CN104997804A - 一种层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纳米硒制备技术领域，具体公开了一种层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物及其应用。所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，通过如下方法制备得到：将硒盐溶液滴加至层状双金属氢氧化物LDH水合溶液中，搅拌，然后加入还原剂，持续搅拌至反应液成深红色，生成物离心、洗涤、干燥后得层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物SeLDH。所述的纳米硒复合物可以作为siRNA传送体系，促进siRNA的有序释放，同时增加胞内药物的浓度从而恢复耐药细胞对紫杉醇的敏感性。

Description

一种层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物及其应用

技术领域

本发明涉及纳米硒制备技术领域，具体涉及一种层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物及其应用。

背景技术

微管(MTs)，作为真核细胞细胞骨架的主要组成成分，参与了广泛的细胞进程。微管在多种细胞功能中具有重要作用，因此被作为抗肿瘤药物比如紫杉烷类和长春花碱的胞内靶向。这些微管结合剂能够扰乱有丝分裂纺锤体的正常形成，随之诱导细胞凋亡。紫杉烷类(泰素帝和紫杉醇)代表了一类重要的靶向微管的抗肿瘤药物，它可对肺癌、卵巢癌、乳腺癌和白血病进行体内体外治疗。然而，紫杉烷药物首次作用后再次化疗无反应或失败，促使内在或获得性肿瘤细胞耐药性严重制约着紫杉烷的临床应用。许多关于紫杉烷耐药细胞的耐药机制已经被提出，但只有两种是被临床认可的：ABC家族蛋白如P-糖蛋白(P-gp)的过表达和微管蛋白-同型表达的改变。

肿瘤细胞的多药耐药性(MDR)仍然存在于化疗中，从而导致化疗疗效降低。作为多耐药蛋白1(MDR1)或者ATP结合域家族成员(ABCB1)，P-gp是一种良好的ABC转运蛋白，可增加胞内抗肿瘤药物的外排从而降低其化疗效果。在许多肿瘤细胞如乳腺癌和肺腺癌细胞中，均发现P-gp的过量表达，从而导致MDR产生。逆转P-gp介导的MDR主要包括化学抑制剂介导的P-gp功能抑制以及RNA干扰介导的P-gp表达抑制。

靶向微管药物结合至β微管蛋白亚基上，从而有利于微管的组装。已有报道，人类中至少存在七种不同的β微管蛋白同型，它们的组成改变或突变会产生紫杉烷耐药性。研究也表明III型β微管蛋白mRNA和蛋白质在紫杉醇耐药的乳腺癌患者中是明显上调的。然而，III型β微管蛋白可能会导致微管的动态不稳定，从而削弱紫杉醇对微管的稳定作用，或者可能影响紫杉醇与β微管蛋白的结合。因此，越来越多研究倾向于III型β微管蛋白，它可作为检测癌症病人对化疗药物临床反应的预测性生物标记。

硒(Se)是人类和动物体内存在的一种重要的微量必需元素。流行病学研究、临床前调查和临床干预试验支持硒化合物可被用于癌症治疗的观点。例如，随着纳米技术的应用，纳米硒(SeNPs)在过去数十年中引起越来越多的关注，它表现出优良的抗肿瘤活性及低细胞毒性。然而，纳米硒的细胞吸收效果并不理想，这严重限制着它的临床应用。

为了克服P-糖蛋白和III型β微管蛋白介导的耐药性，抗癌策略急需开发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中的上述不足，提供一种层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，通过如下方法制备得到：将硒盐溶液滴加至层状双金属氢氧化物LDH水合溶液中，搅拌，然后加入还原剂，持续搅拌至反应液成深红色，生成物离心、洗涤、干燥后得层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物SeLDH。

优选地，所述的硒盐为Na₂SeO₃，所述的层状双金属氢氧化物为镁铝层状双金属氢氧化物MgAl-LDH，所述的还原剂为L-半胱氨酸。

优选地，所述的硒盐溶液与LDH水合溶液的体积比为1:1～3；硒盐溶液中硒盐的浓度为1～2M，LDH水合溶液的浓度为0.02～0.05M。

最优选地，硒盐溶液与LDH水合溶液的体积比为1:2；硒盐溶液中硒盐的浓度为1M，LDH水合溶液的浓度为0.025M。

优选地，所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物还负载有siRNA，其负载方法为：将SeLDH与siRNA溶于PH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，室温下孵育30～90min，得SeLDH-siRNA；所述SeLDH与siRNA的质量比为1～16:1。

更优选地，所述的siRNA选自PsiRNA、TsiRNA和/或MocksiRNA；得SeLDH-PsiRNA、SeLDH-TsiRNA或SeLDH-MocksiRNA。

所述siRNA的序列为：

PsiRNA：5’-AAGAAGGAAAAGAAACCAACUTT-3’；

TsiRNA：5’-UCUCUUCAGGCCUGACAAUTT-3’；

MocksiRNA：5’-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3’。

最优选地，所述的siRNA选自PsiRNA和TsiRNA，得SeLDH-pooledsiRNAs，其中PsiRNA和TsiRNA的摩尔比为1:1。

上述层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物在制备抗癌药物中的应用。

上述层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物作为抗癌药物或基因的传送体系或载体的应用，

上述层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物作为微管稳定剂、P-糖蛋白调控剂、β-tubulin III调控剂、PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂、MAPK/ERK抑制剂或caspase-3激活剂的应用。

有益效果：(1)亚硒酸盐首先嵌插于LDHs的夹层并经还原形成SeLDH纳米，然后通过带正电的SeLDH和带负电的siRNAs间的静电作用力复合多种siNRAs，可以作为传送体系，促进siRNA和药物的有序释放，同时增加胞内药物的浓度从而恢复耐药细胞对紫杉醇的敏感性；(2)本发明所述的SeLDH能够与siRNA形成稳定的纳米级粒子，并保护siRNA免受降解；SeLDH具有良好的输送siRNA进入细胞的能力；(3)本发明还发现，SeLDH可以作为一种微管稳定剂，能够阻遏细胞周期于G2期，扰乱正常有丝分裂纺锤体的形成，诱导细胞凋亡从而抑制细胞增殖；(4)当SeLDH复合不同siRNA传送体系后，SeLDH/siRNA，特别是SeLDH-pooled siRNAs，表现出高效的基因沉默效应，能够下调P-gp和β-tubulin III的表达；(5)此外，SeLDH-pooled siRNAs能够通过改变Bcl-2/Bax的表达、激活caspase-3及调控PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK途径诱导细胞凋亡。

附图说明

图1为层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物SeLDH的透射电镜(TEM)图。

图2为SeLDH基因负载试验图；其中A为LDH/siRNA凝胶电泳图；B为SeLDH/siRNA凝胶电泳图；C为SeLDH-siRNA和LDH-siRNA的siRNA的释放速率曲线图。

图3为细胞中siRNA吸收效率图；其中A为MCF-7细胞中siRNA吸收效率图，B为MCF-7/ADR细胞中siRNA吸收效率图。

图4为微管红色荧光探针检测微管蛋白聚集图。

图5为本发明层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物对P-gp和β-tubulin III的影响图；其中A为P-gp在MCF-7/ADR和MCF-7细胞中的表达水平图，B为β-tubulinIII在MCF-7/ADR和MCF-7细胞中的表达水平图，C为转染本发明层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物后，P-gp和β-tubulin III在MCF-7/ADR细胞中的表达水平图。

图6为SeLDH-pooled siRNAs对细胞凋亡相关蛋白的影响图；其中A为转染SeLDH-pooled siRNAs后对MCF-7/ADR细胞内磷酸化的AKT和ERK表达影响图；B为转染SeLDH-pooled siRNAs后对MCF-7/ADR细胞内Bcl-2、Bax和caspase-3表达影响图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1 层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物SeLDH的制备

将Mg(NO₃)₂(3mmol)和Al(NO₃)₃(1mmol)溶解于10mL去离子水中，并快速加入到40mL NaOH溶液(6mmol)中；混合物于室温下搅拌10min，并离心(5min，4500min^-1)收集所得泥浆；用40mL去离子水分别洗涤两次，离心后重悬于50mL去离子水中；将所得不均匀的悬浮液转移到反应釜中，100℃加热16h，即可制得透明、均匀的层状双金属氢氧化物纳米溶胶；溶胶中含有将近4mg/mL均匀分散的MgAl-LDH纳米粒子；

将一定量的Na₂SeO₃溶液(1mL，1M)滴加至MgAl-LDH纳米粒子的水合溶液(2mL，0.025M)中，并持续搅拌30min；接着，将L-半胱氨酸(L-Cys)加入混合液中，持续搅拌直至反应液成深红色；生成物经离心洗涤，即得SeLDH纳米溶胶，纳米溶胶经高速离心(30min，10000min^-1)并于60℃烘箱中进行干燥，得到红色固体粉末。粒子在透射电镜(TEM，加速电压80kV)下进行观察拍摄，如图1所示，SeLDH的平均粒径为116nm。

实施例2 层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物SeLDH-siRNA的制备

将100nM siRNA和不同质量的SeLDH于磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中，在室温(25℃)下孵育30min，即得不同质量比的SeLDH-siRNA，其中SeLDH与siRNA的质量比分别为1:1，2:1，4:1，8:1和16:1；

所述的siRNA选自PsiRNA、TsiRNA或MocksiRNA；得SeLDH-PsiRNA、SeLDH-TsiRNA或SeLDH-MocksiRNA。

所述的siRNA选自PsiRNA和TsiRNA的混合，得SeLDH-pooled siRNAs，其中PsiRNA和TsiRNA的摩尔比为1:1。

对比例1 LDH-siRNA的制备

将100nM siRNA和不同质量的MgAl-LDH混于磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中，在室温(25℃)下孵育30min，即得不同质量比的LDH-siRNA，其中MgAl-LDH与siRNA的质量比分别为1:1，2:1，4:1，8:1和16:1。

实施例3 SeLDH基因负载试验

琼脂糖凝胶电泳用来检测SeLDH和MgAl-LDH结合siRNA的能力。不同质量比(1:1至16:1)SeLDH/siRNA或LDH/siRNA于PBS中制得，并通过含1％琼脂糖的TBE缓冲液进行电泳1h。凝胶以1μg/ml溴化乙锭进行染色并于紫外成像仪下进行拍照成像见图2。图2A中显示当质量比超过4:1时，LDH结合的siRNA的迁移完全被阻滞，表明LDH可完全结合siRNA并保护其在电泳中不被降解。而SeLDH的结合能力相对较弱，图2B中显示直到质量比为8:1时才被完全阻滞。与LDH相比，SeLDH不会结合siRNA过于紧密以致不易于释放，从而发挥更大的生物学效应。

为了检测siRNA的释放，SeLDH/siRNA(16:1)和LDH/siRNA(16:1)分别于pH5.5和7.4的磷酸盐缓冲液中，37℃下孵育。在预定时间取出样品，5000r离心5min，用ES-2分光光度计(e-spect,Malcom,Japan)检测1μL上清液中siRNA的浓度。结果如图2C所示，siRNA在pH5.5或7.4的累积释放量随着时间的增长而增加。孵育8h后，SeLDH/siRNA中siRNA的释放累积量在pH5.5时增加到78.9％，但在pH7.4时仅增加至13.8％。在pH5.5时，LDH的siRNA的最高释放量与SeLDH相似；然而，LDH的siRNA释放速率却明显低于SeLDH。这说明SeLDH/siRNA具有控制siRNA释放的优良性能，且性能优于LDH/siRNA。

实施例4 层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物输送siRNA进入细胞

MCF-7和MCF-7/ADR细胞以每孔5×10⁴密度种于六孔板中，并于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。细胞与FAM标记的SeLDH/siRNA和LDH/siRNA于无血清培养基中孵育12h。然后将细胞以PBS洗涤三次，收集，并于流式细胞仪下检测。结果见图3。图3A和3B中显示，经SeLDH或者LDH孵育后，MCF-7和MCF-7/ADR细胞中siRNA吸收效率有明显的提高。SeLDH输送siRNA进入两种细胞的能力高于LDH。

实施例5 细胞毒性试验

MCF-7和MCF-7/ADR细胞以每孔4000细胞的密度种于96孔板中并孵育24h。接着以100μL含10％FBS的新鲜培养基替换旧培养液，并分别加入紫杉醇(Paclitaxel)、SeLDH、SeLDH-PsiRNA(8:1)、SeLDH-TsiRNA(8:1)和SeLDH-pooled siRNAs(8:1)。培养48h后，细胞以MTT工作液(0.5mg/mL)37℃处理4h。移去上清液，每孔加入150μL DMSO。最后，细胞培养板于酶标仪570nm下检测。

结果如表1所示，其中的IC₅₀值表明本发明制备得到的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物的抗癌效果均强于紫杉醇(Paclitaxel)。尤其在具有耐药性的MCF-7/ADR细胞中，发明制备得到的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物的抗癌效果远远好于紫杉醇。特别是SeLDH-pooled siRNAs的效果最佳。因此，本发明所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物可以作为抗癌药使用，尤其适合对已有抗癌药(如紫杉醇)形成耐药性的癌症患者使用。

表1.本发明所述的纳米硒复合物对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的IC50值

实施例6 本发明所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物对微管蛋白聚集的影响

采用微管红色荧光探针检测微管蛋白的聚集，结果如图4所示，与对照组相比，紫杉醇组的细胞表现出单一而完整的细胞核和正常的微管结构。而当MCF-7/ADR细胞经SeLDH或者SeLDH-pooled siRNAs(8:1)处理后，胞内出现明显的微管蛋白聚集以及不规则的多细胞核。由于SeLDH-pooled siRNAs的协同治疗作用，它比SeLDH组出现更多的多细胞核。这些结果表明SeLDH以及SeLDH-pooled siRNAs可作为一种微管稳定剂，可以促进微管聚集，抑制细胞有丝分裂，从而诱导细胞凋亡。

实施例7 本发明层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物对P-gp和β-tubulinIII的影响

用免疫印迹来检测本发明层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物对P-gp和β-tubulin III介导的耐药性的影响。如图5A-B，P-gp和β-tubulin III在MCF-7/ADR细胞中高表达，但在正常的MCF-7细胞中几乎是不表达的，进一步表明MCF-7/ADR细胞对紫杉醇具有耐药性。此外，当转染特异性靶向P-gp和β-tubulinIII的本发明层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物后，P-gp和β-tubulin III表达明显下调(图5C)。与对照组相比，SeLDH并不能明显改变MCF-7/ADR细胞中P-gp和β-tubulin III表达，表明未复合特异性siRNAs的SeLDH并不能引起P-gp和β-tubulin III基因沉默。P-gp的表达并不受SeLDH-TsiRNA的影响，β-tubulin III的表达也不受SeLDH-PsiRNA的明显影响，表明P-gp和β-tubulinIII的基因沉默均具有特异性。SeLDH-pooled siRNAs能同时下调P-gp和β-tubulin III的表达，表明本发明纳米硒复合物能够作为P-糖蛋白调控剂和β-tubulin III调控剂，通过克服P-gp和β-tubulin III介导的耐药性而发挥出更好的治疗作用，从而达到抗肿瘤效果。

实施例8 SeLDH-pooled siRNAs对细胞凋亡相关蛋白的影响

本实施例检测了SeLDH-pooled siRNAs(8:1)对MCF-7/ADR细胞内磷酸化的AKT和ERK表达的协同效应。如图6A，与对照组相比，P-AKT和P-ERK的表达几乎不受紫杉醇的影响；但经SeLDH和SeLDH-pooled siRNAs处理后，特别是后者，其表达明显下调。这些结果表明SeLDH-pooled siRNAs能够作为PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂和MAPK/ERK抑制剂，诱导PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK途径介导的细胞凋亡作用。

用免疫印迹法检测了经SeLDH-pooled siRNAs(8:1)转染的MCF-7/ADR细胞内Bcl-2、Bax和caspase-3表达情况。如图6B，细胞经SeLDH-pooled siRNAs处理后，Bax和Bcl-2蛋白水平随着浓度增加分别上调和下调，致使Bcl-2/Bax比下降。此外，随着浓度增加，caspase-3表达下调，cleaved caspase-3表达上调，表明药物通过降低Bcl-2/Bax比，激活caspase-3，最终导致细胞凋亡。这些结果表明SeLDH-pooled siRNAs能够作为caspase-3激活剂，通过激活caspase-3诱导细胞凋亡，从而恢复细胞对紫杉醇的敏感性以及克服细胞耐药性。

Claims (10)

1.一种层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，其特征在于，通过如下方法制备得到：将硒盐溶液滴加至层状双金属氢氧化物LDH水合溶液中，搅拌，然后加入还原剂，持续搅拌至反应液成深红色，生成物离心、洗涤、干燥后得层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物SeLDH。

2.根据权利要求1所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，其特征在于，所述的硒盐为Na₂SeO₃，所述的层状双金属氢氧化物为镁铝层状双金属氢氧化物MgAl-LDH，所述的还原剂为L-半胱氨酸。

3.根据权利要求1所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，其特征在于，硒盐溶液与LDH水合溶液的体积比为1:1～3；硒盐溶液中硒盐的浓度为1～2M，LDH水合溶液的浓度为0.02～0.05M。

4.根据权利要求3所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，其特征在于，硒盐溶液与LDH水合溶液的体积比为1:2；硒盐溶液中硒盐的浓度为1M，LDH水合溶液的浓度为0.025M。

5.根据权利要求1所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，其特征在于，所述的纳米硒复合物同时负载有siRNA，其负载方法为：将SeLDH与siRNA溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，室温下孵育30～90min，得SeLDH-siRNA；所述SeLDH与siRNA的质量比为1～16:1。

6.根据权利要求5所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，其特征在于，所述的siRNA选自PsiRNA、TsiRNA和/或MocksiRNA；所述siRNA的序列为：

PsiRNA：5’-AAGAAGGAAAAGAAACCAACUTT-3’；

TsiRNA：5’-UCUCUUCAGGCCUGACAAUTT-3’；

MocksiRNA：5’-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3’。

7.根据权利要求6所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物，其特征在于，所述的siRNA选自PsiRNA和TsiRNA，其中PsiRNA和TsiRNA的摩尔比为1:1。

8.权利要求1～7任一项所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物在制备抗癌药物中的应用。

9.权利要求1～7任一项所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物作为抗癌药物或基因的传送体系或载体的应用。

10.权利要求1～7任一项所述的层状双金属氢氧化物/硒纳米复合物作为微管稳定剂、P-糖蛋白调控剂、β-tubulin III调控剂、PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂、MAPK/ERK抑制剂或caspase-3激活剂的应用。