CN105009174A - 用于评估组织纤维化的方法及系统 - Google Patents

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Abstract

提出了一种用于评估组织纤维化的方法。所述方法使用组织的图像作为试验图像，并且所述方法包括：从试验图像中识别血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域，所述血管周胶原蛋白区域包括代表组织的血管周胶原蛋白的像素，所述桥样联结胶原蛋白区域包括代表所述组织的桥样联结胶原蛋白的像素，所述小叶纤维化胶原蛋白区域包括代表所述组织的小叶纤维化胶原蛋白的像素；根据试验图像中识别区域的特性为每一识别区域获取一个或多个特征的量化值，然后使用为所有识别区域获取的量化值评估纤维化。

Description

用于评估组织纤维化的方法及系统
技术领域
本发明涉及一种用于评估组织状况尤其是组织纤维化的方法及系统。
背景技术
出于诊断的目的、或者为了评价对患者进行某一治疗的效果，通常有必要评估患者的组织状况。例如，有必要评估患有慢性肝病的患者的肝纤维化。这是因为，以新合成的胞外基质在肝中过度积聚为特征的肝纤维化是大多数慢性肝病的标志。这种慢性肝病包括慢性乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和自身免疫性肝病[1，2]。
为了评估患者的组织纤维化，首先可以进行活检(提取小组织样本即来自患者组织的活检组织样本)，然后评估组织样本的纤维化。然而，因为活检为入侵性技术，这会导致患者身体不适，并且给患者带来一定程度的风险。
迄今为止，已经研究了非入侵性纤维化评估技术(例如技术[3]-[7])。然而，活检仍旧是纤维化评估的黄金标准。这是因为，通过对活检得到的组织样本进行分析可以提供诸如炎症活性和胶原结构等信息，然而这样的信息仍旧不能通过当前的非入侵性纤维化评估技术获得。当前非入侵性纤维化评估技术的一个例子为FibroScan(肝纤维化扫描)，FibroScan根据剪切波通过患者肝脏的速度来测量患者的肝脏硬度值，然后使用这一测量的肝脏硬度值作为患者肝脏的纤维化程度的指示。
一种评估组织纤维化的客观方式是将纤维化视为通过多个分期而进展的情况，并评估组织纤维化所处的分期。当前，这种纤维化评估的形态学技术通常是半定量的、并且主要依赖于使用者对活检组织样本结构特征的观察。这种技术的例子包括用于评估肝纤维化的迈特比尔(Metavir)和艾沙克(Ishak)法[23-24]。由于内在或外在观察差异，使用者对活检组织样本的结构特征的观察通常具有极高的主观性[8-9]，因而很难使用半定量技术追踪患者组织中微细增量的纤维化改变。因此，这些技术对纤维化的分期相当粗略。
然而，即使在患有处于同一分期的相同疾病的患者之间，在这些患者的临床状况和功能状况中也具有不同的变化。因此，检测微细增量的纤维化变化的能力是重要的，且将用于许多应用中。例如，尤其是随着用于治疗各种疾病(例如，肝纤维化的阻滞/逆转)的多种高价药的研究，这样的能力在评价疗效以及评价治疗策略上是很有用的。所述检测微细增量的纤维化变化的能力还将有助于大样本的肝纤维化研究。尽管当前大样本的肝纤维化研究主要集中于慢性乙型肝炎和丙型肝炎，但景观流行病学正在发生改变。随着全球内与肥胖有关问题的迅速增长，越来越多的人经受着导致细胞外周/窦周隙纤维化的被称作NASH的与肝疾病有关的代谢综合征。使用大样本肝纤维化研究对于评价这一肝疾病也将是有益处的。此外，在近年来已深度地逐步形成肝硬化发病机理的概念。尤其是，国际肝病理研究组已经提议用术语“发展期的慢性肝疾病”替代“肝硬化”，因为已经意识到虽然肝硬化通常被视作肝纤维化的一个单独分期(具体地，晚期分期)，但其实它应该被视作经过了不止一个分期的发展状况。尤其是，已经观察到，随着肝硬化的进展，肝脏中纤维化的数量呈指数增加。此外，已经发现，肝硬化随着纤维化的逆转而衰退是可能的。因此，整合了不同分期的临床学、组织学和血液动力学发现的肝硬化病理生理学分期优于当前的肝硬化单期观点。
与半定量方法相比，全定量方法对主观性极高的使用者观察具有较少的依赖，因而具有随时间监控微小增量的纤维化改变的潜能[21]。当前，已经开发出了对肝组织学信息进行定量的全定量方法，其中，所述肝组织学信息用于诊断和治疗与纤维化有关的慢性肝疾病(CLD)。这些方法包括基于图像的形态分析法，其中许多都需要染色的活检组织样本。当前基于图像的形态分析法的一个例子是胶原蛋白百分比例区域(CPA，collagen percentage area)法，该方法使用单次测量结果即胶原蛋白百分比例区域(CPA)(即活检组织样本中胶原蛋白的百分比)去评估纤维化。这一测量结果通过使用组织样本图像获取，并且该测量结果是定量测量，反映了从中获取组织样本的组织中胞外基质(ECM)的沉积程度[10-13]。
尽管使用CPA测量结果可以在研究和临床应用中监控纤维化进展[10-13]，但这样的测量结果具有其自身限制。最常见的已报道的限制之一是所述CPA测量结果对活检组织样本的尺寸极其敏感。例如，帕拉迪斯(Paradis)等人[19]发现，从25mm长的肝活检组织样本中获取的CPA测量结果的变异系数为45％，而从15mm长的肝活检组织样本中获取的CPA测量结果的变异系数为55％。
此外，根据组织中全局结构改变进行组织的组织-病理学评估要比组织中纤维化含量的单次测量结果(例如CPA测量结果)更加精确[20]。实际上，许多最新发现已经表明单独使用CPA测量结果去确定肝活检组织样本中纤维化的病理学评分不能精确地评估样本中的纤维化[20-22]。像血管分流和干细胞再生之类的特征也对评价进展期的慢性肝疾病至关重要[22]，但关于这些特征的信息并未包括在CPA测量结果中。随着3D成像技术的到来，关于这些特征的信息能够有可能从活检组织样本的3D视图中获取，并且更好地利用这类信息的技术是迫切想要的。
考虑到上述内容，拥有一种能够检测组织中结构改变并检测组织中微小增量的纤维化改变的稳定的全定量技术是极其有益的。
发明内容
本发明的目标在于提供一种用于评估组织纤维化的新的且有用的方法。
一般地，本发明提议通过识别组织中不同类型的胶原蛋白区域并使用来自每一个这些类型的胶原蛋白区域的一个或多个特征来评估组织纤维化。本发明所识别并使用的胶原蛋白区域在病理上是相关的，即它们随着组织进展中纤维化的改变模式反映与纤维化相关的组织-病理学知识。
具体地，本发明一方面为使用试验图像评估组织纤维化的方法，所述试验图像为组织的图像，其中，所述试验图像包括多个具有各自的强度值的像素，其中，所述方法包括：
从所述试验图像中识别血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化(fibrillar)胶原蛋白区域，所述血管周胶原蛋白区域包括代表组织的血管周胶原蛋白的像素，所述桥样联结胶原蛋白区域包括代表组织的桥样联结胶原蛋白的像素，小叶纤维化胶原蛋白区域包括代表组织的小叶纤维化胶原蛋白的像素；
根据试验图像中识别区域的特性为每个识别区域获取一个或多个特征的量化值；
使用为所有的识别区域所获取的量化值来评估纤维化。
本发明上述提及的这方面可以用于治疗具有纤维化的患者的方法中。更具体地，所述治疗患者的方法可以包括根据患者的组织的纤维化评估给予抗纤维化疗法，其中，使用本发明上述提及的这方面获取该评估。
本发明上述提及的这方面还可以用于治疗具有肝硬化的患者的方法中。更具体地，这一治疗患者的方法可以包括：如果用本发明上述提及的这方面获取的患者组织的纤维化评估表明该患者具有失代偿肝硬化(decompensated cirrhosis)，则对患者执行肝移植。
可替代的，本发明可以表示为用于执行这一方法的计算机系统。这一计算机系统可以与装置整合在一起，所述装置例如为用于获取图像的图像获取装置，如二次谐波产生(SHG，a second harmonicgeneration)/双光子激发荧光(TPEF，two-photon excitation fluorescence)基成像系统、亚像素角度扫描显微镜(SPSM，Subpixel PerspectiveSweeping Microscope)或其他数码扫描仪。本发明还可以表示为计算机程序产品，所述计算机程序产品例如录入在有形计算机媒介上、包含通过计算机系统可执行方法步骤的可操作程序指令。所述计算机程序产品可以安装在云计算系统的云上且可以被配置为在远程服务器上运行。
附图说明
现将参照后面的附图只以举例的方式示出本发明实施例，其中：
图1示出了根据本发明实施例的评估试验组织状况的方法的流程图，其中，所述方法使用试验图像和训练模型；
图2示出了用于训练图1中所述方法使用的模型的流程图；
图3示出了图1所述方法的示例性实施的框图，其中，所述示例性实施为用于评估肝纤维化；
图4(a)-(l)示出了当使用特定获取的图像作为试验图像时，在图3的示例性实施中获取的结果，其中，从用于将代表试验图像中胶原蛋白的像素分割为不同类型的胶原蛋白区域的步骤中获取这些结果；
图5示出了Metavir评分系统；
图6示出了在图3的示例性实施中用于将代表试验图像的胶原蛋白的像素分割为不同类型的胶原蛋白区域的步骤的流程图；
图7示出了图6的步骤是如何执行的流程图；
图8示出了为图3的示例性实施中的两个组织样本所提取的不同类型的胶原蛋白区域；
图9示出了图3的示例性实施中用于获取不同类型胶原蛋白区域中各特征的量化值的步骤的流程图；
图10示出了显示图9的一些步骤是如何执行的子步骤的流程图；
图11示出了显示图10的子步骤是如何执行的流程图；
图12(a)示出了图3的示例性实施中相关血管周胶原蛋白特征的选择，而图12(b)-(d)示出了与图12(a)的相关血管周胶原蛋白特征的量化值的主成分有关的结果；
图13(a)示出了图3的示例性实施中相关桥样联结胶原蛋白特征的选择，而图13(b)-(d)示出了与图13(a)的相关桥样联结胶原蛋白特征的量化值的主成分有关的结果；
图14(a)示出了图3的示例性实施中相关小叶纤维化胶原蛋白特征的选择，而图14(b)-(d)示出了与图14(a)的相关小叶纤维化胶原蛋白特征的量化值的主成分有关的结果；
图15示出了图3的示例性实施中用于获取qFibrosis(q纤维化)指标的步骤的流程图；
图16(a)-(c)分别示出了与在图3的示例性实施中获取血管周指标、桥样联结指标以及小叶纤维化指标有关的结果；
图17示出了根据本发明实施例用于实施图1和图2的方法的系统；
图18示出了将图3的示例性实施中使用的一些特征与CPA测量结果进行对比；和
图19(a)-(b)示出了CPA测量结果以及图3的示例性实施例中获取的qFibrosis指标在整个不同纤维化分期的分布，且图19(c)-(f)示出了CPA测量结果以及图3的示例性实施中获取的qFibrosis指标的受试者工作特征曲线(ROC)。
具体实施方式
方法100
参见图1，示出了方法100的步骤，所述方法为本发明一实施例并评估了人或动物的组织(试验组织)的状况。例如，方法100可以用于确定试验组织所处的纤维化相关疾病的分期。方法100还可以用于其他应用中，例如用于确定所述试验组织是否有癌细胞。
方法100的输入为试验图像，该试验图像为试验组织的图像。该试验图像可以为从试验组织中提取的试验活检组织样本的图像。此外，该试验图像可以为任意类型的图像形态。例如，该试验图像可以使用一种或多种非线性光学显微技术获取，这些技术例如双光子激发荧光、二次谐波产生和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微技术。使用这些非线性光学显微技术，试验组织或试验活检组织样本可以直接成像(即，不必要对活检组织样本进行染色)。试验图像也可以是2维图像(2D)或者是3维(3D)图像，而在后一情况中，3D试验图像可以包括多个2D图像的堆叠，并且可以在堆叠中的每一个2D图像上独立执行方法100，将堆叠中的两个或多个2D图像的结果结合以形成整体结果。
如图1所示，方法100包括步骤102-110。在步骤102中，在试验图像中识别生物目标。在步骤104中，使用所识别的生物目标提取病理相关片段。在步骤106中，计算病理相关片段中特征的量化值。在步骤108中，将这些量化值转化为不相关成分。然后在步骤110中，使用所转化的量化值和训练模型生成反映了试验组织状况的统计数据。
现将更详细地描述步骤102-110。
步骤102：在试验图像中识别生物目标
在步骤102中，在试验图像中识别生物目标。这些生物目标是具有生物学意义的目标。换言之，这些生物学目标期望在试验组织中存在，并且它们的识别可以有助于在步骤104中提取病理相关片段。在步骤102中识别的生物目标可以包括细胞、细胞核、胶原蛋白区域、血管(或者内腔)等。
步骤104：使用在试验图像中识别的生物目标提取病理相关片段
在步骤104中，使用在试验图像中识别的生物目标提取病理相关片段。病理相关片段指的是其改变模式反映了与方法100旨在评估的状况有关的组织-病理学知识的片段。
组织-病理学知识通常使用在半定量评分系统中由病理医师在疾病的常规诊断中使用的描述性语言以定性方式表达。因此，在执行方法100之前，可以应用涉及一个或多个病理医师的交互过程以确定可被提取的病理相关片段。特别地，该交互过程可以涉及首先从一个或多个组织(该组织与试验组织为同一类型)的图像识别某些生物目标，所述组织具有不同程度的、方法100旨在评估的状况；从这些一个或多个图像中提取不同的片段，然后让病理医师核实，其中根据他或她的关于方法100旨在评估的状况的组织-病理学知识，这些片段(如果有的话)是病理学相关的。
步骤106：计算病理相关片段中特征的量化值
在步骤106中，计算病理相关片段中特征的量化值。在一定程度上，这一步骤可以视作将试验图像转换为多个量化值。这些特征也是病理学相关的，即它们的改变模式反映了与方法100旨在评估的状况有关的组织-病理学知识，并且这些特征可以包括形态特征、结构特征、共定位特征、基于强度的特征以及与空间相关的特征。通过图像处理方法可以获取这些特征的量化值。
步骤108：将这些特征的量化值转化为不相关成分
在步骤108中，将这些特征的量化值转化为不相关成分。所述不相关成分可以是这些量化值的线性组合的形式，并且可以反映出这些量化值的差异。
可以使用诸如主成分分析技术(PCA)、偏最小二乘法(PLS)等转换技术进行步骤108。在某些情况下，可以只选择由转换技术所生成的成分中的一些(而不是全部)作为步骤108的输出。一般，需要选择非常少的成分以实现良好结果。
步骤110：使用训练模型和所转化的量化值生成反映了试验组织状况的 统计数据
在步骤110，使用步骤108的输出和训练模型生成反映了试验组织状况的统计数据。
统计数据可以包括：一个或多个指标、试验组织具有特定疾病的概率和/或试验组织处于特定疾病的某一分期的概率。例如，可以获得概率值，所述概率值中的每个均表明试验组织处于疾病的特定分期的概率；并且使用方程(1)可以从这些概率值中计算出指标。
指标＝α∑pi*Ei i＝0,1,2,3,4  (1)
在方程(1)中，pi为表明组织处于疾病的i分期的概率的概率值，Ei为分期i的期望值，且可以设定为i；并且α为比例因子。方程(1)的总和∑pi*Ei将概率值转化为连续测量值，且比例因子α用于归一化这一连续的测量值以便使指标处于想要的范围内。如果方法100旨在确定试验组织的组织类型，那么也可以使用方程(1)计算指标，并且在这一情况下，Ei可以设定为在模型的训练期间所用的组织类型的标记。
步骤110中生成的统计数据可以在多种应用中使用。例如，这些统计数据可以用于诊断具有试验组织的患者，用于评价对患者进行的某种治疗的功效和/或用于验证其他诊断工具。
用于训练模型的方法200
图2示出了用于训练方法100所用模型的方法200。所述模型可以为统计模型或数据库，而且可以使用逻辑回归、支持向量机、决策树或人工神经网络。使用多个通过对多个训练组织进行成像(直接对训练组织进行成像或通过对从训练组织提取的活检组织样本进行成像)获得的多个训练图像训练该模型。这些训练图像中的每一个必须与关于各自训练组织的已知信息(或者真实数据)有关。例如，如果方法100旨在确定来自这些试验组织的某些评分系统(例如Metavir系统)的病理学得分，那么每个训练组织的病理学得分必须是已知的，并且必须与各自的训练图像有关。相似地，如果方法100旨在确定表明试验组织的组织类型的标记，例如表明组织为癌症的标记‘1’或者表明组织不是癌症的标记‘0’，则每个训练组织的标记必须是已知的，并且必须与各自的训练图像有关。
方法200包括步骤202-210。在步骤202中，在每个训练图像中识别生物目标，在步骤204中，使用在每个训练图像中识别的生物目标提取病理相关片段；在步骤206中，计算每个训练图像的病理相关片段中特征的量化值；在步骤208中，将每个训练图像的所计算的特征的量化值转化为不相关成分。方法200的步骤202-208与方法100的步骤102-108相似，除了该方法200是对每个训练图像进行的，而不是对试验图像进行的。在步骤210中，使用为训练图像获取的所转化的量化值训练该模型。
方法100的步骤108和方法200和步骤208是可选的(尽管如此，但还是优选包括这些步骤，因为不相关成分更适宜用于模型的数据学习或训练，且包括这些步骤可以有助于减少量化值的分散，这反过来可以有助于减少计算工作量)。如果省略步骤108和208，步骤110和210可以分别直接在来自步骤106和206的量化值上执行。然而，注意的是，如果训练模型时执行方法200的步骤208，则方法100的步骤108必须执行。
此外，在方法200的步骤206中，可以执行额外步骤以选择与方法100旨在评估的状况相关的特征。特别地，额外步骤可以包括首先确定初始特征集、对每个训练图像的病理相关片段计算这一初始特征集的量化值，然后根据这一计算结果从初始特征集中选择相关特征。可以根据预定义的标准集使用特征选择方法进行这一选择步骤。在这种情况下，在步骤208中只使用相关特征的量化值以训练模型。相应地，在步骤106中只获取、并在步骤108中只使用相关特征的量化值。
用于评估肝纤维化的方法100的示例性实施
图3示出了用于评估肝纤维化的方法100的示例性实施的框图。如图3所示，在这一例子中，在试验图像中识别生物目标以提取三种类型胶原蛋白区域(血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域)形式的病理相关片段。然后将这些胶原蛋白区域中的特征的量化值与训练模型一起使用以产生诸如qFibrosis指标的统计数据。在这一例子中，方法100中所用的模型是使用方法200训练的。
下文将更加详细地阐述方法100的示例性实施。
制备试验活检组织样本和训练活检组织样本
在这一示例性实施中，获取并使用硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)诱导的大鼠肝组织样本。TAA诱导的动物模型是为了研究大鼠肝纤维化广泛使用的模型。这是因为TAA诱导的肝纤维化具有与由病毒性肝炎导致的肝纤维化相似的特性[31-32]。此外，患有肝纤维化的人与TAA诱导的动物表现出相似的组织-病理学改变。因此，TAA诱导的动物模型是研究慢性乙型肝炎的肝纤维化进展的有效模型[33-35]。
生物资源中心(BRC)实验动物护理和使用委员会(IACUC)已经对所有的研究TAA诱导的大鼠模型的协议进行了审查并给与批准。特别地，在新加坡生物医药园科技研究局(Biopolis A*STAR)生物资源中心中，每个笼子里容纳两只平均体重为220g的雄性威斯塔(Wistar)大鼠，这些大鼠在12：12小时的亮/暗时间安排中自由饮用试验饮食和水。以腹膜内注射为大鼠给药TAA(200mg/kg体重)磷酸盐缓冲液，一周三次。将25只大鼠随机分成5组。其中未用TAA处理的一组大鼠设置为对照组，而其他四组与给药TAA的时间点(具体地，这4组中的大鼠分别用TAA处理4、8、10和12周)有关。
随后获取来自每只大鼠的左外叶的肝组织样本。将这些肝组织样本中的每一个均用石蜡保存，并将其切片成厚度50μm用于成像(例如方法100的示例性实施)以及5μm用于染色(用于训练病理医师的评分)。训练医师使用将切片中的肝纤维化分期为F0-F4级别的Metavir评分系统评估每个染色切片的组织学状况。训练病理医师的这一分期结果被用作与大鼠肝组织样本有关的真实数据。
在这一例子中，方法100被实施多次，且每次均使用一个大鼠肝组织样本作为试验活检组织样本。使用剩余的大鼠肝组织样本作为训练活检组织样本来训练方法100的每次实施中所使用的训练模型。
采集试验图像和训练图像
在这一例子中，使用与文献[14-15]中相同的成像系统以20x物镜在大鼠肝组织样本未经染色的切片上执行SHG/TPEF成像。为了覆盖每个样本中的大部分区域，对于每个样本，均采集了三个9×9多重图像，这些图像中的每一个均具有16mm2(4×4mm)的微细图像尺寸。
每个采集的图像均为2D图像，包括SHG通道中的数据和TPEF通道中的数据。只具有采集图像的SHG通道中的数据的图像可以被称作采集图像的“SHG图像”，而只具有采集图像的TPEF通道中的数据的图像可以被称作采集图像的“TPEF图像”。采集图像的SHG图像和TPEF图像中每一个都包括多个具有各自的强度值、颜色值和结构值的像素。
步骤102或步骤202
在这一例子中，在试验图像中或在每个训练图像中识别的生物目标为图像中肝组织样本的胶原蛋白区域和内腔。根据如下所述进行这一过程：
从图像的SHG图像中识别胶原蛋白区域。根据高斯混合模型使用图像分割法进行这一过程[36]。更具体地，使用图像分割法根据各像素的强度值将SHG图像的像素划分为胶原蛋白像素(即代表肝组织样本的胶原蛋白的像素)和背景像素。根据这一划分，通过为胶原蛋白像素给定第一标记和为背景像素给定第二标记以从SHG图像中产生SHG输出图罩(mask)。
从TPEF图像中识别内腔。TPEF图像就是用于这一目的，因为它记录了肝组织样本的自动荧光信号，因此，内腔在TPEF图像中将显示为“空的空间”(换言之，TPEF图像中代表内腔的像素具有低强度值)。因此可以使用分割方法识别TPEF图像中的内腔。特别地，在这一例子中，TPEF图像中的像素根据其强度值通过K均值无人监管聚类分析被分为3组，且具有最低平均像素强度的像素组被识别为初始内腔像素。随后通过应用形态闭运算操作和空穴填充操作来平滑包括初始内腔像素的区域。随后定位小的和/或具有不规则形状的平滑区域。特别地，小区域被限定为小于100μm2(假设其是一个肝细胞的最大可能尺寸)的区域，而具有不规则形状的区域被限定为其主轴长度与次轴长度之比大于5的区域(这些区域被假设为代表窦状隙空间)。既不小而且也不具有不规则形状的剩余的平滑区域被限定为内腔区域。这些内腔区域中的像素为内腔像素(即，代表肝组织样本的内腔的像素)。特别地，每个内腔区域代表肝组织样本中的一个内腔。随后通过为内腔区域中的内腔像素给定第一标记以及为剩余像素给定第二标记以从TPEF图像中生成TPEF输出图罩。
接下来，通过将SHG输出图罩和TPEF输出图罩重叠形成了组合输出图罩。这一组合输出图罩与SHG输出图罩及TPEF输出图罩一起从步骤102或202输出。
图4(a)示出了在这一例子中采集的其中一个图像的TPEF图像，图4(d)示出了同一采集图像的SHG图像。图4(b)和图4(e)分别示出了在图4(a)和图4(d)中TPEF图像和SHG图像获取的TPEF输出图罩和SHG输出图罩。具体地，图4(b)中TPEF输出图罩示出了黑色的内腔像素，而图4(e)中SHG输出图罩示出了白色的胶原蛋白像素。
步骤104或者步骤204
如上所述，在这一例子中，在步骤104或步骤204中提取的病理相关片段为三种胶原蛋白区域的形式，即，血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域。
病理医师已经验证了肝的血管周胶原蛋白、桥样联结胶原蛋白以及小叶纤维化胶原蛋白的结构模式是与肝中纤维化相关的CLD的进展或衰退的强有力的指示。特别地，图5示出了Metavir评分系统，该系统由病理医师广泛用于纤维化分期系统且该系统将肝纤维化分期为F0-F4级别。根据肝纤维化领域的组织-病理学知识，已知在没有纤维化的正常肝中，血管周胶原蛋白的量是很小的，其中，血管周胶原蛋白是围绕每个中心静脉区域(例如区域502)和肝门束区域(portal tractregion)(例如区域504)的胶原蛋白。正常肝在Metavir评分系统中被分期为F0。在图5中，血管周胶原蛋白示出为围绕中心静脉区域和肝门束区域的黑色斑块。在纤维化的早期进展中，发生血管周扩张，并且肝中每个肝门束区域开始被更多的血管周胶原蛋白围绕。具有这种血管周纤维化的肝在Metavir评分系统中被分期为F1。随着纤维化的进一步进展，尖刺状桥样联结胶原蛋白(图5中示出为灰色线，例如，线506)开始在肝中某些肝门束区域之间生长。具有这种生长的肝在Metavir评分系统中被分期为F2。随着纤维化的进一步进展，桥样联结胶原蛋白开始延伸并在一些肝门束区域之间、或者肝门束区域和中心静脉区域之间形成完整的桥样联结。具有若干桥样联结胶原蛋白的肝被分期为F3。桥样联结胶原蛋白最后延伸至在所有的肝门束区域和中心静脉区域之间形成宽阔的完整的隔膜，使小叶结构相互交叉，且围绕再生肝细胞结节[20，23-24]，导致肝完全由结节构成。这样的肝被分期为F4，表明肝具有硬化。与肝中窦状隙空间紧密相关的纤维化胶原蛋白也随着纤维化的进展发生改变。小叶纤维化胶原蛋白示出为肝门束区域和每个中心静脉区域之间的空间内的灰色斑点。
图6示出了用于在采集图像中提取血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域的步骤104或步骤204的子步骤602-606。这些子步骤602-606如下所述：
子步骤602：限定组合输出图罩中的感兴趣区域(ROI)
在子步骤602中，将来自步骤102或202的组合输出图罩的感兴趣区域(ROI)限定为每个ROI包括一个肝门束区域或一个中心静脉区域。使用步骤102或202的输出图罩完成这一限定。
理论上，期望在每个肝门束区域只存在有三个内腔(一个肝腔、一个肝动脉和一个胆管)。然而，实际上，由于诸如组织切片期间切片方向等原因，通常在一个肝门束区域存在有更多个内腔。因此，在子步骤602中，TPEF输出图罩中的内腔区域首先被聚类以根据它们到另一个内腔区域的接近性形成不同的肝门束区域或中心静脉区域。使用德劳内三角剖分(Delaunay triangulation)法完成这一过程。具体地，首先生成德劳内三角剖分图解：通过将每个内腔区域的中心处理为结节，然后以形成多个三角形的方式将这些结节中的每一个都连接到其直接相邻的结节，并且在任何形成的三角形中都没有结节。然后应用阈值长度识别小三角形，该阈值长度等于所形成的三角形的所有边的平均长度。特别地，如果三角形具有至少一条短边(也就是该边短于阈值长度)，则该三角形被认为是小三角形。随后识别通过小三角形的短边相连接的相邻结节组。
接下来，挑选出对应于上述识别的相邻结节组的组合输出图罩中各组内腔区域。随后识别每组内腔区域中内腔区域的凸包，然后填充以形成融合的内腔。
该融合的内腔与组合输出图罩中剩余的内腔区域一起形成新的结节集(每个融合的内腔可以是单个结节)。使用这一新的结节集，在组合输出图罩中建立沃罗诺伊图(Voronoi diagram)[42]。随后使用该沃罗诺伊图在组合输出图罩中限定多个ROI以便每个ROI均包括一个被认为代表肝门束区域或中心静脉区域的结节。
图4(c)示出了通过执行德劳内三角剖分法形成多个三角形，以聚类图4(b)的TPEF输出图罩中的内腔区域，而图4(f)示出了具有融合的内腔的组合输出图罩(即根据图4(c)的三角形形成的融合的闭合血管)。图4(i)示出了使用融合的内腔和组合输出图罩中剩余的内腔区域在这一组合输出图罩中定义的沃罗诺伊图，并且进一步突出强调了正方形400包括一个使用沃罗诺伊图定义的ROI(ROI402)。包括ROI 402的正方形400的放大图如图4(h)所示。
子步骤604：分割每个ROI中的胶原蛋白像素以形成血管周胶原蛋 白子区域、桥样联结胶原蛋白子区域以及小叶纤维化胶原蛋白子区域
在子步骤604中，分割每个ROI中识别的胶原蛋白像素以形成血管周胶原蛋白子区域、桥样联结胶原蛋白子区域以及小叶纤维化胶原蛋白子区域。使用图7所示步骤在每个ROI中根据胶原蛋白像素与内腔像素(在结节中)之间的关系执行这一分割。
特别地，图7中的步骤702-706用于识别ROI中的血管周胶原蛋白像素(即，代表血管周胶原蛋白的像素)。
在步骤702中，计算ROI中距离结节的边界多个欧几里得距离(Euclidean)处的胶原蛋白百分比(即胶原蛋白像素的百分比)。具体地，对于多个距离中的每个距离，定位距离结节的各个边界像素一段距离的像素，然后确定这些定位像素中胶原蛋白像素的数量。将每个距离的胶原蛋白百分比计算为该距离的定位像素中胶原蛋白像素的百分比。
在步骤704中，将截断距离计算为距离结节的边界的距离，在该距离处，胶原蛋白像素的百分比降低至在步骤702中获取的最大胶原蛋白百分比的一半。
在步骤706中，将结节边界的截断距离内的所有胶原蛋白像素识别为血管周胶原蛋白像素。换言之，将在小于截断距离的距离处在步骤702中定位的像素中的胶原蛋白像素识别为血管周胶原蛋白像素。这些血管周胶原蛋白像素形成ROI中血管周胶原蛋白子区域。
步骤708-714用于识别ROI中的桥样联结胶原蛋白。
在步骤708中，确定ROI中非血管周胶原蛋白像素(即，未被识别为血管周胶原蛋白像素的胶原蛋白像素)的方向轮廓。这一方向轮廓包括方向百分比，即沿着从ROI中结节中心起始的不同方向的非血管周胶原蛋白像素的百分比。每个方向都是直线的形式，该直线从结节的中心延伸到未包括在结节中的ROI中的像素(具体地，延伸到ROI中边界中的像素)。各方向以预定角度围绕结节的中心彼此间隔开。在方向轮廓中，各方向表示为相对于参照方向的角度。更具体地，参照方向表达为0°，而每个剩余方向表示为它与参照方向之间的角度。为了对某一方向确定方向百分比，识别与该方向重叠的非血管周胶原蛋白像素，并且将该方向百分比计算为与该方向重叠的所有像素内的非血管周胶原蛋白像素的百分比。
在步骤710中，发现非血管周胶原蛋白像素的方向轮廓的局部最大值。这一过程通过下述方式实施：首先，对每个方向确定沿着其自身的非血管周胶原蛋白像素的百分比(即该方向的方向百分比)是否大于沿着其各相邻方向的非血管周胶原蛋白像素的百分比(即其相邻方向的方向百分比)。如果是，且沿着该方向的非血管周胶原蛋白像素的百分比超出预定百分比阈值，则该方向被认为局部最大值。
在步骤712中，将与方向轮廓中所有的局部最大值重叠的胶原蛋白像素识别为初始桥样联结胶原蛋白像素。
接下来在步骤714中，执行连接成分分析以识别进一步的桥样联结胶原蛋白像素。特别地，使用连接成分分析评估没有被识别为血管周胶原蛋白像素或初始桥样联结胶原蛋白像素的胶原蛋白像素，以观察它们是否与初始桥样联结胶原蛋白像素相连。如果发现这些胶原蛋白像素中的任意一个连接到初始桥样联结胶原蛋白像素，则这一胶原蛋白像素被识别为进一步的桥样联结胶原蛋白像素。初始桥样联结胶原蛋白像素与进一步的桥样联结胶原蛋白像素形成ROI中的桥样联结胶原蛋白子区域。
最后，步骤716用于通过将ROI中所有剩余的胶原蛋白像素(即未被识别为血管周胶原蛋白像素、初始桥样联结胶原蛋白像素或者进一步的桥样联结胶原蛋白像素的那些胶原蛋白像素)识别为代表小叶纤维化胶原蛋白的小叶纤维化胶原蛋白像素来识别小叶纤维化胶原蛋白。这些小叶纤维化胶原蛋白像素形成ROI中的小叶纤维化胶原蛋白子区域。
图4(g)示出了胶原蛋白像素的百分比对距离图4(h)的ROI 402中的结节边界的不同距离进行绘图的曲线图。如图4(g)所示，胶原蛋白像素的最大百分比出现在点404，而胶原蛋白像素的百分比在点406减少至最大百分比的一半。因此，截断距离确定为对应于点406的距离408。图4(k)示出了将血管周胶原蛋白像素410识别为距离ROI402中结节的边界处截断距离408内的胶原蛋白像素。
图4(j)示出了为图4(h)的ROI 402获取的方向轮廓。图4(j)中这一方向轮廓包括沿着360个不同方向的非血管周胶原蛋白像素的百分比，这360个不同方向围绕ROI 402的结节均匀地彼此间隔开(具体地，以1°)。箭头指示了这一方向轮廓的局部最大值。图4(k)示出了ROI 402中桥样联结胶原蛋白像素412。这些桥样联结胶原蛋白像素412包括使用图4(j)的方向轮廓获取的初始桥样联结胶原蛋白像素412和使用连接成分分析获取的进一步的桥样联结胶原蛋白像素。图4(k)也示出了图4(h)的ROI 402中的小叶纤维化胶原蛋白像素414。
子步骤606：组合来自所有ROI的血管周胶原蛋白子区域、桥样联 结胶原蛋白子区域以及小叶纤维化胶原蛋白子区域以分别形成血管周 胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域
在子步骤606中，组合来自所有ROI的血管周胶原蛋白子区域、桥样联结胶原蛋白子区域以及小叶纤维化胶原蛋白子区域以分别形成血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域。
特别地，通过用第一标记来标记属于组合输出图罩的子血管周胶原蛋白区域的所有像素并用第二标记来标记剩余的像素以产生二值图罩，从而形成血管周胶原蛋白区域。以同样的方式形成桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域，除了它们分别使用属于桥样联结胶原蛋白子区域的像素和属于小叶纤维化胶原蛋白子区域的像素。换言之，在子步骤606中形成了代表血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域的三个二值图罩。
图8示出了在这一例子中为两个大鼠肝组织样本提取的血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域。其中一个样本为纤维化早期，而另一个为纤维化晚期。特别地，对于特定样本，通过重叠从子步骤606中获取的二值图罩形成图8中的各个处理的图像，且各个处理图像以不同灰度示出了不同的胶原蛋白区域。从这些处理的图像中可以看出，从两个组织样本中成功地提取了不同的胶原蛋白区域。换言之，不管组织样本的纤维化分期是什么，上述步骤可以有效地提取肝组织样本中的不同胶原蛋白区域。
步骤206
图9示出了在这一例子中步骤206是如何执行的流程图。
特别地，对于每个训练图像，首先在子步骤902-906中使用在步骤204中分别提取的血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤维化胶原蛋白区域获取初始血管周胶原蛋白特征、初始桥样联结胶原蛋白特征以及初始小叶纤维化胶原蛋白特征的量化值。然后，在子步骤908中，根据为所有的训练图像获取的量化值，分别从初始血管周胶原蛋白特征、初始桥样联结胶原蛋白特征以及初始小叶纤维化胶原蛋白特征中选择相关血管周胶原蛋白特征、相关桥样联结胶原蛋白特征以及相关小叶纤维化胶原蛋白特征。所有训练图像的这些相关血管周胶原蛋白特征、相关桥样联结胶原蛋白特征以及相关小叶纤维化胶原蛋白特征的量化值然后从子步骤908输出，随后在步骤208中使用。
子步骤902-906
图10示出了显示每个子步骤902-906是如何执行的流程图。特别地，对于训练图像，每个子步骤902-906的输入为分别从步骤204中获取的胶原蛋白区域，其中，该输入为包括多个像素的二值图罩的形式。如上所述，每个二值图罩的每个像素中或者具有第一标记(代表胶原蛋白区域中胶原蛋白的特定类型)或者具有第二标记。在下述描述的子步骤1002-1006中，在二值图罩中具有第一标记的像素被称作“目标胶原蛋白像素”，而具有第二标记的像素被称作“非目标胶原蛋白像素”。
子步骤1002：定位二值图罩中的胶原蛋白纤维
在子步骤1002中，定位二值图罩中的胶原蛋白纤维，而每个胶原蛋白纤维均包括代表肝组织样本中的纤维的像素。使用如图11所示的步骤1102-1106完成这一过程。
首先在步骤1102中，通过连接成分分析将目标胶原蛋白像素分割为多个相连接成分，来识别二值图罩中的胶原蛋白片段。每个相连接成分均包括多个相连接的二值图罩中的像素，且被识别为胶原蛋白片段。为每个相连接成分给定不同标记(例如，‘1’、‘2’、‘3’等)，而为非目标胶原蛋白像素均给定为标记‘0’。
接下来在步骤1104中，通过使用如下所述的重复过程减少胶原蛋白片段以从每个胶原蛋白片段中提取骨架。如果胶原蛋白片段包括边界像素，则通过去除胶原蛋白片段的边界像素生成初始骨架。如果这一初始骨架还包括边界像素，则通过去除最新生成的骨架的边界像素再次生成进一步的骨架。当下述停止条件成立时，停止生成进一步的骨架：最新生成的骨架不包括边界像素。在本发明中，目标的“边界像素”被定义为形成目标轮廓的一组像素，该轮廓为无端的环，且在至少另一像素处闭合。通过图像腐蚀(morphological erosion)执行上述提及的去除边界像素。通过下述限制选择待用的图像腐蚀的类型：对于所有的胶原蛋白片段，在上述提及的停止条件成立之前，去除最新生成的骨架的边界像素不会导致具有两个或多个不连接的像素组的结构，即最新生成的骨架不会分裂开。对于每个胶原蛋白片段，胶原蛋白片段在步骤1104中生成的最终骨架为步骤1104将被输出的骨架。以上述方式提取的每个骨架的像素与该骨架从中提取的各个胶原蛋白片段的边界像素等距。此外，每个骨架均为该骨架从中提取的胶原蛋白片段的形状的良好指示。
随后执行步骤1106-1108以根据骨架中像素的特性识别每个骨架中的单独纤维。
特别地，在步骤1106中，根据每个骨架中的像素(即骨架点)是否代表：(a)肝组织样本中纤维的末端、(b)肝组织样本中两个或多个纤维之间的交叉点、(c)其他情况，对其进行分类。具体地，如果骨架点代表如上所述的(a)，则其被分类为端点；如果骨架点代表如上所述的(b)，则其被分类为交叉点；如果骨架点代表如上所述的(c)，则其被分类为连接点。如下所述对骨架点进行分类。对于每个骨架点，如果不止两个骨架点与其相邻，则该骨架点被分类为交叉点；如果只有一个骨架点与其相邻，则该骨架点被分类为端点；如果恰恰有两个骨架点与其相邻，则该骨架点被分类为连接点。
接下来在步骤1108中，使用骨架中的交叉点、端点和连接点在每个骨架中识别单独纤维(或者更具体地，单独纤维的主轴)。特别地，对于在步骤1104中提取的每个骨架，执行一系列的搜索。每次搜索从骨架的端点开始，然后通过骨架的连续的相邻连接点，直到到达交叉点或另一骨架的端点。如果在搜索中到达另一端点，则单独纤维的主轴被识别为包括搜索进展中所通过的各个点。如果到达交叉点，则确定刚好在到交叉点之前的搜索路径的方向以决定是否继续该搜索。具体地，如果有连接点邻近该交叉点以使这一连接点、交叉点和搜索路径中直接在该交叉点之前的连接点形成一条直线，则搜索从该交叉点继续并沿着这一直线通过连续的相邻连接点。否则，该搜索停止，且单独纤维的主轴被识别为包括搜索进展中所通过的各个点。对每一个骨架的端点以上述提及的方式执行搜索，除非该端点已被识别为早期搜索中单独纤维的主轴的一部分。在执行完所有的搜索后，审查剩余骨架点以确定是否存在相连接的骨架点的组，该组包括至少一个不属于任何被识别的主轴的像素。如果是，那么每个这样的骨架点的组均被识别为单独纤维的主轴。
随后执行步骤1110-1112以根据步骤1108中识别的每个骨架中的主轴在二值图罩中定位胶原蛋白纤维。
特别地，在步骤1110中，从每个胶原蛋白片段中所有骨架的主轴中确定可被连接的可能配对的主轴。根据(i)定向每个主轴中的像素和(ii)对比每个主轴中的像素的强度值与胶原蛋白片段中其他像素的强度值来完成这一过程，下文将进行描述。具体地，因为每个主轴都是通过上述提及的搜索形成的，所以每个主轴均从第一终端点(终端点1)向第二终端点(终端点2)延伸，其中，终端点1在步骤1106中被分类为端点。对于每一个主轴，首先如下所述为其终端点1建立方向轮廓。该方向轮廓使用多个方向，且每个方向均包括从终端点1开始延伸并形成直线的多个骨架点，所形成的这些直线围绕终端点1间隔开。为了建立方向轮廓，对于之前提及的多个方向中的每个方向，将该方向上骨架点的强度值与终端点1的强度值进行对比。具体地，将这一对比计算为该方向上骨架点与终端点1之间的平均平方强度偏差对该方向上骨架点与终端点1之间的最大平方强度偏差的比例。与低于预定阈值0.2的比例有关的方向随后被确定为局部最小方向。接下来，确定是否有其他主轴，其中，该其他主轴的像素定向接近至少一个局部最小方向的定向(即距离局部最小方向的定向小于30°)。如果是，则这一其他主轴和所述主轴被识别为可能配对的可被连接主轴。进一步地，这一其他主轴的终端点(特别地，具有方向轮廓的靠近主轴的终端点)和具有方向轮廓的主轴的终端点1被识别为可被连接的可能点(或者可能连接的点)。
接下来在步骤1112中，根据配对主轴之间的像素的强度值的改变，为每个可被连接的可能配对的主轴计算置信评分。特别地，步骤1112执行为：首先确定连接配对主轴的可能连接点的路径，然后将置信评分计算为这一路径中相邻像素之间的平方强度偏差的熵的总和。
接下来在步骤1114中，将每个可被连接的可能配对的主轴的置信评分与预定阈值相对比。如果这一置信评分高于预定阈值，则连接可能配对的主轴以形成单个纤维的主轴。
最后在步骤1116中，所有的主轴输出为二值图罩的定位的胶原蛋白纤维。
子步骤1004：将每个定位的胶原蛋白纤维分类为聚集胶原蛋白纤维或分散胶原蛋白纤维
接下来，在子步骤1004中，在子步骤1002中定位的每个胶原蛋白纤维被分类为聚集胶原蛋白纤维或分散胶原蛋白纤维。
特别地，二值图罩中属于不止一个定位的胶原蛋白纤维的像素首先被识别为交联点。如果二值图罩中定位的胶原蛋白纤维具有一个或以上交联点，这表明该纤维与另一纤维相连，因此，该纤维被分类为聚集胶原蛋白纤维。相应地，形成这一纤维的像素被识别为聚集胶原蛋白像素(即代表聚集胶原蛋白的像素)。另一方面，没有交联点的定位的胶原蛋白纤维被分类为分散胶原蛋白纤维，相应地，形成这些纤维的像素被识别为分散胶原蛋白像素(即代表分散胶原蛋白的像素)。
子步骤1006：使用分类的定位的胶原蛋白纤维计算胶原蛋白特征的量化值
接下来在子步骤1006中，使用分类的定位的胶原蛋白纤维计算初始胶原蛋白特征的量化值。
子步骤908：选择相关胶原蛋白特征并输出这些所选择的相关胶原 蛋白特征的量化值
在这一例子中，使用分类-特定集合特征选择法(class-specificensemble feature selection method)完成每个下述选择：从初始血管周胶原蛋白特征选择相关血管周胶原蛋白特征、从初始桥样联结胶原蛋白特征选择相关桥样联结胶原蛋白特征、以及从初始小叶纤维化胶原蛋白特征中选择相关小叶纤维化胶原蛋白特征，该分类-特定集合特征选择法如下所述。
通过替换训练图像重采样以建立100例自助样本，每个自助样本均包括相同数量的训练图像。这在自助样本之间生成了差异。对于每例自助样本，使用支持向量机递归特征消除(SVM-RFE)法[39]对初始胶原蛋白特征(初始血管周胶原蛋白特征、初始桥样联结胶原蛋白特征或者初始小叶纤维化胶原蛋白特征)进行排序。特别地，SVM-RFE法使用自助样本的图像训练SVM机(支持向量机)，并根据这一训练提取最佳的全部特征子集(即，能够根据这些图像中的大鼠肝组织样本的纤维化分期更精确地分离自助样本中的图像的特征子集)。还可以为每个自助样本生成每个特征的集合等级[43]。
一般假设为，不管自助样本如何改变，重要特征将趋向于仍由SVM-RFE法进行选择。因此，待选的相关特征应该包括在100例自助样本所提取的100个最佳全部特征子集中出现频率最高的特征。在这一例子中，首先设置截断频率为90％。如果一个特征在所提取的100个最佳全部特征子集中出现了至少90％，则该特征被选择为一个相关胶原蛋白特征。
下方表1、2和3分别示出了这一例子中34种初始血管周胶原蛋白特征、28种初始桥样联结胶原蛋白特征和25种初始小叶纤维化胶原蛋白特征。如表1-3所示，这些特征与所有的胶原蛋白纤维相关，在每个所提取的胶原蛋白区域中只有聚集纤维或者只有分散纤维。
每组训练图像所选择的相关胶原蛋白特征在表1-3中均以灰色显著突出。具体地，这组训练图像选择的19个相关血管周胶原蛋白特征如表1所示，选择的13个相关桥样联结胶原蛋白特征如表2所示，且选择的8个相关小叶纤维化胶原蛋白特征如表3所示。
图12(a)、13(a)、14(a)分别示出了从34个初始血管周胶原蛋白特征中选择19个相关血管周胶原蛋白特征、从28个初始桥样联结胶原蛋白特征中选择13个相关桥样联结胶原蛋白特征、从25个初始小叶纤维化胶原蛋白特征中选择8个相关小叶纤维化胶原蛋白特征。
表1
表2
表3
步骤106
在这一例子中，对于每个试验图像及其对应组的训练图像，在步骤106中只为试验图像获得步骤206期间所选择的相关特征的量化值(使用相应组的训练图像)。例如，对于与表1-3中以灰色显著突出的相关特征有关的一组训练图像，在方法100的步骤106中只为相应的试验图像获得这些特征的量化值。
以与上述描述的步骤206相同的方式在步骤106中获得这些特征的量化值。
步骤208和步骤108
在这一例子中，通过在每个图像中(或者试验图像或者训练图像)对每一集的相关胶原蛋白特征(即相关血管周胶原蛋白特征、相关桥样联结胶原蛋白特征和相关小叶纤维化胶原蛋白特征)的量化值执行下述步骤以实施步骤108和步骤208。
首先对该集的相关胶原蛋白特征的各量化值执行PCA以获得不相关主成分(PC)。从PCA中获得的每个PC为各特征(每个特征具有不同的权重)的加权和，其中首要主成分具有最大的可能性变化(即它代表各特征中大多数的可变性)且每个随后的PC具有小于前一PC的可能性变化。
然后，选择满足下述成分选择标准的各PC：(1)所有所选择的PC的变化的累积百分比应该超过各特征的总变化的75％以及(2)每个所选择的PC的变化应该不少于各特征的总变化的10％。
所选择的PC随后从步骤108或者步骤208输出。换言之，为每个图像输出三组PC集(分别从相关血管周胶原蛋白特征、相关桥样联结胶原蛋白特征和相关小叶纤维化胶原蛋白特征获得的血管周PC、桥样联结PC和小叶纤维化PC)，每组PC集包括各自选择的PC。
图12(b)、13(b)、14(b)分别示出了在对这一例子中所采集图像的来自表1的相关血管周胶原蛋白特征、来自表2的相关桥样联结胶原蛋白特征和来自表3的相关小叶纤维化胶原蛋白特征执行PCA后获得的PC。图12(b)、13(b)、14(b)各进一步示出了由PC代表的变化的累积百分比进行绘图的曲线图1202、1302、1402。
特别地，由图12(b)、13(b)、14(b)可以看出，两个最显著PC[39]占了各自所选择的相关胶原蛋白特征的总变化的很大一部分(在图12(b)中超过75％、在图13(b)中接近80％、在图14(b)中超过80％)，而这两个最显著PC中的每一个还占这一总变化的超出了10％。因此，根据如上提及的成分选择标准，为所有的相关胶原蛋白特征集选择首要和次要显著PC。
图12(c)和(d)分别示出了在这一例子中所有所采集图像中相关血管周胶原蛋白特征所获得的首要和次要显著PC的值，图13(c)和(d)分别示出了在这一例子中所有所采集图像中相关桥样联结胶原蛋白特征所获得的首要和次要显著PC的值，图14(c)和(d)分别示出了在这一例子中所有所采集图像中相关小叶纤维化胶原蛋白特征所获得的首要和次要显著PC的值。在图12(c)-(d)、图13(c)-(d)、图14(c)-(d)中的每一个中，以各个PC值对与从中获得该值的图像有关的纤维化分期进行绘图。
如图12(c)、13(c)、14(c)所示，对于所有相关胶原蛋白集，首要PC的值有随着纤维化进展到晚期而逐渐增长的趋势。这很可能是因为多数所选择的相关特征随纤维化进展而改变。另一方面，图12(d)、13(d)、14(d)示出了次要PC只对纤维化分期1和分期2之间的差异敏感。次要PC的这一敏感性可能是因为分散胶原蛋白百分比(即分散CPA)和分散胶原蛋白纤维的数量(即分散纤维的数量)随着纤维化从分期1进展到分期2而进行的改变。因此，由图12(c)、13(c)、14(c)可知，在这一例子中通过根据上述提及的成分选择标准选择PC，对肝纤维化的精确和有效评估可以执行为纤维化进展期间形态学特征的改变，这些改变可以由所选择的PC来体现。
步骤210
在这一例子中，对于每组训练图像，使用所有的PC—步骤208中获取的血管周PC、桥样联结PC和小叶纤维化PC—分别对第一、第二、第三和第四多项逻辑回归模型进行训练，以提供全体参数集—血管周参数集、桥样联结参数集、小叶纤维化参数集。
这些全体参数集—血管周参数集、桥样联结参数集、小叶纤维化参数集共同从步骤210输出，作为代表训练模型的参数集。
步骤110
在这一例子中，基于在步骤108中对试验肝组织样本及其上述提及的在步骤210中获取的相应训练模型获取的PC生成代表每个试验肝组织样本中纤维化程度的统计数据。这些统计数据包括肝组织样本处于特定纤维化分期的概率、血管周指标、桥样联结指标、小叶纤维化指标和qFibrosis指标。
图15示出了步骤1502-1508，以在这一例子中获取qFibrosis指标。特别地，在步骤1502中，首先使用全体参数集通过将所有的PC输入到多项逻辑回归模型中预测一系列概率值pi。每个概率值pi表明试验肝组织样本处于特定纤维化分期i的概率。然后使用上述方程(1)和子步骤1502的概率值pi获取qFibrosis指标。更具体地，在步骤1504中，将每个概率值pi首先与期望值Ei(设定为i)相乘以获取乘积。在步骤1506中，随后将在步骤1504中获取的乘积加和以获取∑pi*Ei，随后在步骤1508中，通过α＝1/4归一化这一加和∑pi*Ei以产生qFibrosis指标。产生的qFibrosis指标为从0到1范围内的连续变量。
以与上述获得qFibrosis指标相似的方式获取血管周指标、桥样联结指标、小叶纤维化指标。然而，为获取血管周指标，在步骤1502中只输入血管周PC，并且多项逻辑回归模型使用血管周参数集而不是全体参数集。为获取桥样联结指标，在步骤1502中只输入桥样联结PC，并且多项逻辑回归模型使用桥样联结参数集。为获取小叶纤维化指标，在步骤1502中只输入小叶纤维化PC，并且多项逻辑回归模型使用小叶纤维化参数集。
图16(a)-(c)分别示出了这一例子中为所有采集的图像获取的血管周指标、桥样联结指标、小叶纤维化指标。以这些指标对与从中获取指标的图像有关的纤维化分期(Metabir评分)进行绘图。如图16(a)-(c)所示，血管周指标在纤维化分期1和分期2之间改变最大，而桥样联结指标在纤维化分期2和分期3之间改变最大。这与血管周扩张出现在桥样联结胶原蛋白形成之前并且在纤维化进展中扩张的组织-病理学知识相一致。
方法100的示例性实施的可替代方案
在由权利要求所限定的本发明的保护范围内，上述方法100的示例性实施的多种变型都是可能的。下文给出一些这种变型的例子。
例如，方法100可以在人活检肝组织样本或其他类型的动物肝组织样本上以同样的方式进行实施。根据方法100的改变，对本领域技术人员显然的是，方法100还可以用于评估除肝外的其他组织的纤维化。例如，上述示例性实施可以用于评估诸如慢性肾小球肾炎等的器官系统的纤维化。
而且，不使用用于在步骤102和202中识别胶原蛋白区域和内腔区域的像素的强度值，可以使用与像素有关的颜色值、纹理值或任何其他值。可以根据成像过程中所使用的造影剂选择待用值的类型。
此外，在步骤704中，可以以不同方式计算截断距离。例如，截断距离可以设置为胶原蛋白减少至最大胶原蛋白百分比的不同比例处的距离。这一不同比例可以是40％到60％之间的百分比。此外，在步骤708中，方向轮廓可以包括任意数量方向的方向百分比。以手动识别的桥样联结胶原蛋白作为参照，使用多个ROI可以调整方向的数量以及各方向之间的间隔(可以不需要是常量)。还可以以同样的方式调整步骤710中使用的预定百分比阈值。
也可以改变方法100的示例性实施例中所用的其他阈值。例如，这些阈值包括：当在步骤102或202中从TPEF图像中识别内腔时，用于定义小区域和具有不规则形状的区域的阈值；在步骤1110中用于确定局部最小方向的阈值；以及在步骤1110中用于确定是否主轴的像素定向接近局部最小方向的定向的阈值。
而且，尽管在上述例子中使用平行计算同时执行子步骤902-906，但它们还可以按序执行。
此外，使用不同于图像腐蚀的其他方式可以执行步骤1104中去除像素以提取每个胶原蛋白片段的骨架，前提是仍要满足约束条件(对于所有的胶原蛋白片段，在停止条件成立之前，去除最新生成的骨架的边界像素不会导致具有两个或多个不相连的像素组的结构)。
此外，步骤108和208中，可以使用诸如偏最小二乘(PLS)技术的其他转换技术转化量化值。
训练模型也可以不使用多项逻辑回归模型，尽管这样的模型是优选的，因为它可以为每个试验图像产生多个例如5个或7个结果(或者更具体地，概率)。
此外，尽管上述方法100的示例性实施例使用了Metavir评分系统，但它也可调整为使用Ishak评分系统。
用于实施方法100和200的系统
图17示出了用于实施根据本发明实施例的方法100和200的系统1700。
特别地，此系统1700包括用于采集试验图像和训练图像的成像系统1702。这一成像系统1702可以为显微镜或者全切片扫描仪。
系统1700还包括用于接收对方法100和200的输入(包括成像系统1702的图像和人工操作员的用户输入)的输入装置1704。人工操作员的用户输入可以包括：诸如是否所采集的图像用于训练模型或者用于输入至方法100等指令，或者与训练图像有关的真实数据。
系统1700进一步包括计算平台或数据处理平台，该平台又包括处理器1706、存储装置1708、输出装置1710和记忆装置1712。处理器1706被配置为执行方法100和200，而且可以为本地(如本地计算机)或者远程(例如远程服务器)。记忆装置1712被配置为暂时存储实施方法100和200期间所采集的图像和任何所采集的数据。存储装置1708也可以是本地的或者远程的，而且被配置为存储代表训练模型的参数。方法100生成的统计数据和为所采集的图像计算的量化值也可以存储于存储装置1708。方法100生成的统计数据还可以进一步转移到输出装置1710以显示。
方法100的应用
方法100可以用于许多应用。例如，方法100可以用于在基础研究和医疗实践中精确分析肝纤维化，如上述示例性实施所证。方法100也可以是极好的互补工具，用于传统半定量组织病理学肝纤维化评估方法、以及用于当前的肝活检纤维化评估的黄金标准惯例。例如，病理医师通常在确定质量差的试验活检组织样本(例如短于15mm的较小的试验活检组织样本)的纤维化分期时面临多种困难。在这一情况中，通过使用质量良好(即样本长于15mm)的活检组织样本训练的模型，方法100能够用作良好的互补工具以辅助病理医师确定并调整他们对质量差的试验活检组织样本的纤维化分期。此外，方法100可以用作教导工具以训练没有经验的病理医师。特别地，首先可以使用有经验的病理医师的知识(例如，通过有经验的病理医师决定每个训练图像中组织的纤维化分期)训练模型，然后将该模型用于方法100中以获取一系列试验图像的结果。可以应用这些结果以辅助没有经验的病理医师决定试验图像中组织的纤维化分期，因此，这些结果可以有助于教导没有经验的病理医师。
此外，方法100为用于评价增量处理功效的有效工具。这样的评价对于抗纤维化药物的开发和慢性肝疾病的相关研究是有用的。除了肝纤维化，方法100也可以应用于肿瘤学领域，即，评估这一领域中的肿瘤结缔组织和对治疗的响应(例如可以由后处理瘢痕的量来表示)。
具体地，方法100中生成的统计数据可以用于许多应用。这种应用的三个例子为对患者(试验图像是从该患者中获取的)的诊断、对患者的治疗疗效的评价和对其他诊断工具的验证。例如，根据示例性实施中生成的概率可以预估患者的肝的纤维化分期。此外，在该示例性实施中，由于所生成的指标对患者的肝的小改变是敏感的，可以每隔一段时期从经历了特定处理的患者采集试验图像，并且可以为每个试验图像生成指标以评价治疗的疗效。此外，为每隔一段时期所采集的试验图像生成的指标可以与通过新开发的工具为这些试验图像所生成的测量结果相对比，以验证这些新开发的工具的性能。指标也可以用于替代组织学标记并用于需要组织-病理学评价的任何应用中。
方法100的优势
下文描述了方法100的一些优势。
方法100不需要对组织样本进行染色
方法100可以使用用免染成像技术(即，不需要对样本染色的成像技术)获取的图像。例如，方法100可以使用用SHG显微镜[14-16]和TPEF显微镜获取的图像。上文在方法100的示例性实施中对此进行了解释说明。
不需要对组织样本进行染色能够完全避免染色的人为影响，这转而有助于实现同时精确评估例如组织样本的胶原蛋白含量和形态学信息[17]。不需要对组织样本进行染色和消化吸收也使得易于在不干涉现存协议、或者不需要额外信息或材料的情况下在各种研究中使用方法100。此外，在方法100中使用SHG技术是尤其有利的，因为SHG技术可以在不对组织样本染色的情况下为厚的组织样本提供3D可视化能力[18]，因此能够使组织样本的实时3D检测降低到细胞水平。
方法100为全自动
此外，方法100为全自动。“自动”意味着，尽管可能用人机交互开启算法，但在算法的执行过程中不需要人机交互(尽管可选地，方法100可以半自动执行，其中，在处理期间存在人与计算机的交互作用)。
方法100为全定量
方法100的另一优势为它是全定量的且几乎不依赖用户的观察，而由于观察者内部和外在偏差，用户的观察通常是高度主观的。
方法100的示例性实施使用了三种不同类型的胶原蛋白区域的特 征的量化值
特别地，方法100的示例性实施是有利的，因为它使用了三种不同类型的胶原蛋白区域(血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域)的特征的量化值去评估肝纤维化。这与慢性病毒感染和慢性胆汁郁积失调症的许多当前的分期和评分系统形成了对照，即在慢性病毒感染和慢性胆汁郁积失调症中，纤维化胶原蛋白—即细胞外周/窦周隙内的胶原蛋白—的改变没有被详述[23-25]。此外，因为血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域是病理相关的，因而使用这三种不同类型的胶原蛋白区域的特征的量化值要比使用并不病理相关的其他区域的特征更有利。
要注意，尽管本发明人在前述专利申请PCT/SG2011/000133的方法中也是识别了两种不同类型的胶原蛋白区域，即正常胶原蛋白区域和非正常胶原蛋白区域，并为这两种类型的胶原蛋白区域的每一个计算了CPA，但这一方法不同于方法100，因为它没有识别血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域。
因为使用了三种不同类型胶原蛋白区域的特征的量化值，在示例性实施中，通过获取患者的肝随时间的图像，所生成的统计数据可以用于精确地追踪患者的肝形态改变。具体地，使用血管周指标可以追踪患者的肝中血管周扩张的量；使用桥样联结指标可以追踪患者的肝中纤维化桥联结的量；使用小叶纤维化指标可以追踪患者的整个肝中微细胶原蛋白的一般分散。在纤维化进展的动态过程期间，已经观察到了这些改变[20]，因此，通过追踪这些改变，可以确定患者的肝随时间的纤维化分期。
从所有三种类型的胶原蛋白结构获取特征，从这些特征生成qFibrosis指标，因此，在某种意义上，qFibrosis指标为其他三种指标：血管周指标、桥样联结指标和小叶纤维化指标的组合。虽然通常期望这三种指标会随着纤维化进展而增加，但发现的是，每种指标在检测纤维化进展的不同分期时的有效性是不同的(例如，某种指标可能在检测分期2纤维化时更加敏感)。因此，作为所有三种指标的组合的qFibrosis指标可以检测肝中随时间的微细增量的纤维化改变，并且可以用于研究肝硬化中衰退模式。因此，qFibrosis指标在预后应用中非常有利。
方法100根据三种类型的胶原蛋白结构生成统计数据的能力其实是由于在方法100中所用的算法精确地且自动地区分不同类型的胶原蛋白的能力。
例如，从图8可以看出，使用方法100不管组织样本中纤维化分期如何，都可以有效地辨识出不同类型的胶原蛋白区域。
方法100的示例性实施使用了聚集胶原蛋白纤维和分散胶原蛋白 纤维的特征的量化值
在示例性实施中，方法100将每种类型的胶原蛋白区域的纤维均分为聚集胶原蛋白纤维和分散胶原蛋白纤维，并使用这两种类型中的每一种的纤维的特征的量化值。这还有助于追踪患者的肝的形态改变。
例如，诸如“聚集CPA/CPA”和“分散CPA/CPA”等特征能够反映聚集血管周胶原蛋白和分散血管周胶原蛋白随纤维化进展的动态改变，使用这些特征可以有助于追踪与这些动态改变有关的形态改变。
方法100的示例性实施使用了对成像的这部分组织稳定的特征
图18示出了在方法100的示例性实施中使用的一些特征与CPA测量结果之间的量化对比。使用如上所述方法100的示例性实施中所采集的、晚期纤维化(F4)的大鼠肝组织样本的三个不同切片1802、1804和1806的图像执行图18所示的对比。
如图18所示，为不同切片1802-1806所获取的CPA测量结果从11.47％到20.79％显著变化，这表明了CPA方法对成像的这部分组织样本的敏感性。在现有技术中已经报道了关于CPA的这种敏感性的类似发现。事实上，斯坦迪仕(Standish)等人[21]在它们的综述中已经声明CPA和组织学评分是完全不同的肝纤维化评估方法。
另一方面，如图18所示，为三个切片1802-1806所获取的血管周CPA百分比(血管周CPA/CPA)、桥样联结CPA百分比(桥样联结CPA/CPA)和小叶纤维化CPA百分比(小叶纤维化CPA/CPA)的变化非常小。具体地，这些百分比的变异系数(定义为标准偏差除以平均值)要远远小于CPA测量结果的变异系数。换言之，与CPA测量结果相比，这些百分比(血管周CPA/CPA、桥样联结CPA/CPA、小叶纤维化CPA/CPA)对成像的这部分组织样本非常不敏感。这同样应用于对结构测量，例如血管周胶原蛋白的厚度(即“截断宽度”)和桥样联结胶原蛋白的厚度(即“桥样联结宽度”)。这证明了在肝纤维化评估中，相对于只使用CPA测量结果，表征胶原蛋白结构改变的优势。
即使用小的组织样本仍可以良好地执行方法100的示例性实施
不适当的活检尺寸已经被引用为在众多临床实践中能够影响纤维化评估的精确性的一个主要因子[26]。已经提出建议，为评估慢性病毒性肝炎，组织样本的最小长度应该为20mm[27]。然而，斯坦迪仕等人的系统性综述示出，在实践中组织样本的平均活检长度只有13.5mm[21]。因此，希望具有一种不管活检样本的尺寸是否可用均能有效工作的方法。
与CPA方法相比，因为方法100的示例性实施使用了对组织样本的尺寸的敏感性较低(于CPA测量结果相比)的形态特征，所以它对试验组织样本的尺寸更加稳定，并且用小的组织样本也能够较好地执行。
特别地，表4示出了对于不同尺寸的图像，CPA测量结果与qFibrosis指标之间的对比。如上所述在示例性实施中采集大鼠肝组织样本，从这些样本中采集图像，将这些采集的样本的图像裁剪到原尺寸的一半、四分之一、八分之一和十六分之一，从而获取不同尺寸的图像。这些图像的最终尺寸在1mm2到16mm2的范围内。
表4
具体地，表4示出了对不同尺寸的图像获取的CPA测量结果及qFibrosis指标的曲线下面积(Area Under Curve，AUC)值。如表4所示，CPA测量结果以及qFibrosis指标的AUC值都随着输入图像的减小而减小。然而，可以看出，不管输入图像的尺寸如何，qFibrosis指标在区分肝组织样本的不同纤维化分期时都比CPA测量结果表现地更好。事实上，已经发现，当输入图像为1mm2大小时qFibrosis指标的表现与输入图像为8mm2大小时CPA测量结果的表现相似。即使在最小的试验图像尺寸(即1mm2)中，对qFibrosis指标获取的AUC值对于早期纤维化检测可以达到大约0.75，对于晚期纤维化检测可以达到0.85以上。另一方面，用最小的图像尺寸时CPA对早期纤维化检测不能有效执行(特别地，其AUC值小于0.65)。此外，与对CPA方法获取的AUC值相比，对方法100获取的AUC值在整个不同图像中变化较小。
方法100的示例性实施要比CPA方法与组织病理学评分相关性更 好
使用双尾威尔科克森等级和检验(two tailed Wilcoxon rank-sum test)预估CPA测量结果的统计差异和qFibrosis指标的统计差异在所有肝组织样本的不同Metavir分期中的显著性。使用Matlab软件(数学著作，纳提克，马萨诸塞州(The Math Works,Natick,Massachusetts))及其统计工具箱在0.05的显著水平处执行威尔科克森等级和检验以及ROC分析。
图19(a)-(b)为示出了qFibrosis指标及CPA测量结果在整个不同纤维化分期分布的箱形图，而图19(c)-(f)示出了CPA测量结果和qFibrosis指标的受试者工作特征曲线(ROC，receiver operatingcurve)，表明CPA测量结果和qFibrosis指标在区分肝组织样本的不同纤维化分期时有很大不同。
特别地，图19(a)和图19(b)分别示出了不同纤维化分期的肝组织样本的CPA测量结果和qFibrosis指标。如图19(a)所示，发现CPA测量结果横跨不同分期随着纤维化进展以指数形式增加。这与之前的报道[10-13，20]一致。尽管示出了CPA测量结果对肝组织样本的晚期纤维化分期展现了急剧增加，但CPA测量结果在肝组织样本的早期和中期之间的差异并不显著(分期1对分期2：p＝0.106)。然而，qFibrosis指标示出了更为线性的增加趋势。此外，qFibrosis指标横跨肝组织样本的所有纤维化分期均存在显著差异(p＜0.001)。
图19(c)-(f)示出了分别在区分肝组织样本的纤维化分期0和分期1、区分肝组织样本的纤维化分期1和分期2、区分肝组织样本的纤维化分期2和分期3、区分肝组织样本的纤维化分期3和分期4时，CPA测量结果与qFibrosis指标的受试者工作特征曲线(ROC)。从图19(c)-(f)可以看出在辨识肝组织样本的所有纤维化分期时qFibrosis指标对CPA测量结果的优越性。具体地，对于诊断肝组织样本的早期纤维化(即，在肝组织样本的纤维化分期0和分期1之间进行辨识)，发现qFibrosis指标的曲线下面积(AUC)为0.88，而发现CPA测量结果的AUC只有0.82。此外，使用CPA测量结果很难区分肝组织样本的分期1和分期2，但qFibrosis指标能够实现这一区分，AUC大约为0.8。对于诊断晚期纤维化分期的肝组织样本，CPA测量结果和qFibrosis指标都能有效工作，但当区分肝组织样本的纤维化分期2和分期3、肝组织样本的纤维化分期3和分期4时，与CPA测量结果相比，qFibrosis指标提供的AUC值仍是较大的。因此，从图19(c)-(f)可以看出，qFibrosis指标比CPA测量结果更敏感并具有特异性。
方法100用于确定纤维化的治疗计划
qFibrosis指标可以用作纤维化风险评分并可以整合到决策框架中，用于确定抗纤维化治疗是如何迫切必要的。例如，如上所述，qFibrosis指标可以辅助病理医师确定组织的纤维化分期。使用患者的配对活检组织样本，qFibrosis指标还有助于监控并预测患者组织中纤维化的进展速率。因此，qFibrosis指标可以有助于获取为确定治疗计划的重要信息。
当前，对末期肝硬化唯一有效的治疗是移植，且还未有药物被认可为抗纤维化。在参考文献[44]中可以发现为研发抗纤维化药物对当前的临床试验所作的描述。研发抗纤维化疗法的主要困难在于缺少精确的且已经建立的技术以预估响应疗法的纤维化衰退。使用方法100可以至少部分地克服这一困难，因为在给予患者这一治疗后，使用患者的一个或多个活检组织样本获取的qFibrosis指标可以用于监控纤维化衰退。这允许评价治疗疗效，并转而有利于决策以确定是否需要改进治疗计划。
因此，治疗具有纤维化的患者的方法可以包括根据患者组织的纤维化评估给予抗纤维化治疗，其中，该评估(其可以是qFibrosis指标的形式)是使用方法100获取的。抗纤维化治疗可以涉及使用抗纤维化药物或其他疗法，例如参考文献[44]中描述的那些疗法，其全部内容以引用方式并入本文。具体地，抗纤维化治疗可以旨在实现下述的一项或多项：(i)消除损伤原因及其媒介；(ii)降低炎症和免疫反应；(ⅲ)靶向特异性信号：受体-配体交互作用、胞内信号；(ⅳ)减少纤维发生，抑制基质合成；和(ⅴ)通过增加疤痕基质降解、刺激星状细胞凋亡、骨髓(BM)或细胞移植来分解纤维化。抗纤维化治疗可以使用诸如抗氧化剂、抗炎药物、骨髓干细胞等药物。
下文进一步描述了qFibrosis指标是如何可以用于确定具有肝硬化患者的治疗计划的。尽管肝硬化通常视为单独的纤维化分期，特别是末期，但事实上有两种类型的肝硬化，即代偿性肝硬化和失代偿肝硬化。使用现有技术的组织学评分系统不能将具有代偿性肝硬化的组织和具有失代偿肝硬化的组织相区分，因为这样的系统将肝硬化视为一个单独的纤维化分期。另一方面，qFibrosis指标为量化指标并能够检测微细的纤维化进展。因此，qFibrosis指标可以用于诊断并区分具有代偿性肝硬化的组织和具有失代偿肝硬化的组织。这样的区分对决定治疗计划至关重要。这是因为如果患者的疾病已经从代偿性肝硬化进展到失代偿肝硬化，这意味着患者处于死亡的更高风险期并需要肝移植。因此，治疗具有肝硬化患者的方法可以包括：如果使用方法100对所获取的患者组织的纤维化进行评估表明该患者具有失代偿肝硬化，则对患者执行肝移植。
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Claims (29)

1.一种用于评估组织纤维化的方法，所述方法使用组织的图像作为试验图像，其中，所述试验图像包括多个具有各自的强度值的像素，其中，所述方法包括：
(1a)从所述试验图像中识别血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域，所述血管周胶原蛋白区域包括代表所述组织的血管周胶原蛋白的像素，所述桥样联结胶原蛋白区域包括代表所述组织的桥样联结胶原蛋白的像素，所述小叶纤维化胶原蛋白区域包括代表所述组织的小叶纤维化胶原蛋白的像素；
(1b)根据所述试验图像中识别区域的特性为每一识别区域获取一个或多个特征的量化值；
(1c)使用为所有识别区域获取的量化值评估纤维化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1a)进一步包括：
从所述试验图像中识别胶原蛋白像素和内腔像素，所述胶原蛋白像素包括代表所述组织的胶原蛋白的像素，所述内腔像素包括代表所述组织的内腔的像素；然后，
根据所述胶原蛋白像素和所述内腔像素之间的关系，将所述胶原蛋白像素分割为所述血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述内腔像素包括多个内腔区域，每一内腔区域均具有代表所述组织的内腔的像素，所述像素包括边界像素，其中，分割所述胶原蛋白像素进一步包括：
对每一内腔区域进行下述步骤(3i)和(3ii)：
(3i)对于多个距离中的每一个，在距离所述内腔区域的各个边界像素一距离处定位各像素，然后确定所述定位像素中的胶原蛋白像素的数量；
(3ii)根据对所有距离确定的胶原蛋白像素的数量，提取包括代表组织血管周胶原蛋白的像素的血管周胶原蛋白子区域；然后，
通过将血管周胶原蛋白区域识别为包括对所有的内腔区域所提取的血管周胶原蛋白子区域，分割所述胶原蛋白像素。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，对每一内腔区域提取血管周胶原蛋白子区域进一步包括：
对于每一距离，将胶原蛋白百分比确定为在所述距离处的所述定位像素中胶原蛋白像素的百分比例；
将截断距离计算为所述胶原蛋白百分比为所确定的最大胶原蛋白百分比的预定比例时所述胶原蛋白百分比所在的距离；然后，
将定位于小于所述截断距离的距离处的像素中的所述胶原蛋白像素识别为血管周胶原蛋白子区域的像素。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述预定比例在40％到60％之间。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其中，分割所述胶原蛋白像素进一步包括：
对每一内腔区域进行下述步骤(6i)和(6ii)：
(6i)对于多条直线中的每一条直线，识别与所述直线重叠的胶原蛋白像素，其中，每条直线均从所述内腔区域的中心延伸到没有包括在所述内腔区域中的像素，并且，所述多条直线围绕所述内腔区域的中心以预定角度彼此间隔开；
(6ii)根据对所有直线识别的所述胶原蛋白像素，提取包括代表组织桥样联结胶原蛋白的像素的桥样联结胶原蛋白子区域；然后，
通过将所述桥样联结胶原蛋白区域识别为包括对所有内腔区域提取的所述桥样联结胶原蛋白子区域，分割所述胶原蛋白像素。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，对每一内腔区域提取所述桥样联结胶原蛋白子区域进一步包括：
对于每一直线，将方向百分比确定为在所有与所述直线重叠的像素内的胶原蛋白像素的百分比；
对于每一直线，确定对所述直线确定的方向百分比是否大于对其相邻直线确定的方向百分比和预定百分比阈值；然后
如果是，则将与所述直线重叠的所述胶原蛋白像素识别为所述桥样联结胶原蛋白子区域的像素。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，在所述将桥样联结胶原蛋白区域识别为包括对所有内腔区域提取的所述桥样联结胶原蛋白子区域之前，所述方法进一步包括：
将未包括在桥样联结胶原蛋白子区域内、但连接到所述桥样联结胶原蛋白子区域的胶原蛋白像素识别为代表组织的桥样联结胶原蛋白的进一步胶原蛋白像素；然后，
更新所述桥样联结胶原蛋白子区域以包括所述识别的代表组织的桥样联结胶原蛋白的进一步胶原蛋白像素。
9.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，步骤(1b)进一步包括：
从每一识别区域中，定位聚集纤维像素以及分散纤维像素，所述聚集纤维像素代表组织的聚集纤维，所述分散纤维像素代表组织的分散纤维；然后，
使用从所述识别区域中定位的所述聚集纤维像素和所述分散纤维像素为每一识别区域获取量化值。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述从每一识别区域中定位聚集纤维像素和分散纤维像素进一步包括：
从所述识别区域中定位多根纤维，每根纤维均包括代表组织的纤维的像素；
将所述识别区域中的交联点识别为在不止一根所定位的纤维上的像素；然后，
对于每根定位纤维，确定是否所述纤维包括至少一个交联点，如果是，则将包括在所述纤维中的像素定位为聚集纤维像素；如果不是，则将包括在所述纤维中的像素定位为分散纤维像素。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，定位多根纤维进一步包括：
通过将所述识别区域分割为多个相连接成分，以从所述识别区域中识别胶原蛋白片段，每个相连接成分均是包括多个相连接像素的胶原蛋白片段；
从每个胶原蛋白片段中提取骨架，所述骨架只具有包括在多根纤维中的像素；
根据所述骨架中像素的特性识别每个骨架中的单独纤维；然后，
使用所述骨架中的单独纤维定位多根纤维。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，从每个胶原蛋白片段中提取骨架进一步包括：
如果所述胶原蛋白片段包括边界像素，则通过去除所述胶原蛋白片段的边界像素生成初始骨架；然后
如果所述初始骨架包括边界像素，则通过去除最新生成的骨架的边界像素再次生成进一步的骨架，直到最新生成的骨架不包括边界像素。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，在每一骨架中识别单独纤维进一步包括：
根据所述像素是否代表：组织中纤维的末端、组织中两根或多根纤维之间的交叉点、或者其他情况，对骨架中的每一像素进行分类；
使用所述骨架中的每一像素的分类识别骨架中的单独纤维。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，如果所述像素代表纤维的末端，则骨架中每一像素被分类为端点；如果所述像素代表两根或多根纤维之间的交叉点，则骨架中每一像素被分类为交叉点；或者如果是其他情况，则骨架中每一像素被分类为连接点，其中，识别所述单独纤维包括通过下述内容识别每一单独纤维：
(14i)包括端点作为单独纤维的第一像素；
(14ii)包括连续相邻的连接点作为单独纤维的进一步的像素，直到最新包括的点与端点或交叉点相邻；以及
(14ⅲ)只要所述最新包括的点与交叉点相邻，且有连接点与所述交叉点相邻，则重复步骤(14ii)，以便所述连接点、所述最新包括的点和所述交叉点形成直线。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，识别所述单独纤维进一步包括：
确定是否存在骨架中相连接的像素的组，所述组具有至少一个未包括在之前确定的单独纤维中的像素，如果是，则将每个这样的组识别为单独纤维。
16.根据权利要求11-15任一项所述的方法，其中，使用骨架中单独纤维定位所述多根纤维进一步包括：
确定是否任一对单独纤维可被连接，如果是，则连接这对单独纤维以形成单一的单独纤维；然后，
将所述多根纤维定位为所述单独纤维；
其中，根据下述内容确定是否任一对单独纤维可被连接：
(16i)定向每一单独纤维中的像素；
(16ii)将每一单独纤维中像素的强度值与所述胶原蛋白片段中其他像素的强度值相对比；和
(16ⅲ)改变各根单独纤维之间的像素的强度值。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，对于每一单独纤维，将所述单独纤维中像素的强度值与所述胶原蛋白片段中其他像素的强度值相对比进一步包括：
将所述单独纤维的像素的强度值与所述单独纤维的像素每一个方向上的强度值相对比，其中，每个方向包括形成一直线的像素，所述直线从所述单独纤维的像素延伸，围绕所述单独纤维的像素与其他直线间隔开。
18.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，步骤(1c)进一步包括：
将所述量化值输入到训练模型以获取多个概率值，每个概率值表示组织处于纤维化特定分期的概率；然后，
使用所述多个概率值计算一个或多个指标。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，训练图像为纤维化分期已知的各组织的图像，使用多个所述训练图像并通过下述步骤获取所述训练模型：
(19a)从每个训练图像中识别血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域，所述血管周胶原蛋白区域包括代表所述组织的血管周胶原蛋白的像素，所述桥样联结胶原蛋白区域包括代表所述组织的桥样联结胶原蛋白的像素，所述小叶纤维化胶原蛋白区域包括代表所述组织的小叶纤维化胶原蛋白的像素；
(19b)对于每个训练图像，根据所述训练图像中的识别区域的特性为每个识别区域获取一个或多个特征的量化值；
(19c)使用为所有的训练图像获取的量化值训练所述模型。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，步骤(19b)包括：
对每个训练图像，获取所述血管周胶原蛋白区域的初始血管周胶原蛋白特征的量化值、所述桥样联结胶原蛋白区域的初始桥样联结胶原蛋白特征的量化值和所述小叶纤维化胶原蛋白区域的初始小叶纤维化胶原蛋白特征的量化值；然后，
根据为所有训练图像获取的量化值，分别从所述初始血管周胶原蛋白特征、初始桥样联结胶原蛋白特征和初始小叶纤维化胶原蛋白特征中选择相关血管周胶原蛋白特征、相关桥样联结胶原蛋白特征和相关小叶纤维化胶原蛋白特征；并且，
其中，步骤(1c)和(19c)中使用的所述量化值为步骤(19b)中所选择的所述相关血管周胶原蛋白特征、相关桥样联结胶原蛋白特征和相关小叶纤维化胶原蛋白特征的量化值。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中，在使用步骤(1c)和(19c)的量化值之前，将每个识别区域的量化值转化为多个不相关成分。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，通过下述步骤将每个识别区域的量化值转换为多个不相关成分：
通过主成分分析将所述识别区域的量化值转换为主成分；然后，
将所述主成分的子集选择作为所述识别区域的多个不相关成分。
23.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，在步骤(1b)中获取的一个或多个特征的量化值中，所述一个或多个特征包括一个或多个：
所述血管周胶原蛋白区域中像素数量与所有识别区域中像素数量之比；
所述桥样联结胶原蛋白区域中像素数量与所有识别区域中像素数量之比；
所述小叶纤维化胶原蛋白区域中像素数量与所有识别区域中像素数量之比；
所述血管周胶原蛋白区域的平均厚度；和
所述桥样联结胶原蛋白区域的平均厚度。
24.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，通过对从未经活检组织样本染色的组织中提取的活检组织样本进行成像来获取所述试验图像。
25.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述组织为肝组织。
26.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述方法用于下述中的一项或多项：
(26i)辅助病理医师评估组织纤维化；
(26ii)教导没有经验的病理医师如何评估组织纤维化；
(26ⅲ)评价对患者的特定治疗的效果；
(26ⅳ)诊断组织纤维化的水平；以及
(26ⅴ)验证用于评估组织纤维化的诊断工具。
27.一种计算机系统，所述计算机具有处理器，所述处理器设置为执行根据前述任一权利要求所述的方法。
28.一种诸如有形数据存储设备的计算机可读的计算机程序产品，包含可由计算机系统的处理器进行操作的指令，以使所述处理器执行根据权利要求1-26任一项所述的方法。
29.一种云计算系统，所述云计算系统包括安装在云上的根据权利要求28所述的计算机程序产品，所述计算机程序产品被配置为在远程服务器上运行。
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