CN105026412A - 一种对表面功能化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是以尽可能低的程序上的努力来进行表面功能化且没有有害的副作用，其中功能化的表面要具有永久化学活性和高于1的高取代度(DS)。根据本发明，该功能化使用具有至少一个通过极性氨基甲酸酯连接和空间间隔(X)连接的游离功能基团，特别是氨基的溶解的寡糖或多糖衍生物，按照通式I所示：

Description

一种对表面功能化的方法
本发明涉及一种对表面功能化的方法，例如，对期望具有用于化学和生化应用的特定表面性质的表面功能化，特别是作为用于分析目的的样品载体，或用于即时的物理、化学、生物和工艺应用，其中所述表面被提供具有定义的性质和功能。特别的，合成聚合物和天然聚合物被用作这些表面的材料，例如多糖和蛋白质、纸、玻璃、陶瓷、硅、金属和金属氧化物包括磁性材料。
通过物理和/或化学方法对表面进行修饰是一个重要过程，用于便利地改变材料的性质并使其适合期望的应用。
例如，等离子方法具有重要作用，但是具有表面改变并非永久性的不足。
同样的，已知很多种将无机或有机分子沉积并固定于表面的方法。从而，例如，可以通过沉积氧化钛或氧化硅来制备超亲水或超疏水表面(Peter Forbes，Spektrum der Wissenschaft， 2009年8月，第88-95页)。这些表面是化学惰性的。对表面修饰也采用了不同的聚合物。已知可能是最佳的用途涉及聚合物涂膜剂，其已经被长期广泛应用。这些也形成了非反应性表面(G. Menges等人，Menges Werkstoffkunde Kunststoffe，Carl Hanser Verlag，Munich 2011，第23页)。
DE 10 2005 008 434 A1描述了所谓的氨基纤维素，其可沉积至不同材料上，氨基是化学反应性的并适于例如酶的共价固定。这些表面被认为允许材料的生物相容性精加工(finishing)和生物分析的开发，例如，通过酶的结合。WO 2006/089499 A1中描述的氨基纤维素通过众所周知的按照亲核取代反应(SN反应)的对甲苯磺酸酯与二胺或寡胺的反应来获得，其中为了获得可溶性产物，二胺或寡胺必须以10-20摩尔每摩尔甲苯磺酰基的极大过量值使用。由于SN2反应机理，形成了每重复单元具有最大数量的一个胺基取代的6-脱氧-6-氨基纤维素衍生物，相当于平均取代程度(DS)为1 (K. Petzold-Welcke等人：Unconventional Cellulose Products Through Nucleophilic Displacement Reactions，Macromolecular Symposia 280，2009，72-85)。脱氧-氨键的结构涉及四面体碳原子(sp3碳)，由于其空间需求，其在与表面反应中存在问题。此外，C-N键中的次级氮原子是反应性的，并可被质子化，从而可能导致难以处理的副反应和次级结构。
虽然纤维素衍生物的取代度可以达到3，但是在实践中此反应取得的最大值为0.8。因此，尽管原则上在表面上可能有无数的偶联，但是实践中在表面上只有相对较低的数目的氨基存在。生产中对二胺或寡胺不可避免的高过量使用不仅是不经济的，还额外需要繁琐和成本密集的氨基纤维素纯化。样品中的二胺或寡胺残留会导致不同的不期望的不良反应，包括应用中的危险的生物效应，因为已知二胺与寡胺往往趋向于是生物活性的。6-脱氧-6-氨基纤维素衍生物的性质，如在水或有机溶剂中的溶解性，只能通过复杂的后续化学方法，如对残留羟基的酯化或醚化来获得。由后续化学方法导致对甲苯磺酰基不受控地裂解、并从而形成具有不清楚分布的非单一结构是一个另外的缺点 (P. Berlin等人：A novel soluble aminocellulose derivative type: its transparent film-forming properties and its efficient coupling with enzyme proteins for biosensors，Macromol. Chem. Phys. 2000，201，2070-2082)。此外，在与氨的SN反应中酯基也不受控制地裂解(P. Berlin等人：Film-forming aminocellulose derivatives as enzyme-compatible support matrices for biosensor developments，Cellulose 2003，10，343-367)。
根据EP 1 222 926 A1，通过还原胺化将氨基引入多糖，优选的分支状葡聚糖。从而，该多糖被首先氧化为重复单元裂解的对应二醛多糖衍生物。原则上，可以在聚合物中实现相对高数量的氨基，平均取代度为2，但是这并未达到，因为二醛的氧化仅有部分是可能的，另外，仅有部分存在的醛基与二胺或寡胺反应。从而无论是可从分支状葡聚糖获得的还是可从不分支的纤维素获得的含氨基的多糖衍生物都表现出粘接性能。它们可作为基因治疗中的聚阳离子。与氨基基团不同，阳离子的铵根基团不再是化学活性的，从而不适于上述应用。
材料修饰的另一方法从异氰酸酯基团活化的聚合物开始(US 5,728,751 A)。众所周知异氰酸酯是极毒的化合物，这不但首先排除了生物领域的应用，还在其制备和使用中引入了不可计算的风险。
多糖羟基的活化也可通过转化为碳酸盐来获得，其中使用高毒性的光气或氯碳酸盐作为试剂 (S. Barker，H.M. Disney，P. Somers：The reaction of dextran carbonate with amino acids and polypeptides，Carbohydrate Research 1972，25，237-241；M.S. Chaves，F. Arranz：Water-insoluble dextrans by grafting 2: Reaction of dextrans with normal-alkyl chloroformates, Chemical and enzymatic hydrolysis，Macromolecular Chemistry and Physics，1985，186，17-29)。然而，该转化大部分得到具有结构变异性的产物(例如，除了单碳酸酯外还形成环碳酸酯结构)，且由于交联反应形成了不溶性产物。虽然如此，但是纤维素碳酸酯优选不仅与具有一个胺基功能的胺反应，还与二胺和寡胺反应，以获得非反应性产物，或者在后者的情形下获得未定义结构的氨基纤维素，后者在纸的生产中有兴趣(DE 38 36 599 A1)。纤维素衍生物主要作为起始材料。纤维素自身也可以按照所描述的方法进行反应，但是仅能达到1.0-1.2的DS (可达到的最大DS为3.0)。同样，本领域尚不知晓其在表面功能化方面的用途。
水溶性多糖例如葡聚糖和N,N'-羰二咪唑活化后的水溶性纤维素衍生物的反应，以及与二胺的反应产生了阳离子的和水溶性的聚电解质，其与DNA形成多聚物并可用于基因治疗 (US 2011/0251265 A1)。然而，在此情况下，仍然需要使用20倍至30倍过量的二胺以避免交联。从而，大量的工作必须用于产物的纯化。根据US 2011/0251265 A1中提供的信息，未衍生化的纤维素明显不适于该流程。
还已知用N,N'-羰二咪唑活化后对表面进行直接修饰并随后与单胺反应，但不涉及控制的反应。无论是基团的结构还是数量均不能进行选择性地控制。特别的，不存在游离的反应性伯胺基 (Sabrine Alila，Ana Maria Ferraria，Ana Maria Botelho do Rego，Sami Boufi：Controlled表面modification of cellulose fibers by amino derivatives using N,N-carbonyldiimidazole as activator，Carbohydrate Polymers 77，2009，553-562)。虽然该流程适于纤维的原位修饰，但是其不适于包被材料，因为剩余羟基的反应总是导致交联并从而导致形成不溶性产物。
本发明的目的是以尽可能低的程序上的努力来进行表面功能化且没有现有技术中描述的副作用，其中功能化的表面要具有永久化学活性和高于1的高取代度(DS)。
令人吃惊的是，已发现溶解的按照下述通式I的寡糖或多糖衍生物——其含有至少一个游离的功能基团，所述功能基团通过极性氨基甲酸酯连接和空间间隔(X)特别是氨基进行连接，并在该溶液中与待处理的表面接触——会产生非常好的表面功能化，其具有永久性化学活性和比已知现有技术更高的平均取代度 (DS)。
其中R1 = NH2、SH或OH；
R2或(独立的) R3 = H或；且
在优选的实施方式中，氨基取代的寡糖或多糖是同多糖或杂多糖、葡聚糖特别是β-1-4-葡聚糖、纤维素或几丁质。
有利的化合物包括具有通式II的功能基团的至少双功能性的氨基取代寡糖或多糖
其中X表示任何有机部分，特别是芳族、稠合芳族、杂环和/或杂原子部分、也可选被取代的烷基和/或烯基部分、或如(I)中公开的X部分。
寡糖或多糖可便利地具有通式III的纤维素骨架
其中纤维素的羟基至少部分被OC(O)NH(X)NH2取代，其中X表示任何有机部分，特别是芳族、稠合芳族、杂环和/或杂原子部分、也可选被取代的烷基和/或烯基部分、或包括如(I)中公开的X部分。纤维素有利的采用30-1500的基于其分子量的平均聚合度(DP)，优选在50-300的范围。
羟基或巯基也可被用作所述通过极性氨基甲酸酯连接和空间间隔连接的游离功能基团。
在加工工艺方面，表面功能化可以以本质上已知的方式进行。将按照通式I的所提出的寡糖或多糖的溶液接触待功能化的表面，对所述表面特别适合的是合成聚合物和天然聚合物，例如多糖和蛋白质、纸、玻璃、陶瓷、硅、金属、金属氧化物包括磁性材料。该接触可通过例如用溶剂进行浸渍和随后的洗涤来实现，或者通过采用不同技术的喷雾来实现。然而，还可以使用复杂的方法，例如旋转涂布或浸渍涂布以及其它类似的已知方法。
根据本发明的通过寡糖或多糖的功能化通过在处理的表面上的附着自组装形成了含有活性基团、特别是氨基的非常薄的牢固的层。"牢固的层"表示它们在随后对其进行处理中不能被去除，即使输入额外的能量，例如，在超声处理中。由本发明产生的这些表面层即使在多种电解质组分的影响下也不能被去除，并且对由该功能化所预期的其强度和化学活性也不会有不利影响。
从而，该表面功能化产生了具有新的性质的材料，起始材料并不具有此种性质。
表面的疏水-亲水平衡可被改变而不必进行特别的努力。从而，在水纯化中的很多如合成聚合物如聚乙烯过滤器中使用的本身为疏水的并可以是多孔的材料的作用可被显著改进。疏水聚合物在侧向流或溢流应用中的应用也被显著改进。此外，在表面上可产生电荷，并从而可以产生阴离子交换的性质。同样，蛋白质可从而通过静电被可逆地固定至表面，而由于来自高平均取代度(DS)的高正电荷，这可以有效率的进行。可以利用可获得的高电荷将蛋白质固定至选定的方向。
DS被定义为具有至少两个反应性氨基功能团被通过氨解引入寡糖或多糖的胺的数量除以寡糖或多糖初始羟基数量的商，再乘以每寡聚物或多聚物基本单位的初始羟基数。
所述反应性基团，特别是氨基，与例如多种醛直接形成共价键或在与二醛或二羧酸或其环酐反应后间接形成共价键，从而该分子被牢固不可逆地结合，如上所述。可以对按照本发明的材料复合层按常规简单地进行生物化学中例如使用戊二醛或琥珀酐所建立的检测和处理反应，而生物分子以及抗体可共价固定至表面上。
为了获得寡糖或多糖，羟基至少一部分被取代为氨基。按照本发明待使用的寡糖或多糖——其由基本单位构成——可以通过以下步骤获得：将寡糖或多糖的羟基衍生化为碳酸酯结构以获得一种衍生化的寡糖或多糖，然后将该衍生化的寡糖或多糖与具有至少两个反应性氨基功能团的胺进行氨解反应以形成具有0.4-2.9的DS的氨基取代的寡糖或多糖，DS优选的为0.8-2.0，更优选的为1.0-1.5。
寡糖或多糖碳酸酯，优选的寡糖或多糖苯基碳酸酯的合成在溶于例如N,N-二甲基乙酰胺/LiCl的寡糖或多糖与氯或氟碳酸酯的均相反应中实现。可获得具有DS值在0.3-2.5范围的可溶性结构均一的产物，其可通过使用二胺和寡胺的氨解被转化为根据通式I的多糖衍生物。与胺的反应不需要摩尔过量，而是可以使用按照期望的平均取代度的等摩尔量的胺，其中可以利用二胺或寡胺的固有选择，例如使用氨基苄胺；或利用氨基功能团的暂时性保护，例如使用叔丁氧羟基(Boc基团)。
从而，氨基苄胺的苄胺基显然比芳胺基更有亲核性，并因此会选择性地与碳酸酯基团反应。从而即使没有摩尔过量也防止了通过双氨基甲酸酯结构产生的聚合物链的交联，并获得了具有定义结构的聚合物，因为芳胺基永远处于末端位置。通过Boc基团在一侧保护了脂肪二胺，且不需要摩尔过量的胺。原则上，该反应可在非常温和的条件下（室温）发生。从而，不会形成可能不利地影响生物或光谱方法的有色副产物。
与脱氧胺结构相反，由于sp2碳导致氨基甲酸酯连接是平面的，并具有与表面相互反应的最优结构。氨基甲酸酯结构不是反应性的，不能被质子化。从而，按照本发明的化合物中存在反应性的伯胺功能团，从而产生清楚的反应性和随之而来的清楚的结构，这在应用中非常有利地产生了清楚的结构-性能关系。
下文中通过实施例进一步解释了本发明。
实施例 1 ：
纤维素苯基碳酸酯的合成：
纤维素(Avicel，DP 220，5 g，30.8 mmol)在150 ml的干燥DMAc中120 °C下搅拌处理2小时；然后，在90 °C下加入9 g的LiCl (212.3 mmol)。搅拌悬液直至获得澄清溶液(5-24小时)。在250 ml双层壁反应器中将纤维素溶液冷却至0 °C，在N2环境下加入相当数量的吡啶和碳酸苯酯氯。0 °C反应4小时后，在1.5升冰水中沉淀混合物，将沉淀滤除并用1升水洗涤2次，1升乙醇洗涤2次。在40 °C下将产物真空干燥然后用120 ml丙酮再沉淀。
AGU/碳酸苯酯氯摩尔比 编号 DS 得率(%)
1.0:1.0 1 0.84 92
1.0:1.5 2 1.17 94
1.0:3.0 3 1.49 99
1.0:5.0 4 1.75 98
1.0:10.0 5 1.98 94
来自样品1的光谱数据：
FT-IR (KBr)：3460 cm-1 ν(OH)，3070 cm-1ν(CHarom)，2900 cm-1ν(CH)，1766 cm-1ν(C=O)，1254 cm-1ν(C-O-C)
1H NMR (250 MHz，DMSO-d 6)：δ [ppm] = 7.38-7.25 (Harom)，5.60-3.16 (H-1-H-6和OH)
13C NMR (250 MHz，DMSO-d 6)：δ [ppm] = 153.4 (C=O)，151.2 (C ipso )，130.0 (C-H m )，126.6 (C-H p )，121.8 (C-H o )，102.7 (C-1)，79.1，74.3，73.0，72.3 (C-4，C-5，C-3，C-2)，67.7 (C-6s)，60.8 (C-6)。
实施例 2 ：
纤维素苯基碳酸酯的氨解：
a) 使用N-叔丁氧羰基乙二胺：
纤维素苯基碳酸酯(2 g)在15 ml的DMF中强烈搅拌混合对应的胺的15 ml的DMF溶液(见下文)，将反应混合物在60 °C下搅拌24小时。然后，在400 ml水中沉淀产物，滤除，用水洗涤2次，用碳酸氢钠溶液洗涤2次，然后再用水洗涤2次。40 °C下真空干燥后得到白色粉末。
b) 使用对氨基苄胺：
纤维素苯基碳酸酯(1 g)在8 ml的DMF中强烈搅拌混合对氨基苄胺(2-3当量每碳酸酯基团)的8 ml的DMF溶液，将反应混合物在60 °C下搅拌24小时。然后，在150 ml异丙醇中沉淀产物，滤除，用异丙醇洗涤4次。40 °C下真空干燥后得到白色粉末。
DS碳酸酯 胺 编号 DS DS得率(%)
1.49 N-Boc-EDA 6 1.35 91
1.75 N-Boc-EDA 7 1.75 100
1.75 N-Boc-BDA 8 1.71 98
1.75 N-Boc-DA-10 9 1.69 97
1.98 N-Boc-EDA 10 1.77 89
1.75 p-APA 11 1.64 94
N-Boc-EDA：N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺，N-Boc-BDA：N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺，N-Boc-DA-10：N-叔丁氧羰基-2,2'-(伸乙二氧基)二乙胺，p-ABA：对氨基苄胺
来自样品7的光谱数据：
FTIR (KBr)：1701 cm-1 (νC=O)，13C NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ [ppm] = 156 (C=O)，102.9 (C-1)，101.1 (C-1')，78.3 (CMe3)，82–72 (C-2，C-3，C-4，C-5)，63.4 (C-6)，CH2被溶剂信号隐藏，28.7 (CH3)。
实施例 3 ：
Boc保护基团的脱保护：
将纤维素氨基甲酸酯(2 g)溶于40 ml的TFA并随后在室温搅拌15 min。在400 ml的异丙醇中沉淀分离产物，然后用100 ml的每种沉淀剂洗涤4次。40 °C下真空干燥后，将产物溶于50 ml的水并用离子交换剂Amberlite IRA-410 (氯仿)处理过夜。然后将得到的溶液冷冻干燥。
氨乙基纤维素氨基甲酸酯的光谱数据：
FTIR (KBr)：1710 cm-1 (νC=O)，13C NMR (100 MHz，D2O)：δ [ppm] = 158 (C=O)，102.9 (C-1)，101.8 (C-1')，81–71 (C-2，C-3，C-4，C-5)，63.0 (C-6)，39.6 (CH2)，38.1 (CH2)。
实施例 4 ：
金表面包被：
将金包被的硅片在包被前置于食人鱼洗液(硫酸/过氧化氢，2:1)中3小时以清洁表面。然后，将载体用蒸馏水彻底清洗。使用旋涂仪(MicroTec Delta 10TT，Süss)在200转每分钟下用DS 1.43的1%氨基纤维素乙基氨基甲酸酯包被晶片，然后用蒸馏水清洗。包被的表面的接触角(水)为61°。
实施例 5 ：
金单晶的包被：
用浓缩硫酸处理Au(111)基质48小时，用蒸馏水和无水乙醇洗涤，在氮气流中干燥，然后用丁烷煤气喷灯加热5-10 min直至其发光。然后用原子力显微镜(Dualscope C-21，DME)检测表面，并随后用DS 1.43的氨基纤维素乙基氨基甲酸酯的0.1%溶液处理。然后将其用水剧烈冲洗。表面的粗糙度(RMS，均方根)由于功能化而从80 pm (Au(111)基质)增加至260 pm，这显示了包被。
实施例 6 ：
通过QCM对金的包被进行定量：
氨乙基纤维素氨基甲酸酯在金表面的吸附通过石英晶体微天平(Q-Sence)进行了证明。在包被前用食人鱼溶液对QCM底物进行了清洁，用蒸馏水清洗，然后在氮气流中干燥。将晶体淹没在氨乙基纤维素氨基甲酸酯(浓度为0.001-1%)溶液中并随后用水洗涤直至达到平衡频率。对于≥ 0.1%的浓度，检测到了200 ng每cm2的吸附质量。
实施例 7 ：
玻璃的包被：
包被前用食人鱼溶液清洁玻璃载体(珠Ø1.5 mm，KGM Fulda)并随后用蒸馏水清洗。将玻璃浸入DS 1.43的氨基纤维素乙基氨基甲酸酯的0.1%水溶液中15 min，然后用蒸馏水洗涤。
为了测定氨基的表面密度，将它们用4,4'-二甲氧三苯甲基氯进行衍生化，用甲醇高氯酸处理，二甲氧三苯甲基阳离子的浓度通过UV/Vis光谱(498 nm)进行检测。对于玻璃上的氨乙基纤维素氨基甲酸酯层，发现了0.6-0.8 nmol每cm2的氨基密度。
实施例 8 ：
聚乙烯的包被：
在氧等离子体中处理聚乙烯载体并随后置于DS 1.43的氨基纤维素乙基氨基甲酸酯的0.1%水溶液中15 min。然后用蒸馏水洗涤载体。氨基的浓度为0.30 nmol每cm2。
实施例 9 ：
抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在NH2-功能化载体上用均双功能试剂戊二醛进行固定化：
1.通过戊二醛对NH2-功能化表面进行活化：
将10个NH2-功能化PE微过滤器(h = 2.5 mm，Ø= 5 mm，180型，Porex)与2 ml的5%戊二醛水溶液在室温下搅拌15分钟。各自用3 ml水洗涤4次后，微过滤器可用于固定化。
2. 抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在戊二醛活化表面上的固定化：
对如1所述处理的PE微过滤器，加入75 µg抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的2 ml重碳酸酯缓冲液(0.1 M，pH 9.5)溶液，并在室温下搅拌4小时。为了封闭剩余的活化表面，在固定化后对固定化溶液加入5 µl的乙醇胺，并持续搅拌另外2个小时。各自用3 ml水洗涤4次并随后在空气流中干燥后，获得了CRP-精炼的(affine)表面。成功固定了6.0 µg每微过滤器，其中30%的固定化抗体是活性的。
实施例 10 ：
通过EDC/s-NHS化学手段进行抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在COOH-功能化载体上的固定化：
1. NH2-功能化表面的再功能化和随后的COOH-功能化表面的活化：
10个NH2-功能化PE微过滤器在室温下在2 ml的琥珀酸酐(c = 40 mg/ml)溶液和5 µl的吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌16小时。通过琥珀酸酐与表面氨基的反应将羧基引入PE微过滤器上。各自用3 ml水重复洗涤表面后，可以通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺 (EDC)和硫代-N-羟基琥珀酰亚胺(s-NHS)活化羧基。从而，将微过滤器在2 ml的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液(0.1 M，pH 5.5)中与EDC (2 mM)和s-NHS (5 mM)一起搅拌，并搅拌30分钟。
2.抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在活化的COOH表面上的固定化：
用水洗涤如1所述处理的微过滤器，随后加入75 µg抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的2 ml磷酸缓冲液(0.1 M，pH 7.4)溶液，并在室温下搅拌2小时之后实现了抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的固定化。通过对固定化溶液加入5 µl的乙醇胺并搅拌另外的60分钟封闭了剩余的活化羧基。各自用3 ml水洗涤4次并随后在空气流中干燥后，获得了CRP-精炼的(affine)表面。成功固定了7.0 µg每微过滤器，其中30%的固定化抗体是活性的。
实施例 11 ：
用试剂抗坏血酸进行抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在NH2-功能化载体上的固定化：
1. 通过抗坏血酸进行NH2-功能化表面活化：
将10个NH2-功能化PE微过滤器(h = 2.5 mm，Ø = 5 mm，180型，Porex)与2 ml的抗坏血酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温下搅拌15分钟。各自用3 ml水洗涤4次后，微过滤器可用于固定化。
2.抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在抗坏血酸活化表面上的固定化：
对如1所述处理的PE微过滤器，加入75 µg抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的2 ml重碳酸酯缓冲液(0.1 M，pH 9.5)溶液，并在室温下搅拌16小时。为了封闭剩余的活化表面，在固定化后对固定化溶液加入5 µl的乙醇胺，并持续搅拌另外2个小时。各自用3 ml水洗涤4次并随后在空气流中干燥后，获得了CRP-精炼的(affine)表面。成功固定了5.2 µg每微过滤器，其中35%的固定化抗体是活性的。
实施例 12 ：
用试剂苯醌进行抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在NH2-功能化载体上的固定化：
1. 通过苯醌进行NH2-功能化表面活化：
将10个NH2-功能化PE微过滤器(h = 2.5 mm，Ø = 5 mm，180型，Porex)与2 ml的苯醌的N,N-二甲基甲酰胺饱和溶液在室温下搅拌15分钟。各自用3 ml的DMF洗涤4次随后用水洗涤2次后，微过滤器可用于固定化。
2.抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在苯醌活化表面上的固定化：
对如1所述处理的PE微过滤器，加入75 µg抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的2 ml重碳酸酯缓冲液(0.1 M，pH 9.5)溶液，并在室温下搅拌16小时。为了封闭剩余的活化表面，在固定化后对固定化溶液加入5 µl的乙醇胺，并持续搅拌另外2个小时。各自用3 ml水洗涤4次并随后在空气流中干燥后，获得了CRP-精炼的(affine)表面。成功固定了6.0 µg每微过滤器，其中36%的固定化抗体是活性的。
实施例 13 ：
用试剂4,4'-二羟基联苯缩水甘油醚进行抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在NH2-功能化载体上的固定化：
1. 通过4,4'-二羟基联苯缩水甘油醚进行NH2-功能化表面活化：
将10个NH2-功能化PE微过滤器(h = 2.5 mm，Ø = 5 mm，180型，Porex)与2 ml的4,4'-二羟基联苯缩水甘油醚的5%水溶液在室温下搅拌15分钟。各自用3 ml的DMF洗涤4次随后用水洗涤2次后，微过滤器可用于固定化。
2. 抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在4,4'-二羟基联苯缩水甘油醚活化表面上的固定化：
对如1所述处理的PE微过滤器，加入75 µg抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的2 ml重碳酸酯缓冲液(0.1 M，pH 9.5)溶液，并在室温下搅拌16小时。为了封闭剩余的活化表面，在固定化后对固定化溶液加入5 µl的乙醇胺，并持续搅拌另外2个小时。各自用3 ml水洗涤4次并随后在空气流中干燥后，获得了CRP-精炼的(affine)表面。成功固定了5.5 µg每微过滤器，其中35%的固定化抗体是活性的。
实施例 14 ：
通过粘附反应进行抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在COOH-功能化载体上的固定化：
1.用于在表面上引入羧基的NH2-功能化表面的再功能化：
10个NH2-功能化PE微过滤器在室温下在2 ml的琥珀酸酐(c = 40 mg/ml)溶液和5 µl的吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌16小时。通过琥珀酸酐与表面氨基的反应将羧基引入PE微过滤器上。
2.抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在COOH-功能化表面上的固定化：
用水洗涤如1所述处理的微过滤器，随后加入75 µg抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的2 ml磷酸缓冲液(0.1 M，pH 7.4)溶液，并在室温下搅拌2小时之后实现了抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的固定化。通过对固定化溶液加入10 µl的10%牛血清白蛋白(BSA)水溶液并搅拌另外的60分钟封闭了剩余的活化羧基。各自用3 ml水洗涤4次并随后在空气流中干燥后，获得了CRP-精炼的(affine)表面。成功固定了5.9 µg每微过滤器，其中15%的固定化抗体是活性的。
实施例 15 ：
通过粘附反应进行抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在SO3H-功能化载体上的固定化：
1. 用于在表面上引入磺酸基的NH2-功能化表面的再功能化：
将10个NH2-功能化PE微过滤器在2 ml的4,4'-联苯二磺酸二氯的干乙醚饱和溶液在室温下搅拌15分钟。通过4,4'-联苯二磺酸二氯与表面氨基的反应将磺酸氯基团引入PE微过滤器上。这些氨基通过用2 ml的0.1 M盐酸处理过夜进行水解，以在表面上获得磺酸基。
2. 抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)在SO3H-功能化表面上的固定化：
用水洗涤如1所述处理的微过滤器，随后加入75 µg抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的2 ml 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液(0.1 M，pH 7.4)溶液，并在室温下搅拌2小时之后实现了抗-hCRP抗体(克隆6404，Medix)的固定化。通过对固定化溶液加入10 µl的10%牛血清白蛋白(BSA)水溶液并搅拌另外的60分钟封闭了剩余的活化羧基。各自用3 ml水洗涤4次并随后在空气流中干燥后，获得了CRP-精炼的(affine)表面。成功固定了5.8 µg每微过滤器，其中15%的固定化抗体是活性的。

Claims (9)

1.一种对表面功能化的方法，所述表面包括或包含合成聚合物和天然聚合物，例如多糖和蛋白质、纸、玻璃、陶瓷、硅、金属和金属氧化物，且为了进行表面功能化而接触含有至少一种用于与该表面材料形成复合材料的化合物的溶液，其特征在于，作为所述至少一种用于形成复合材料的化合物，采用了具有至少一个通过极性氨基甲酸酯连接和空间间隔(X)连接的游离功能基团R1的溶解的寡糖或多糖衍生物，按照通式I所示：
其中R1 = NH2、SH或OH；
R2或(独立的) R3 = H或；且
。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于羟基被作为至少一个功能基团R1提供。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于巯基被作为至少一个功能基团R1提供。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于氨基被作为至少一个功能基团R1提供。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于单多糖或杂多糖被用作所述寡糖或多糖。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于葡聚糖特别是β-1-4-葡聚糖、纤维素或几丁质被用作所述寡糖或多糖。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于提供了具有通式II的功能基团的至少双功能胺取代的寡糖或多糖：
其中X表示任何有机部分，特别是芳族、稠合芳族、杂环和/或杂原子部分、也可选被取代的烷基和/或烯基部分、或如(I)中公开的X部分。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于寡糖或多糖具有通式III的纤维素骨架
,
其中纤维素的羟基至少部分被OC(O)NH(X)NH2取代，其中X表示任何有机部分，特别是芳族、稠合芳族、杂环和/或杂原子部分、也可选被取代的烷基和/或烯基部分、或包括如(I)中公开的X部分。
9.根据权利要求6的方法，其特征在于具有30-1500的基于其分子量的平均聚合度(DP)，优选在50-300的范围的纤维素被用作所述寡糖或多糖。
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