CN105014834B - 微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用，所述微沟槽成型模具包括凹模，所述凹模底部具有用于微沟槽成型、且成列或成行分布的微观凸起；所述微观凸起呈峰值为4‑6μm、周期为5‑7μm的规律分布；所述凹模深度为0.4‑0.6mm。本发明通过用微沟槽成型模具将硅橡胶表面改性成为具有微沟槽图形结构，增加了硅橡胶的水接触角，降低了其亲水性，进而影响到细胞在硅橡胶表面的生长行为，进一步影响细胞在材料表面的生长方向及空间排布，最终减少包膜挛缩的发生率，为制备更适应于临床应用的植入材料提供新的解决途径。

Description

微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的 应用

技术领域

本发明属于医学材料领域，具体涉及一种微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用。

背景技术

使用生物材料软组织代用品进行植入手术修复是软组织缺损及畸形治疗的重要手段。目前临床治疗中常用的有硅橡胶(silicone rubber，SR)、膨体聚四氟乙烯(ePTFE)、高密度聚乙烯(Medpor)等。其中硅橡胶在临床上最为常用，具有化学性质稳定，易塑形，易清洁、消毒，良好的经济性价比等优点。但因硅橡胶表面呈强烈的疏水性，导致组织细胞的相容性较差，易形成包膜，导致假体挛缩移位，还容易引起感染、破溃。只有对硅橡胶进行表面改性、修饰，使其表面达到仿生化效果，调控细胞有序排列等，才能在临床应用中获得更好的效果。

在本发明前期研究中，采用羟基磷灰石进行表面仿生涂层、β-磷酸三钙和硅橡胶进行共混交联复合，以及碳离子注入表面改性等方法对硅橡胶进行改性处理，发现成纤维细胞在硅橡胶表面的黏附和增殖能力变强。同时也发现，几种改性材料的表面形貌均较硅橡胶发生了变化，提示我们硅橡胶的表面形貌影响材料的细胞相容性。因此，有必要对硅橡胶的表面形貌进行改进，使其更具有临床应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用，通过该成型模具制备的硅橡胶具有更好的生物相容性，临床应用前景更好。

本发明所述技术方案如下：

1、微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用，所述微沟槽成型模具包括凹模，所述凹模底部具有用于微沟槽成型、且成列或成行分布的微观凸起。

优选的，所述微观凸起呈峰值为4-6μm、周期为5-7μm的规律分布。

优选的，所述凹模深度为0.4-0.6mm。

优选的，所述硅橡胶为改性硅橡胶。

优选的，首先在温度20℃，湿度50％的条件下，将硅橡胶原料制成液态硅橡胶，然后将液态硅橡胶注入微沟槽成型模具中，推平聚合，室温硫化3-4h，固化成膜，获得表面具有微沟槽的硅橡胶。

优选的，所述微沟槽的槽宽为6μm，深度为5μm。

本发明的有益效果在于：本发明通过用微沟槽成型模具将硅橡胶表面改性成为具有微沟槽图形结构，增加了硅橡胶的水接触角，降低了其亲水性，进而影响到细胞在硅橡胶表面的生长行为，进一步影响细胞在材料表面的生长方向及空间排布，最终减少包膜挛缩的发生率，为制备更适应于临床应用的植入材料提供新的解决途径。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图，其中，普通硅橡胶用SR表示，具有微沟槽图形的硅橡胶用P-SR表示：

图1微沟槽成型模具结构图；

图2制成的普通硅橡胶及具有微沟槽图形的硅橡胶；A图为普通硅橡胶(SR)，B图为具有微沟槽图形的硅橡胶(P-SR)；

图3SR和P-SR的原子力显微镜图像；A和B图依次为SR和P-SR的二维表面微观结构，C和D图依次为SR和P-SR的三维表面微观结构；

图4SR和P-SR水接触角测量结果；

图5免疫荧光法测试SR和P-SR上成纤维细胞的细胞骨架结构结果；放大倍数为800倍；

图6扫描电子显微镜观察人真皮成纤维细胞在SR和P-SR上的排列结果；

图7组织HE染色结果，A图为硅橡胶植入7天后染色结果，B图为硅橡胶植入15天后染色结果，C图为硅橡胶植入30天后染色结果。

图8组织Masson染色结果，A图为硅橡胶植入7天后染色结果，B图为硅橡胶植入15天后染色结果，C图为硅橡胶植入30天后染色结果。

图9组织α-SMA免疫组化结果，A图为硅橡胶植入7天后染色结果，B图为硅橡胶植入15天后染色结果，C图为硅橡胶植入30天后染色结果。

图10组织Vimentin免疫组化结果，A图为硅橡胶植入7天后染色结果，B图为硅橡胶植入15天后染色结果，C图为硅橡胶植入30天后染色结果。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 普通硅橡胶以及表面具有微沟槽图形的硅橡胶的制备

微沟槽成型模具结构图如图1所示，包括凹模1，在凹模1底部设置有用于微沟槽成型的微观凸起2，该微观凸起2可成列或成行分布，当然也可以是任意方向，即与凹模1的长度及宽度方向均不平行，本实施例中，优选与凹模1的宽度方向平行，即成列分布，这样方便加工；为达到更的成型效果，经过实验，该微观凸起应呈一定周期T及H峰值的规律分布效果会更好，其中优选峰值H为4-6μm、周期T为5-7μm的效果最好，本实施例中，凹模深度h为0.4-0.6mm，最优为0.5mm，可以得到更佳的效果。

普通硅橡胶及具有微沟槽图形的硅橡胶的制备步骤如下：

在温度20℃，湿度50％的条件下，将双组分医用液态硅橡胶(成都晨光化工研究院，型号HY-Q630)的两种组分(A组分为胶料，B组分为固化剂)各3mL按体积比1:1比例混合均匀，浇灌注入金属模具平板和图1所示的微沟槽成型模具中，推平聚合；25℃下静止硫化3-4h，固化成膜，获得普通硅橡胶(SR)及表面具有微沟槽图形的硅橡胶(P-SR)，如图2所示，SR表面光滑、无色、透明；P-SR可见许多整齐的小方格，在光照下可见色彩衍射反光。

将SR和P-SR裁剪成1cm×1cm大小，浸泡在装有75％酒精的烧杯中，整体放入超声清洁仪，清洗参数：功率20w，时间2min。清洗完毕后放入37℃烤箱里1min，待干燥后，置于真空泵中，负压下行喷金镀膜，冷却后，用原子力显微镜观察材料表面纳微米结构，结果见图3，由图3可知，SR表面比较平滑，P-SR表面呈微沟槽形状，槽宽6μm，深度5μm。

实施例2 SR和P-SR理化性能检测

将材料剪成1cm×1cm大小的方块，浸泡在装有75％酒精的烧杯中，置于超声清洁仪中，设置参数：功率20w，时间5min。清洁完毕后置于37℃恒温孵箱中烤干，完全干燥冷却后进行水接触角测量。测量环境室温为28℃，湿度为65％，为尽快准确测量数据，所用时间一般在30S以内。将受试材料平放于水接触角测量仪载物台上，以去离子水为介质，SR表面随机选取3个不同部位，选取P-SR上3个不同微沟槽区域，测定3个数据点，最后计算两组样本平均值，结果如图4所示，SR的水接触角小于P-SR，提示对材料进行微图形处理后，水接触角数值增大，增加了表面疏水性。材料表面疏水性的改变，能够促使蛋白质发生构象的转变，使蛋白质、材料、细胞调整成最契合的键合状态，进而影响细胞生物学行为。

实施例3 SR和P-SR细胞相容性测试

采用人真皮成纤维细胞进行测试，培养液采用含10％胎牛血清DMEM培养液，首先用免疫荧光法测试SR和P-SR上成纤维细胞的细胞骨架结构情况，具体步骤如下：

(1)将人真皮成纤维细胞接种在铺有SR、P-SR材料的24孔板中，接种4×10⁴个细胞/孔，置于5％CO₂、37℃恒温孵育48h；

(2)废弃原液，PBS清洗2-3次；固定细胞：3.7％甲醛、15min；打孔：0.1％Triton X-100/PBS、15min；封闭：5％山羊血清、室温15min；孵育细胞骨架：Actin-Tracker Green、避光室温1h；在避光条件下，PBS清洗1次；Hoechst33342孵育细胞核5min；

(3)50％甘油封片，激光共聚焦显微镜800倍下查看材料表面细胞的骨架结构布局。

结果如图5所示，在SR上的细胞排列无序，而P-SR组细胞生长成梭形，且排列有序。

进一步将上述步骤(1)的细胞废弃旧培养液，PBS清洗2次；2.5％戊二醛4℃、浸泡1h固定细胞；选用乙醇以及叔丁醇梯度浓度分别是30％、50％、70％、90％、100％，前四项各脱水1次、每次5min，最后一项脱水2次，每次5min；放入载物台，抽真空，镀金，扫描电子显微镜观察人真皮成纤维细胞在各材料上的排列情况。结果如图6所示，SR上生长的人真皮成纤维细胞排列随机，且形态未见明显变化，而P-SR上生长的细胞形态得到拉长，且沿着一个方向平行生长。

实施例4 SR和P-SR组织相容性测试

首先观察硅橡胶植入术后局部炎症反应情况，将SR、P-SR材料置于75％酒精中消毒2h；电子称上称重，以1ml/100g的3％戊巴比妥钠的计算方式，腹腔注射麻醉成年雌性SD大鼠；待大鼠麻醉显效后，将其固定在木质手术台上，用剃毛刀剃除大鼠背部近脊柱周边的5cm×5cm区域的毛发，肥皂水清洗周围皮肤；甲基蓝在脊柱两侧做切口标记，相邻两切口至少间距2cm，碘伏消毒术区及周围2cm，常规铺洞巾；15号刀片切开皮肤0.5cm，达皮下；眼科剪锐钝结合分离皮下组织，分离出约1.5×1.5cm皮下腔隙；将消毒好的硅橡胶放置腔隙中，并展平无卷曲；“4-0”号丝线间断缝合皮肤，无菌纱布包扎；待老鼠苏醒后放回动物房饲养；严格依据埋置时间7天、15天、30天，适时取出材料，液氮罐冷冻保存后取出，放置在组织支撑器上，滴包埋剂，放置在冷冻台上；冰冻切片机持承器承托冷冻组织块，启动粗进退键，转动旋钮，修平前面组织，直至组织块中间部分；调节上下左右键，保持组织和切割方向一致；调整好切片厚度参数：6μm，-20℃；调整好防卷板，小毛笔撵平切割的组织片，展平并贴附于载玻片上，并做好标记；将切片放置到37℃烤箱中固定15min；烘烤固定后放置到4％多聚甲醛中固定20min；流水冲洗切片1min，双蒸水清洗1min；将切片处理后进行HE染色，染色步骤如下：蒸馏水清洗组织玻片2min；苏木素染色液染色10min；玻片彻底浸没水中，流水冲洗多余的染色液10min；蒸馏水清洗1次；95％乙醇5s；伊红染色液染色1min；脱水使用95％乙醇2min×2次；透明应用二甲苯5min×2次；封片采用中性树胶；显微镜下观察，结果见图7。由图7可见，植入7天后，普通平滑的硅橡胶SR周围较P-SR的炎症细胞较多，说明具有微图形结构的硅橡胶对机体的急性炎症反应具有一定影响；1-2周机体处于一个亚急性反应期，切口周围的炎症细胞开始逐渐消退，15天HE染色图片可见，改性后的硅橡胶对机体炎性刺激减小，组织与材料契合度逐渐增加；1月后，这种改变日趋明显，说明表面微沟槽图形化硅橡胶相比普通硅橡胶对机体的炎性刺激较小。

进一步通过Masson染色观察材料周围的包膜情况，操作步骤如下：切片脱蜡处理至水；100μl Masson染色液滴在组织标本，染色5min，流水冲掉染液3min；100μl磷钼酸染色5min，甩干水分；100μl苯胺蓝染色5min，蒸馏水冲洗；100μl分化液分化60sec，共2次；脱水分别用95％酒精、无水酒精；透明；中性树胶封片；显微镜照相，结果见图8。由图8可知，植入大鼠皮下7天，机体处于一个急性应激过程，炎症细胞浸润明显，胶原纤维表达较少，且排列疏松，各组材料周围胶原表达情况差别不明显；植入15天后，Masson染色观察到材料周围的胶原增多，但P-SR周围的胶原表达少于SR，说明微沟槽图形化的硅橡胶相比普通硅橡胶，包膜厚度较薄，结构较为疏松，与组织具有较好的契合度。

进一步采用免疫组化试验进行验证：冷丙酮在4℃固定10-20min；PPS洗5min,共2次；在避光环境下，3％H₂O₂灭活20min；PBS清洗2次，5min/次；0.01M枸橼酸液完全浸没组织切片，擦干组织周边的水分，玻片中间的组织呈湿润状态，滴加5％BSA封闭液，置于37℃恒温烤箱，烘烤30min，甩干水分；用滤纸吸去血清，滴加小鼠抗人Vimentin抗体以及小鼠抗人α-SMA抗体，37℃，2h，将玻片放置玻片架，置于水平摇床，PBS清洗2次，5min/次；滴加多聚体抗小鼠IgG-HRP，置于37℃恒温烤箱,继续烘烤30min；玻片置于水平摇床，PBS清洗2次，5min/次；DAB显色，流水冲洗；苏木素复染，室温，30s；脱水用80％酒精、95％酒精、100％酒精，各2次，5min/次；透明用二甲苯5min×2次；中性树胶封片；显微镜照相，结果见图9和图10。α-SMA即为α-平滑肌肌动蛋白，正常情况下可在血管平滑肌以及肌肉中表达，当肌成纤维细胞增殖能力出现失控后，其表达量有所增加，可反映出成纤维细胞激活转化成肌成纤维细胞的活性得到激活。Vimentin即波形蛋白，是细胞骨架组成成分之一中间纤维家族的中心成员。在间叶组织中，一个完整的细胞支架网络是有微管、微丝，以及中间纤维构成，而后者主要由波形蛋白组成。α-SMA以及Vimentin的阳性表达量可直接或间接反应出组织胶原沉积程度，评估材料的组织相容性。纤维化作为组织修复的一种后期反应，当材料植入大鼠机体后，急性期(7天)，各组材料上的α-SMA以及Vimentin的表达量较低，且差别不明显。而在亚急性(15天)以及慢性(30天)中，各组材料上的α-SMA以及Vimentin阳性表达率逐渐增加。但同一时段比较，表面具有微图形结构的硅橡胶表达量低于普通硅橡胶，显然经过表面微沟槽图形化的硅橡胶具有降低胶原沉积的优势。

需要说明的是，所述硅橡胶还可以是经过其它诸如碳离子注入技术等改性过的硅橡胶。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用，其特征在于，所述微沟槽成型模具包括凹模，所述凹模底部具有用于微沟槽成型、且成列或成行分布的微观凸起；所述凹模深度为0.4-0.6mm；所述微观凸起呈峰值为4-6μm、周期为5-7μm的规律分布。

2.如权利要求1所述的微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用，其特征在于，所述硅橡胶为改性硅橡胶。

3.如权利要求1所述的微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用，其特征在于，首先在温度20℃，湿度50%的条件下，将硅橡胶原料制成液态硅橡胶，然后将液态硅橡胶注入微沟槽成型模具中，推平聚合，室温硫化3-4h，固化成膜，获得表面具有微沟槽的硅橡胶。

4.如权利要求3所述的微沟槽成型模具在制备表面具有微沟槽图形的硅橡胶中的应用，其特征在于，所述微沟槽的槽宽为6μm，深度为5μm。