽。因而本发明此方面的另外的实施方案是,其中质量标记的特征肽包含超过一个质量标记的特征肽。本发明此方面的另外的实施方案是,其中质量标记的特征肽包含用于分析源自于多个分析物蛋白的肽片段的质量标记的肽内部标准。
肽或蛋白的异源样品可以提取自疫苗样品,或者衍生自从疫苗样品提取的肽和蛋白异源样品的片段化。从此类疫苗样品提取蛋白的方法是本领域技术人员熟知的。
可用于本发明此方面的质量标记的特征肽可以是适宜于本发明方法的任意长度,且通常是长度为4-50个氨基酸,优选长度为10-40个氨基酸。质量标记的特征肽的大小由特征肽的以下需要决定:具有最小的大小从而其可以与分析物蛋白或者肽相关联以及具有最大的大小从而标准肽可以被现有的质谱方法所解析。
本发明此方面的另外的实施方案是,其中质量标记的肽内部标准前体具有6-200个氨基酸的长度。如上文所述,特征肽前体可含有一个或者若干个氨基酸序列对应于一个或者若干个已知或预测的蛋白中的序列。
本发明此方面的另外的实施方案,其中在暴露于酶或化学切割之前进行的样品纯化步骤期间,将质量标记的特征肽与分析物蛋白或者要测量的分析物蛋白一起共纯化。
所述质量迁移的特征肽被添加至要分析的样品中,任选是在任何样品制备或分馏步骤之前。可加入若干不同的特征肽以使得可以同时对多个不同的蛋白和肽进行定量,而且可以对来自相同蛋白的不同片段加入若干内部标准前体以获得有冗余的信息。或者,可以使用生成超过一个内部标准的单一的内部标准前体。
如果需要的话,可以通过去除可能会干扰分析的物质将样品制备为用于分析以及使得分析物富集。可以使用的方法包括固相萃取、液相层析、沉淀、超滤和使用基于亲和性技术的纯化,正如本领域技术人员会了解的那样。
样品中的蛋白还可以经化学修饰,例如通过半胱氨酸的还原和羧甲基化来使二硫键断裂以及避免肽二聚体的形成。
本发明的方法包括这样的步骤:将蛋白或肽的异源样品片段化以产生肽片段的异源样品。这些片段继而可以使用与多反应监测质谱关联的方法和过程来进行鉴别和分析,如下文中有更详细描述。
将蛋白、多肽或肽的异源样品片段化的步骤可以通过任何本领域已知的方法来实现。例如,可以使用化学或酶切割。化学或酶(也即,蛋白酶导向的)切割的许多方法是本领域已知的。例如,蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、菠罗蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、因子Xa、金黄色葡萄球菌蛋白酶和羧肽酶A。在优选的实施方案中,片段化的方法将在规定的位置切割蛋白、多肽或肽。酶切割通常是序列导向的,如下所示。因而本发明此方面的另外的实施方案是,其中酶或化学切割是序列导向的。
其中R1和R2是根据如下式定义的:
N-末端-NH-CHR1-CO-NH-CHR2-CO-C-末端。
化学切割方法也可以是序列导向的,例如,溴化氰片段化,其将会在甲硫氨酸的C-末端侧切割蛋白或者肽。
因而,例如,胰蛋白酶切割是片段化的序列导向的手段,因为切割是受到蛋白、多肽或者肽中存在的精氨酸或赖氨酸残基的引导的,也因此会产生在C-末端残基处具有精氨酸或者赖氨酸的切割片段。
本发明此方面的另外的实施方案是,其中质量标记的肽内部标准前体和样品(包含一个或者多个分析物蛋白)是在酶或化学切割后分离的。
将异源蛋白群体片段化成肽通常会产生高度复杂的肽混合物,该混合物需要在质谱分析之前进行分离,以降低复杂性。可以用于进行肽分离的方法包括液相层析(以一种或多种分离维度)、固相萃取和亲和性捕获,正如本领域技术人员可以理解的那样。
分离可以与质谱分析偶合,或者是在线的(液相层析与电喷射质谱偶合),或者是通过分馏随后分析个别级分,例如通过基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI)。分析物肽和质量标记的内部标准肽之间的丰度区别可以通过单一阶段质谱(MS)或者多阶段MS(MS/MS或者MS")来测量。在双阶段的质谱分析中,第一个质量分离是用于选择要分析的肽,所选择的肽继而进行片段化并在第二阶段的质量分离中分析片段。
MS/MS是分析复杂的肽混合物的非常强大的手段,因为其有能力解析具有相同分子量但却有不同氨基酸组成的肽。
通过质谱从具体的肽获得的信号强度取决于肽的浓度、分子量和离子化特征以及样品中其它组分的猝灭效应(quenching effect)。对于除了例如同位素组成之外其它都相同的两种肽,相对信号强度理想情况下应当仅仅取决于浓度浓度,因为所有其它因素对它们的影响都相等。
分离肽的另一种方法是“特征肽捕获”(SPC),如PCT/EP2004/002566中所述,其援引加入本文。
本发明另一方面提供了试剂盒,其包含上文所定义的或者与本发明第一方面相关的质量标记的特征肽,以及用于将肽片段化的物质。
本发明另一方面提供了试剂盒,其包含上文所定义的或者与本发明第一方面相关的质量标记的特征肽,以及测试样品,该样品含有或者要测试其是否含有(例如认为其含有)分析物蛋白或者肽。所述试剂盒可进一步包含用于将肽片段化的物质。
质谱
质谱可用于展示含有样品的分子的质量的谱,包括靶标特征肽的质量。质谱(Massspectroscopy)还可以被称作质谱测量(Mass spectrometry)。质谱包括以下步骤:
a.将包括加至病毒蛋白的特征肽的样品离子化;
b.根据它们的质荷比分离所生成的离子;
c.通过检测带电颗粒的能量来动态地检测所述离子;和
d.将得到的信号或者多个信号处理成样品的颗粒的质量谱。
能够进行质量谱分析的系统和设备可在An Introduction to Mass Spectrometry(1997),Van Bramer,Widener University,Department of Chemistry中有公开,援引加入本文。在公开的实施方案中利用了多反应监测(MRM)质谱,以增强检测过程。与传统质谱不同,MRM是高度选择性的和靶向性的。此特征使得仪器得到良好调试以特异性地寻找感兴趣的蛋白片段。因而,所公开的实施方案提供了对感兴趣蛋白的靶向分析而不是常规质谱分析所产生的大量的数据。
样品中存在的一或多种病毒蛋白的定量可以通过使用多反应监测由所公开的实施方案来进行检测。蛋白的片段可以被鉴别,继而进行“过滤”的过程以对那些感兴趣的蛋白进行定量。根据这些实施方案,可以使用三重四极杆质谱以对靶标蛋白进行定量测量。例如,MRM过程可以至少在两个阶段的质量过滤中使用,以选择性检验与病毒蛋白相关联的特定离子的片段化。在一个阶段,预先选择感兴趣的离子(前体),并在碰撞室内诱导成片段。在第二阶段,少量的序列特异性片段离子、或者跃迁离子,经质量分析。因而,所公开的实施方案可以使用MRM,通过比较MRM分析与标准物的结果来确定疫苗制剂样品中病毒蛋白的量。
MRM质谱所使用的系统和过程可以在“Quantitative,Multiplexed Assays forLow Abundance Proteins in Plasma by Targeted Mass Spectrometry and StableIsotope Dilution,”Keshishian et al.,Mol Cell Proteomics 6:2212-29(2007)中有公开,援引加入本文。其它的实施方案可以根据所产生的离子的质量来使用过滤所述离子的功能,并提供这些离子的谱分析。
在此包括下文的实施例是用于证明本发明优选的实施方案。本领域技术人员需要了解的是,下文实施例中公开的技术代表了本发明人所发现的在本发明的实践中作用良好的技术,因而可以被认为是构成了其实践的优选模式。然而,本领域技术人员在了解到本公开之后应当理解,在所公开具体实施方案中可以进行许多变化但却仍然能获得一样的或类似的结果而不偏离本发明的主旨和范围。
上文和下文引用的所有专利、专利申请和出版物的内容,在此以其整体援引加入本文。
实施例
实施例1:开发测定法用以定量确定疫苗组合物中PCV OR2的浓度。
我们已经成功地开发了测定法用以定量地测定复杂基质中的ORF2蛋白。通过监测此ORF2蛋白的两种特征胰蛋白酶肽的多反应监测(MRM)跃迁:NVDHVGLGTAFENSK(SEQ IDNO:4)和VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24),我们能够建立范围在3.125μg/mL至200μg/mL的线性标准曲线,其中标准曲线中除了一个点外所有其它点的变异系数(CV)都低于10%,包括所有两种样品加工和分析仪器的表现。此浓度范围在进行测量之前设定以预期得到所需的动态范围;然而如果需要的话,信噪比足以在未来的作业中将定量下限(Lower Limit ofQuantification(LLOQ))扩展至较低的浓度。疫苗样品230-61A(下文所述的测试样品的批号)所确定的浓度大约为4μg/mL。
对2组的疫苗生成了系列稀释曲线(组1:样品261-007B-1、261-007C-1、261-007D-1和261-007F-1;组2:261-007B、261-007C、261-007D、和261-007F)。MRM测量能够区分每组疫苗内轻微的浓度变化。
材料
下列样品由Boehringer Ingelheim Vetmedica提供。将它们等分分装(50μL/小管)并在处理前保存在-80℃的冰箱中。
样品2:230-61B(阳性对照。其也含有ORF2蛋白。)
样品3:230-61C(230-61B的背景基质。其不含ORF2。)
样品4:230-61D(PBS缓冲液中的纯化的ORF2)
样品5:230-64E(230-61A的背景基质)
样品6:230-64F(猪肺炎支原体。培养基包括:10%的猪血清。)
另外,以1mg/mL提供了纯化的ORF2样品用以生成标准曲线。
三种稳定同位素标记的合成肽(标注为“AQUA”肽),代表着ORF2的三种胰蛋白酶序列,以5x1nmol的量购买自AnaSpec(Fremont,CA)。该三种肽为:
a.NVDHVGLGTAFENS[KC13N15](SEQ ID NO:4),
b.ISIPFEYY[RC13N15](SEQ ID NO:26),和
c.VEFWPCSPITQGD[RC13N15](SEQ ID NO:24).
同位素标记在C-末端氨基酸处。赖氨酸上的标记导致了8Da的质量迁移,而精氨酸上的标记导致了10Da的质量迁移。在三种AQUA肽之外,合成了含有序列ISIPFEYYR(SEQ IDNO:26)的更长的肽以用于确定胰蛋白酶消化效率。此肽是GGGTNK[IC13N15]S[IC13N15]PFEYYRIRKVKVEF(SEQ ID NO:28)。两个异亮氨酸上的标记导致了14Da的质量迁移。
RapiGest洗涤剂采购自Waters(Milford,MA)。
方法
用于标准曲线的样品制备.
将ORF2(1mg/mL)掺入疫苗“样品5,230-64E”的背景基质达到的200μg/mL的终浓度。使用此原液溶液,通过加入“样品5,230-64E”制备了系列稀释以产生以下预先确定的ORF2浓度:100、50、25、12.5、6.25、和3.125μg/mL。另外,制备了其它的三个浓度,64、32和16μg/mL,以用于校验。
标准曲线样品和疫苗的胰蛋白酶消化
通常,将20μL的样品用80μL的Mastermix溶液(含有50mM NH4HCO3、0.1%RapiGest、250fmol/μL的具有稳定同位素标记的氨基酸的AQUA肽)稀释。四种AQUA肽是NVDHVGLGTAFENS[KC13N15](SEQ ID NO:4)、ISIPFEYY[RC13N15](SEQ ID NO:4)、VEFWPCSPITQGD[RC13N15](SEQ ID NO:24)、和GGGTNK[IC13N15]S[IC13N15]PFEYYRIRKVKVEF(SEQ ID NO:28)。对于双空白样品的情形,AQUA肽不包括在Mastermix中。
随后,在用8μg胰蛋白酶于37℃消化16小时之前将蛋白变性、还原、以及烷基化。最后,将含有ORF2的胰蛋白酶肽和AQUA肽的此溶液酸化以分解RapiGest洗涤剂,并通过LC-MRM在4000 Qtrap三重四极杆仪器(ABI/Sciex)上分析。
液相层析ph-MRM(LC-MRM)
将二元Agilent毛细管-1100系列HPLC系统直接偶合至ABI 4000Qtrap质谱。以8μL/min的流速使用毛细管反相层析柱(5-μm C18硅石颗粒,柱尺寸320μm x 15cm,Micro-Tech Scientific,Vista,CA)。所有的运行注射体积都是10μL,其中使用LeapTechnologies(Carrboro,NC)的型号HTC PAL自动取样器。使用0%-45%的溶剂B的梯度在52min实现胰蛋白酶肽的梯度洗脱(溶剂A是H2O中0.1%的甲酸,以及溶剂B是乙腈的0.1%甲酸)。通过注入AQUA肽以及加大去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)以使片段离子强度最大化来确定MRM的条件。最终条件列在表1中。每个跃迁的驻留时间设定为50ms以及总的Qtrap循环时间为0.77sec。
Q1 | Q3 | 驻留时间(msec) | 肽 | DP | CE |
794.4 | 1023.5 | 50 | NVDHVGLGTAFENSK | 100 | 42 |
794.4 | 853.4 | 50 | NVDHVGLGTAFENSK | 100 | 40 |
798.4 | 1031.5 | 50 | NVDHVGLGTAFENSK* | 100 | 42 |
798.4 | 861.4 | 50 | NVDHVGLGTAFENSK* | 100 | 40 |
594.3 | 874.4 | 50 | ISIPFEYYR | 70 | 25 |
594.3 | 987.5 | 50 | ISIPFEYYR | 70 | 24 |
599.3 | 884.4 | 50 | ISIPFEYYR* | 70 | 25 |
599.3 | 997.5 | 50 | ISIPFEYYR* | 70 | 24 |
601.3 | 874.4 | 50 | I*SI*PFEYYR | 70 | 25 |
601.3 | 994.5 | 50 | I*SI*PFEYYR | 70 | 24 |
846.9 | 1131.5 | 50 | VEFWPC(羧甲基)SPITQGDR | 80 | 37 |
846.9 | 786.4 | 50 | VEFWPC(羧甲基)SPITQGDR | 80 | 40 |
851.9 | 1141.5 | 50 | VEFWPC(羧甲基)SPITQGDR* | 80 | 37 |
851.9 | 796.5 | 50 | VEFWPC(羧甲基)SPITQGDR* | 80 | 40 |
表1:三种ORF2胰蛋白酶肽以及其相应的AQUA肽的MRM条件。K*是C13N15标记的赖氨酸,R*是C13N15标记的精氨酸,以及I*是C13N15标记的异亮氨酸。经标记的氨基酸的质量提高分别为8Da、10Da、和7Da。
疫苗中ORF2浓度的校准标准曲线、校验、和确定
用ORF2掺入至“样品5,230-64E”至预先确定的终浓度3.125、6.25、12.5、25、50、100、和200μg/mL以产生了校准标准曲线。将AQUA肽(200fmol/μL)加入至洗脱溶液(各个浓度点)以作为内部标准。使用ABI MultiQuant软件(版本1.0,AB SCIEX,500 OldConnecticut Path,Framingham,MA 01701,USA)来积分对跃迁所记录的峰面积应答。所有肽的积分参数设定如下:总平滑宽度(total smoothing width),3个点;RT窗口,120sec;最小峰宽度,3品脱;最小峰高度,0cps;噪音百分比,40%;基线子窗口,2min;峰分离因子,2个点。ORF2肽与AQUA肽的积分的峰面积比例(y轴)针对ORF2(x轴)的浓度作图,并且演算得到了线性拟合标准曲线(y=mx+b)。使用标准曲线计算了ORF2疫苗浓度和64、32和16μg/mL的校验样品。
疫苗系列稀释曲线
用样品230-64E将疫苗261-007B-1、261-007C-1、261-007D-1、261-007F-1稀释2、4、8、16、和32倍。使用样品230-61C将疫苗261-007B、261-007C、261-007D、261-007F稀释2、4、8、16、和32倍。使用与上文所述相同的方案处理和分析了稀释和未稀释的样品。
结果
选择胰蛋白酶肽用于MRM监测
在Orbitrap质谱上分析纯化的ORF2蛋白的胰蛋白酶消化物进行肽的鉴别。选择了三种胰蛋白酶序列用于AQUA肽合成以及MRM监测,这是由于其强烈的和相对清晰的信号特征。在两个y-离子跃迁监测每种肽(参见表1)。另外,合成了肽ISIPFEYYR肽(SEQ ID NO:26)的延长版本(GGGTNK[IC13N15]S[IC13N15]PFEYYRIRKVKVEF)(SEQ ID NO:28)。此肽含有两个胰蛋白酶切割位点。计算了稳定同位素标记的肽[IC13N15]S[IC13N15]PFEYYR(SEQ ID NO:4)与肽ISIPFEYY[RC13N15](SEQ ID NO:4)的信号比例,以评估消化效率。在结果部分,我们会仅讨论与肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)和VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)相关的数据。ISIPFEYYR肽(SEQ ID NO:26)在讨论部分进行论述。
标准曲线
分别对肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)和VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)的跃迁794.4/1023.5、794.4/853.4、846.9/1131.5和846.9/786.4生成了四个标准曲线。没有数据点加了权重。将简单的线性拟合应用于所有数据点。每个曲线的R-square在0.99之上。三个重复样品(包括所有加工步骤)的变异系数(CV)范围从1%到12%,其中大部分数据在10%之下。图1显示了一组数据在794.4/1023.5和794.4/853.4的跃迁的整合。参见图2为标准曲线,表2为平均比例和计算的CV,以及表3为计算的误差百分比。
(a)
(b)
表2:脉冲AQUA肽强度的平均比例以及标准曲线的CV。(a)肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQID NO:4)的数据;(b)肽VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)的数据。
使用所演算的标准曲线,对每个浓度点计算了误差的百分比(表3)。除了肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)的最低浓度,误差百分比的绝对值范围在1%至22%,其中大部分数据在15%之下。
(a)
(b)
表3:标准曲线中使用的每个浓度点的误差百分比。(a)肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQID NO:4)的数据;(b)肽VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)的数据。
标准曲线的校验
使用三个QC溶液(ORF2浓度浓度为16μg/mL、32μg/mL和64μg/mL)来校验曲线。每个浓度点独立处理和分析三次。数据的CV低于8%。误差百分比的绝对值范围在1%至12%,其中大部分数据低于10%(表4)。
(a)
(b)
表4:校验QC样品的误差百分比。(a)衍生自肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)标准曲线的数据。(b)衍生自肽VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)标准曲线的数据
疫苗230-61A中的ORF2浓度
疫苗230-61A样品被独立处理和分析三次。使用衍生自肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQID NO:4)和VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)的标准曲线确定ORF2浓度。绝对值和CV在表5中示出。
(a)
(b)
表5:疫苗230-61A中ORF2蛋白的浓度.(a)衍生自肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)标准曲线的数据。(b)衍生自肽VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)标准曲线的数据。
空白和双空白
制备了空白(没有ORF2,但有添加的AQUA肽)和双空白(连AQUA肽也没有)样品(230-64E)用于研究。比较了空白和双空白轨迹至标准曲线的最低点(3.125μg/mL浓度)(肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4)和VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)跃迁的层析没有示出)。跃迁少于1%的干扰被监测。
疫苗系列稀释曲线
使用样品230-64E将疫苗261-007B-1、261-007C-1、261-007D-1、和261-007F-1系列给稀释了2、4、8、16、和32倍。使用样品230-61C将疫苗261-007B、261-007C、261-007D、和261-007F系列给稀释了2、4、8、16、和32倍。每个浓度点独立处理。所提取的质量选择的疫苗231-007B-1和疫苗231-007B的MRM色谱没有示出。将内源ORF2肽的峰面积与AQUA肽的峰面积的比例针对相对浓度(其中起始浓度定义为1)为261-007-1系列,肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4);261-007-1系列,肽VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24);261-007系列,肽NVDHVGLGTAFENSK(SEQ ID NO:4);和261-007系列,肽VEFWPCSPITQGDR(SEQ ID NO:24)作图。
基于此前所做的ELISA数据,ORF2浓度在每组疫苗内有微小变化,其中F具有最高的ORF2浓度以及B具有最低的ORF2浓度。MRM结果与ELISA数据一致。
讨论
ISIPFEYYR肽(SEQ ID NO:26)
ISIPFEYYR肽(SEQ ID NO:26)在选择用于对ORF2浓度进行定量的三个肽中具有最强的信号。然而,其由于以下原因而被放弃。首先,其标准曲线是显著非线性的,显示饱和的趋势。其次,疫苗稀释系列显示了异常的趋势,如1/2稀释点具有比未稀释的疫苗更高的比例。此种行为表明该肽与猪血清蛋白的一些相互作用。
消化效率和一致性
合成了更长版本的ISIPFEYYR肽(SEQ ID NO:26),其中有稳定同位素标记的异亮氨酸插入到序列中。其序列是(GGGTNK[IC13N15]S[IC13N15]PFEYYRIRKVKVEF)(SEQ ID NO:28)。此肽含有两个胰蛋白酶消化位点。在完全的胰蛋白酶消化之后,此更长的肽转变为[IC13N15]S[IC13N15]PFEYYR(SEQ ID NO:4)。计算了此肽的MRM跃迁与AQUA肽ISIPFEYY[RC13N15](SEQ ID NO:26)的MRM跃迁的比例,以确定胰蛋白酶消化效率和一致性。来自标准曲线系列的比例(数据未显示)显示此长肽的消化效率为大约2-2.5%。42个数据点的消化变异低于15%。此长肽低消化效率的一个可能解释是因为,其可能不具有完美的胰蛋白酶消化位点。完整ORF2蛋白的胰蛋白酶消化效率可以很不同并且比此肽高很多。
总结
最初由ABI MultiQuant软件(版本1.0)建议为最可能在本发明中有用的三个胰蛋白酶肽中的两个表现正如预期。出乎意料的是,虽然ISIPFEYYR肽(SEQ ID NO:26)在选择用于在起始的实验中对ORF2浓度进行定量的三个肽中具有最强的信号,但是其却未能具有用于定量分析所需的特征,或许是由于未预料到的与猪血清蛋白的相互作用。
实施例2:MRM的样品制备
用于分离病毒样颗粒和胰蛋白酶消化(用于MRM)的SEC-MRM方法
反转CHROMA SPIN柱若干次以完全使凝胶基质重悬浮。
首先从柱去除顶部的盖子,并继而去除底部的盖子。留住盖子。将柱的底部端轻柔地(贴住,但却并不紧)置入到所提供的一个2-ml的微型离心机管。
在摇摆篮转子中或者在固定角度转子中以700x g将所述柱离心3min。
从所述2-ml的管弃去所收集的缓冲液。轻柔地将所述柱再置于所述管中。加入1ml的PBS至凝胶。
在700x g再次离心3min。
将2-ml的收集管清空并将所述住再次置入相同的2-ml管。
加入1ml的PBS至凝胶并在700x g再次离心3min。
将2-ml的收集管清空并将所述柱轻柔的再次置入相同的2-ml管。在700x g再次离心3min以从所述柱中去除剩余的PBS。
将旋转柱置入第二个2-ml微型离心机管。小心地并且缓慢地将70μL样品载入到凝胶层平整表面的中心。不要让任何样品沿着柱的内壁流动。
以700x g离心3min.
微离心管含有VLP。
将10μl的VLP转移至96孔平板。
加入100μl的Master溶液(含有0.1%RapiGest)至平板的每个孔。
加入10μl的0.1M DTT并简短涡旋。用盖子盖住所述平板并在37摄氏度温育40min。
加入25μl的0.1M IAA。用盖子盖住所述平板并在室温于恒定涡旋下温育0.5hr(保持在黑暗中)。
加入15μl的8μg/ml胰蛋白酶(0.8μg/μl在最终溶液中)并简短涡旋。用盖子盖住所述平板并在37摄氏度温育16hr。
加入15μl的HCl(2M)并简短涡旋。用盖子盖住所述平板并在37摄氏度温育1hr.
过滤提取物并注射20μL至HPLC以及监测AB Sciex 5000上MRM跃迁。
免疫沉淀(IP)方法
1.通过将300μl的加样缓冲剂加入至每个孔,包被96-个位置的、Immulon 1B平底微量滴定介质结合聚苯乙烯平板。在室温温育10min。弃去加样缓冲剂并让平板干燥。
2.如本文所指引的那样稀释所有样品。取10μL的样品至LoBind Eppendoff小管。加入490μl的加样缓冲剂。通过涡旋混合好。
3.取50μL等分试样的稀释样品加至预包被的96-个位置的平板的每个孔。
4.向每个孔加入10μl的多克隆抗体(pAb)(加样缓冲剂中0.7mg/mL)。
5.伴有中等速度的涡旋在室温温育2h。
6.向每个孔添加100μl的蛋白G珠(加样缓冲剂中6mg/mL)。
7.伴有中等速度的涡旋在室温温育2h。
8.用洗涤缓冲液洗涤四次,并在每次洗涤之间进行涡旋。
9.向每个孔添加25μl的RapiGest溶液。
10.向每个孔添加10μl的工作标准溶液(50mM碳酸氢铵中1μg/mL)。
11.向每个孔添加10μl的0.1M DTT。
12.使用Thermomixer.在60℃伴有速度650RPM的涡旋下温育1h。
13.向每个孔添加25μl的0.1M IAA。
14.在黄光室内于室温伴有中等速度的涡旋温育1/2h。
15.向每个孔添加10μL的胰蛋白酶溶液(0.5mg/mL)。
16.在37℃伴有中等速度的涡旋温育过夜(16h)。
17.向每个孔添加10μl的3M HCl。
18.在37℃于室温伴有中等速度的涡旋温育1/2h。
19.将所有样品转移至多层筛HST过滤平板(该过滤平板用胶带与96个位置的2.0mL锥形孔平板绑在一起)。于3000RPM离心3min。
使用自动化的实验室样品操控平台的自动取样器方法将样品注射入HPLC柱
层析
分析泵程序-步骤表1:
补足泵程序-步骤表2:
阀程序
总时间(min) | 位置 | 点评 |
起始 | 左 | 加样品/脱盐 |
1.2 | 右 | 转移/洗脱 |
5.5 | 左 | 再生 |
质谱
使用了以下电喷雾电离源参数:驻留时间,所有MRM跃迁50ms;电离喷射电压,5000V;离子源温度,550℃;帘气体(CUR),20.DP:去簇电压。CE:碰撞能量。CXP:碰撞室逃逸电压。
尺寸排阻层析(SEC)-MRM
使用SEC确保了要测量的样品中仅存在VLP或者CLP,因为只有完整的VLP或CLP结构会通过而进入空隙级分。EC-MRM使得可以将VLP从具有高水平的不相关、外源蛋白的复杂基质中分离。此方法中无抗体。如果有可能存在含有完整VLP和降解的VLP的抗原批次,那么加入SEC步骤可确保在测定的MRM部分仅测量完整VLP(也即,真的VLP)。
实施例3:使用在无包膜PCV2 ORF2 VLP上的IP-MRM对PCV2a和PCV2b定量区分
PCV2a和PCV2b是抗原性相似但不同的VLP的抗原性亚型。类似地,PCV2a ORF2和PCV2b ORF2 VLP亚型是抗原性相似的,但在氨基酸水平却并是不同的。期望的PCV2 ORF2疫苗将含有VLP的混合物其包含PCV2a ORF2和PCV2b ORF2这两种亚型。
通常,会使用ELISA方法来确定疫苗中两种不同的PCV2 ORF2亚型的相对抗原含量(RAC)或相对效力(RP)。然而,能够区分内含物水平的PCV2a和PCV2b的ELISA将会需要两种不同的MAb(一种MAb仅与PCV2a反应,而另一种MAb仅与PCV2b反应)。但是,能够区分两种抗原性相似的PCV2a和PCV2b VLP的两种独特MAb的产生将会是非常困难的,也有可能是无法实现的任务。
IP-MRM允许使用多克隆抗体来结合PCV2a和PCV2b,随后通过MRM进行接下来的区分以及对PCV2a和PCV2b量的定量。
本文公开的和要求保护的所有组合物及方法可以在了解到本公开的情况下无需进行过度的实验即可制得和执行。当本发明的组合物和方法被描述为优选的实施方案时,对于本领域技术人员而言明显可以对所述组合物和方法以及对方法的步骤或步骤的顺序进行变化,而同时又不偏离本发明的概念、主旨和范围。更具体地说,明显可以将本文所述的物质替换为某些化学上和生理学上相关的物质但同样能实现相同的或类似的结果。所有对本领域技术人员而言很明显的此类相似的替代和改变都应认为是在由以下权利要求所限定的本发明的主旨、范围和概念之内的。
Claims (86)
1.稳定同位素标记的并且特异于至少一种病毒蛋白的至少一种特征肽在制备用于通过以下方法对样品中一或多种病毒蛋白的存在进行定量的试剂盒中的用途,所述方法包括:
a.向样品中加入已知量的稳定同位素标记的并且特异于至少一种病毒蛋白的至少一种特征肽;
b.用胰蛋白酶消化所述样品;
c.对所述样品运行质谱分析;和
d.确定所述样品中病毒蛋白的量,
其中所述蛋白是PCV2的ORF2,且其中所述稳定同位素标记的至少一种特征肽选自下列稳定同位素标记的肽:
a.VEFWPCSPITQGDR;和
b.NVDHVGLGTAFENSK。
2.权利要求1的用途,其中所述肽是在C-末端氨基酸残基处标记的。
3.权利要求1的用途,其中所述肽用选自H2、C13和N15的至少一种稳定同位素标记。
4.权利要求1的用途,其中所述一或多种病毒蛋白能够形成病毒样颗粒,和/或其中所述样品包含病毒样颗粒,所述病毒样颗粒包含多个所述一或多种病毒蛋白。
5.权利要求4的用途,其中所述病毒样颗粒包含PCV2a ORF2和/或PCV2b ORF2。
6.权利要求1的用途,其中确定所述样品中病毒蛋白的量包括:通过比较样品质谱分析的结果来确定所述样品中病毒蛋白的量。
7.权利要求6的用途,其中在质谱分析中将稳定同位素标记的特征肽的信号与所述样品的胰蛋白酶消化所产生的一或多种肽的信号进行比较。
8.权利要求6的用途,其中在质谱分析中将稳定同位素标记的特征肽的信号与所述样品中一或多种病毒蛋白的胰蛋白酶消化所产生的一或多种肽的信号进行比较。
9.权利要求1的用途,其中所述特征肽通过以下方式而预先选择:确定它们特异于要进行定量的病毒蛋白的胰蛋白酶消化物,和/或确定在所述病毒蛋白缺失时它们从所述样品的胰蛋白酶消化物中特异性缺失。
10.权利要求1的用途,其中所述方法还包括:
a.通过将样品的质谱分析结果与校准标准曲线比较来确定所述样品中病毒蛋白的量;或
b.对含有已知量的标记的和/或未标记的特征肽的标准物运行质谱分析;和通过将样品质谱分析的结果与标准物的结果比较来确定所述样品中病毒蛋白的量。
11.权利要求10的用途,其中用标准物的结果生成校准标准曲线并与样品质谱分析的结果进行比较。
12.权利要求1的用途,其中所述样品是制剂的样品。
13.权利要求12的用途,其中所述制剂是疫苗制剂和/或其中所述样品是疫苗制剂样品。
14.权利要求12的用途,其中所述制剂含有结合所述病毒蛋白的物质。
15.权利要求1-14中任一项的用途,其中所述特征肽是以下中的一种或多种:
(a)VEFWPCSPITQGDR,其中C-末端氨基酸残基R被稳定同位素C13和N15标记;和
(b)NVDHVGLGTAFENSK,其中C-末端氨基酸残基K被稳定同位素C13和N15标记。
16.权利要求1-14中任一项的用途,其中所述蛋白是PCV2亚型的ORF2的混合物。
17.权利要求16的用途,其中所述PCV2亚型是PCV2a和PCV2b。
18.权利要求17的用途,其中所述PCV2a的ORF2具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
19.权利要求17的用途,其中所述PCV2b的ORF2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
20.权利要求1-14中任一项的用途,其中所述PCV2的ORF2是PCV2a的ORF2和/或PCV2b的ORF2,且其中:
a.对于PCV2a的ORF2,所述特征肽是
NVDHVGLGTAFENSK,其中C-末端氨基酸残基K被稳定同位素C13和N15标记;以及
b.对于PCV2a的ORF2和PCV2b的ORF2,所述特征肽是
VEFWPCSPITQGDR,其中C-末端氨基酸残基R被稳定同位素C13和N15标记。
21.权利要求1-14中任一项的用途,其还包括:在蛋白酶消化前,免疫纯化所述病毒蛋白。
22.权利要求21的用途,其中所述免疫纯化包括:
a.使所述病毒蛋白接触抗体,所述抗体特异性结合于与特征肽中的序列相对应的病毒蛋白,其中所述抗体固定至底材,并且由此形成底材/抗体-蛋白复合物;
b.用不引起抗体-蛋白复合物解离的洗脱剂洗涤所述底材;
c.使所述抗体-蛋白复合物与蛋白酶接触;和
d.用引起抗体-蛋白复合物解离的洗脱剂洗脱由蛋白酶消化所产生的肽,
其中由此所获得的肽被用于后续步骤。
23.权利要求1-14中任一项的用途,其还包括:在蛋白酶消化之前,使所述样品通过尺寸排阻层析柱,并基于分子大小,从含有所述制剂中其它化合物的级分中选择出从柱洗脱下的含有病毒蛋白的级分。
24.权利要求23的用途,其中选择含有完整病毒样颗粒的级分。
25.权利要求1-14中任一项的用途,其还包括:在蛋白酶消化之后,免疫纯化病毒蛋白消化物。
26.权利要求1-14中任一项的用途,其中使用至少两种稳定同位素标记的特征肽,并且其中第一种特征肽用于定量样品中的病毒蛋白而第二种特征肽用于定性确定样品中的病毒蛋白的稳定性。
27.权利要求26的用途,其中所述定性确定样品中的病毒蛋白的稳定性是指测量样品中是否存在降解的病毒蛋白。
28.权利要求1-14中任一项的用途,其中所述运行质谱分析包括:
a.将所述样品离子化;
b.根据它们的质量或质荷比来分离多种离子;和
c.检测对应于所述病毒蛋白的至少一种离子。
29.权利要求28的用途,其中所述分离包括通过质量对所述多种离子排序。
30.权利要求28的用途,还包括产生用于检测的信号,所述信号代表所述病毒蛋白的至少一种离子的质量。
31.权利要求30的用途,还包括从所述信号加工所述病毒蛋白的至少一种离子的质量的谱。
32.权利要求28的用途,还包括根据质荷比产生所述样品的多种离子的质谱。
33.权利要求28的用途,还包括靶向质谱仪装置来检测所述至少一种离子。
34.权利要求28的用途,还包括检测对应于样品中另一种病毒蛋白的第二种离子。
35.权利要求28的用途,还包括使用三重四极杆质谱仪来运行所述分析。
36.权利要求1-14中任一项的用途,其中所述样品是动物材料的样品或者动物材料制剂的样品。
37.权利要求36的用途,其中所述动物材料选自体液或组织。
38.权利要求36的用途,其中所述动物材料选自:血液、血清、血浆、尿液、初乳、组织切片、和组织活检。
39.权利要求14的用途,其中结合所述病毒蛋白的物质是抗体。
40.权利要求39的用途,其中所述抗体以105mol–1至1012mol–1的亲和常数结合所述一种或多种病毒蛋白。
41.对疫苗制剂的样品中一或多种病毒蛋白的存在进行定量的方法,其中所述制剂的样品含有结合所述病毒蛋白的物质,所述方法包括:
a.用胰蛋白酶消化所述样品;
b.向所述样品加入已知量的至少一种特征肽,所述特征肽是稳定同位素标记的且特异于至少一种待定量的病毒蛋白,其中所述特征肽通过确定以下而预先选择:
i.所述特征肽特异于要定量的病毒蛋白的胰蛋白酶消化物;
ii.在所述病毒蛋白缺失时,所述特征肽从所述制剂的胰蛋白酶消化物中特异性缺失;
iii.所述特征肽在质谱分析中产生强信号;和
iv.所述特征肽在质谱分析中产生清晰信号;和
c.对所述样品和含有已知量的标记的和未标记的特征肽的标准物运行质谱分析;和
d.通过比较样品质谱分析的结果和标准物的结果确定所述疫苗制剂样品中病毒蛋白的量,
其中所述蛋白是PCV2的ORF2,且其中所述稳定同位素标记的至少一种特征肽选自下列稳定同位素标记的肽:
a.VEFWPCSPITQGDR;和
b.NVDHVGLGTAFENSK。
42.权利要求41的方法,其中所述肽是在C-末端氨基酸残基处标记的。
43.权利要求41的方法,其中所述肽用选自H2、C13和N15的至少一种稳定同位素标记。
44.权利要求41的方法,其中含有结合所述病毒蛋白的物质的制剂包含猪血清和/或来自其它物种的血清。
45.权利要求44的方法,其中结合所述病毒蛋白的物质包含抗体。
46.权利要求41-45中任一项的方法,其中所述特征肽是以下中的一种或多种:
(a)VEFWPCSPITQGDR,其中C-末端氨基酸残基R被稳定同位素C13和N15标记;和
(b)NVDHVGLGTAFENSK,其中C-末端氨基酸残基K被稳定同位素C13和N15标记。
47.权利要求41-45中任一项的方法,其中所述蛋白是PCV2亚型的ORF2的混合物。
48.权利要求47的方法,其中所述PCV2亚型是PCV2a和PCV2b。
49.权利要求48的方法,其中所述PCV2a的ORF2具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
50.权利要求48的方法,其中所述PCV2b的ORF2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
51.权利要求41-45中任一项的方法,其中所述PCV2的ORF2是PCV2a的ORF2和/或PCV2b的ORF2,且其中:
a.对于PCV2a的ORF2,所述特征肽是
NVDHVGLGTAFENSK,其中C-末端氨基酸残基K被稳定同位素C13和N15标记;以及
b.对于PCV2a的ORF2和PCV2b的ORF2,所述特征肽是
VEFWPCSPITQGDR,其中C-末端氨基酸残基R被稳定同位素C13和N15标记。
52.权利要求41-45中任一项的方法,其还包括:在蛋白酶消化前,免疫纯化所述病毒蛋白。
53.权利要求52的方法,其中所述免疫纯化包括:
a.使所述病毒蛋白接触抗体,所述抗体特异性结合于与特征肽中的序列相对应的病毒蛋白,其中所述抗体固定至底材,并且由此形成底材/抗体-蛋白复合物;
b.用不引起抗体-蛋白复合物解离的洗脱剂洗涤所述底材;
c.使所述抗体-蛋白复合物与蛋白酶接触;和
d.用引起抗体-蛋白复合物解离的洗脱剂洗脱由蛋白酶消化所产生的肽,
其中由此所获得的肽被用于后续步骤。
54.权利要求41-45中任一项的方法,其还包括:在蛋白酶消化之前,使所述样品通过尺寸排阻层析柱,并基于分子大小,从含有所述制剂中其它化合物的级分中选择出从柱洗脱下的含有病毒蛋白的级分。
55.权利要求54的方法,其中选择含有完整病毒样颗粒的级分。
56.权利要求41-45中任一项的方法,其还包括:在蛋白酶消化之后,免疫纯化病毒蛋白消化物。
57.权利要求41-45中任一项的方法,其中使用至少两种稳定同位素标记的特征肽,并且其中第一种特征肽用于定量样品中的病毒蛋白而第二种特征肽用于定性确定样品中的病毒蛋白的稳定性。
58.权利要求57的方法,其中所述定性确定样品中的病毒蛋白的稳定性是指测量样品中是否存在降解的病毒蛋白。
59.制备含有一种或多种病毒疫苗的疫苗制剂的方法,所述方法包括使用多反应监测-质谱用于对所述疫苗制剂进行定量或定性测定或者用于质量控制确定,其中所述疫苗制剂含有结合所述病毒疫苗中的病毒蛋白的物质,其中所述方法包括
a.向所述样品中加入已知量的至少一种特征肽,所述特征肽是稳定同位素标记的且特异于至少一种病毒蛋白;
b.用胰蛋白酶消化所述样品;
c.对所述样品进行质谱分析;和
d.确定所述疫苗制剂中的病毒蛋白的量,
其中所述蛋白是PCV2的ORF2,且其中所述稳定同位素标记的至少一种特征肽选自下列稳定同位素标记的肽:
a.VEFWPCSPITQGDR;和
b.NVDHVGLGTAFENSK。
60.权利要求59的方法,其中所述肽是在C-末端氨基酸残基处标记的。
61.权利要求59的方法,其中所述肽用选自H2、C13和N15的至少一种稳定同位素标记。
62.权利要求59的方法,其中所述确定所述疫苗制剂中的病毒蛋白的量包括:通过比较样品质谱分析的结果来确定所述疫苗制剂样品中的病毒蛋白的量。
63.权利要求59的方法,其中在质谱分析中将稳定同位素标记的特征肽的信号与样品胰蛋白酶消化产生的一或多种肽的信号进行比较。
64.权利要求59的方法,其中在质谱分析中将稳定同位素标记的特征肽的信号与样品中一或多种病毒蛋白的胰蛋白酶消化所产生的一或多种肽的信号进行比较。
65.权利要求59的方法,其中所述特征肽通过以下方式而预先选择:确定它们特异于要进行定量的病毒蛋白的胰蛋白酶消化物,和/或确定在所述病毒蛋白缺失时它们从所述制剂的胰蛋白酶消化物中特异性缺失。
66.权利要求59的方法,其还包括:
a.通过将样品质谱分析的结果与校准标准曲线比较来确定所述疫苗制剂样品中的病毒蛋白的量;和/或
b.对含有已知量的标记的和/或未标记的特征肽的标准物运行质谱分析;和
c.通过将样品质谱分析的结果与标准物的结果进行比较来确定所述疫苗制剂样品中的病毒蛋白的量。
67.权利要求66的方法,其中用标准物的结果生成校准标准曲线并与样品质谱分析的结果进行比较。
68.权利要求41-45和59-67中任一项的方法,其中结合所述病毒蛋白的物质是抗体。
69.权利要求68的方法,其中所述抗体以105mol–1至1012mol–1的亲和常数结合所述一种或多种病毒蛋白。
70.权利要求59-67中任一项的方法,其中多反应监测-质谱包括:
a.用胰蛋白酶消化所述疫苗制剂的样品;
b.向所述样品加入已知量的至少一种特征肽,所述特征肽是稳定同位素标记的且特异于至少一种病毒蛋白,其中所述特征肽是通过确定以下而预先选择的:
i.所述特征肽特异于要定量的病毒蛋白的胰蛋白酶消化物;
ii.在所述病毒蛋白缺失时所述特征肽从所述制剂的胰蛋白酶消化物中特异性缺失;
iii.所述特征肽在质谱分析中产生强信号;和
iv.所述特征肽在质谱分析中产生清晰信号;和
c.对所述样品和含有已知量的标记的和未标记的特征肽的标准物运行质谱分析;和
d.通过比较样品质谱分析的结果和标准物的结果确定所述疫苗制剂样品中所述病毒蛋白的量。
71.权利要求41-45和59-67中任一项的方法,其中所述运行质谱分析包括:
a.将所述样品离子化;
b.根据它们的质量或质荷比来分离多种离子;和
c.检测对应于所述病毒蛋白的至少一种离子。
72.权利要求71的方法,其中所述分离包括通过质量对所述多种离子排序。
73.权利要求71的方法,还包括产生用于检测的信号,所述信号代表所述病毒蛋白的至少一种离子的质量。
74.权利要求73的方法,还包括从所述信号加工所述病毒蛋白的至少一种离子的质量的谱。
75.权利要求71的方法,还包括根据质荷比产生所述样品的多种离子的质谱。
76.权利要求71的方法,还包括靶向质谱仪装置来检测所述至少一种离子。
77.权利要求71的方法,还包括检测对应于样品中另一种病毒蛋白的第二种离子。
78.权利要求71的方法,还包括使用三重四极杆质谱仪来运行所述分析。
79.稳定同位素标记的且特异于至少一种病毒蛋白的至少一种特征肽在制备用于诊断或者监测PCV2病毒感染的试剂盒中的用途,其中所述稳定同位素标记的至少一种特征肽选自下列稳定同位素标记的肽:
a.VEFWPCSPITQGDR;和
b.NVDHVGLGTAFENSK。
80.权利要求79的用途,其中所述肽是在C-末端氨基酸残基处标记的。
81.权利要求79的用途,其中所述肽用选自H2、C13和N15的至少一种稳定同位素标记。
82.权利要求79的用途,其中所述病毒感染是PCV2a和/或PCV2b感染。
83.分离的质量-标记的肽,其选自以下稳定同位素标记的肽:
a.VEFWPCSPITQGDR;和
b.NVDHVGLGTAFENSK。
84.权利要求83的分离的质量-标记的肽,其中所述肽是在C-末端氨基酸残基处标记的。
85.权利要求83的分离的质量-标记的肽,其中所述肽用选自H2、C13和N15的至少一种稳定同位素标记。
86.分离的质量-标记的肽,其选自:
a.VEFWPCSPITQGDR,其中C-末端氨基酸残基R被稳定同位素C13和N15标记;和
NVDHVGLGTAFENSK,其中C-末端氨基酸残基K被稳定同位素C13和N15标记。
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