CN104997765B - 一种组合物及其预防和治疗酒精性肝病的应用 - Google Patents
一种组合物及其预防和治疗酒精性肝病的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种组合物，包括维生素A或其前药，和海兔素；优选的，所述两个组分摩尔比为：维生素A或其前药：海兔素＝1:0.5～11。所述维生素A或其前药优选为β‑胡萝卜素。本发明还提供所述组合物在制备预防和治疗酒精性肝病的药物中的应用。本发明所述的组合物通过协同作用，能够有效预防和逆转长期酒精暴露引起的肝脏损伤。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种包括海兔素和维生素A或其前药的组合物及其在预防和治疗酒精性肝病的医药用途。
背景技术
乙醇进人体内后通过胃肠道吸收,仅有2％～10％由呼吸道、尿液和汗腺以原形排出,其余90％在肝脏内氧化,很少在肝外代谢。经肝脏代谢的乙醇通过不同的途径氧化为对肝脏有直接毒性的乙醛，其会造成肝细胞变性坏死而引发一系列可逆或不可逆的变化。上述由酒精引起的肝损伤统称为酒精性肝病(alcohol liver disease，ALD)。一般来说，ALD包括轻症ALD(mild alcoholic injury，MAI)、酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)、酒精性肝炎(alcohol hepatitis，AH)、酒精性肝纤维化(alcoholichepaticfibrosis，AHF)和酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis，AC)等5种类型。最新流行病调查发现，ALD在全世界范围内依然是严重危害公众健康的常见疾病之一，并呈逐年上升趋势。随着我国饮食结构和生活方式的改变，ALD患病率也不断增高，对我国人民身体健康和社会发展构成了严重威胁。酗酒者90％以上易患脂肪肝，10％～35％发展为酒精性肝炎，约有8％～20％的慢性嗜酒者演变为肝硬化，甚或导致肝癌。据统计，酒精性肝硬化在肝硬化的病因构成比从1999年的10.8％上升到2003年的24.0％。因此，研究和发现治疗酒精性肝病的药物，尤其是在疾病发展初期进行有效早期干预进而逆转病情的药物，临床上具有重要的意义。
海兔素(Aplysin)是从三列凹顶藻中分离纯化得到的一种溴代倍半萜，分子量为295，结构式如1所示，具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生物学活性。梁惠等报道了50、100、150mg/(kg·bw·d)的海兔素对酒精性肝损伤具有保护作用，并探讨了可能的机制：海兔素可以剂量依赖性下调Fas、FasL的表达，从而可能通过抑制肝脏细胞的凋亡而发挥保肝作用(海兔素对酒精性肝损伤大鼠Fas/FasL及TNF-α表达的影响；丰暖，梁惠，等；《中国海洋药物》，2014年4月，Vol.33,No.2：24-30)；海兔素还可能通过抑制iNOS活性，下调肝细胞iNOS表达，减少NO的过量生成而起到保肝护肝的作用(海兔素对慢性酒精性肝损伤大鼠肝超微结构及NO和iNOS的影响；戈娜，梁惠，等；《中国海洋药物》，2014年6月，33(3)：63-68)。
β-胡萝卜素(β-Carotene)是类胡萝卜素之一，分子量为537，结构式如2所示，具有抗氧化、保护视力、促进骨骼生长发育等作用。β-胡萝卜素是维生素A的前药；但是只有当有需要时，人体才会将β-胡萝卜素转换成维他命A。这一个特征使β-胡萝卜素成为维生素A的一个安全来源，不会有因过量摄食而造成维生素A累积中毒现象。
迄今还没有海兔素和β-胡萝卜素对酒精性肝损伤具有协同作用的研究报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种包括海兔素和维生素A或其前药的组合物。该组合物能够显著改善、甚至逆转长期酒精暴露引起的肝损伤。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种组合物，包括维生素A或其前药，和海兔素。
优选的，所述组合物中，所述两个组分摩尔比为：
维生素A或其前药：海兔素＝1:0.5～11。
优选的，所述组合物中，所述两个组分摩尔比为：
维生素A或其前药：海兔素＝1:0.5～4。
更优选的，所述组合物中，所述两个组分摩尔比为：
维生素A或其前药：海兔素＝1:0.6～3。
进一步优选的，所述组合物中，所述两个组分摩尔比为：
维生素A或其前药：海兔素＝1:2～3。
上述组合物中，所述维生素A或其前药优选为β-胡萝卜素。
本发明的另一目的在于提供上述组合物在制备预防和治疗酒精性肝病的药物中的应用。
优选的，所述述酒精性肝病是指轻微酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝。
本发明还有一个目的在于提供一种预防和治疗酒精性肝病的药物，包括上述的组合物。
优选的，所述药物还可以包括药学上可以接受的辅料。
优选的，所述药物为口服制剂，选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂和口服液中的一种。
本发明还有一个目的在于提供上述预防和治疗酒精性肝病的药物的制备方法，包括将所述组合物和药学上可以接受的辅料混合，按照本领域常规的方法制备成临床上可以接受的制剂。
本发明所述药学上可以接受的辅料，包括(1)稀释剂，例如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸氢钙、药用碳酸钙等)、甘露醇等、植物油、聚乙二醇等；(2)粘合剂，例如蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素等；(3)崩解剂，例如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠等；(4)润滑剂，例如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁等。(5)矫味剂，如蔗糖、甜菊素等。
在用于预防和治疗酒精性肝病时，本发明所述的组合物的施用对象为人或哺乳动物。出于此目的，本发明所述组合物的摄入的质量或给予的质量，根据组合物中所述组分的纯度、服用对象的年龄、体重等不同而不同。作为预防或治疗酒精性肝病用，按照成人体重70kg计算，通常成人每天摄入量为20-40mg，更优选的每天摄入25-35mg。
β-胡萝卜素是维生素A的前药，其生理活性与维生素A基本一致。因此，本发明关于所述组合物的活性研究，都以β-胡萝卜素为所述“维生素A或其前药”的代表。
研究发现，单独应用40mg/(kg·bw·d)β-胡萝卜素及单独应用70、90mg/(kg·bw·d)海兔素，才可以显著降低酒精性肝损伤大鼠血清中胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TBIL)的水平，与模型组比较有显著差异(P＜0.05)。经计算，两者的半数有效剂量(ED50)分别为(39.32±2.68)mg/(kg·bw·d)和(86.64±6.52)mg/(kg·bw·d)。海兔素和β-胡萝卜素10、20、30mg/(kg·bw·d)联合应用时，海兔素的ED50分别为(65.88±6.47)mg/(kg·bw·d)、(30.04±2.42)mg/(kg·bw·d)和(12.65±0.52)mg/(kg·bw·d)。随着β-胡萝卜素剂量的增加，海兔素ED50显著降低，两者显示出协同作用；尤其是20mg/kgβ-胡萝卜素与30mg/kg海兔素联用时，协同作用最强。
本发明提供的组合物，特别是优选的组合物，活性组分之间的协同作用使β-胡萝卜素与海兔素在远低于各自ED50的剂量即可以显著降低由酒精损伤引起的血清总胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL)和总胆红素(TBIL)水平的升高；显著逆转酒精对包括肝脏指数、肝功能酶学指标(ALT、AST和ALP)、血清内毒素水平、血浆过氧化水平、抗氧化能力(还原性谷胱甘肽、过氧化物歧化酶、过氧化氢酶)、肝组织NAD+/NADH比率、红细胞膜流动性等的生理、生化指标的影响，从而起到保护肝脏，预防和治疗酒精性肝病的作用。
肝脏是人体代谢的主要器官，以胃肠道方式吸收的物质，包括具有保肝护肝作用的物质，都是通过肝脏代谢的。在预防和治疗长期酒精暴露引起肝损伤时，本发明提供的组合物以成分之间的协同增效作用减少各自的服用量，发挥更显著的作用，可以减轻肝脏的负担，临床上将对患者更有意义。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示的是试验例1中的β-胡萝卜素和海兔素相互作用关系图，其中的实斜线为两者作用相加线，虚线之间的部分为A点的95％可信区间。A点为β-胡萝卜素10mg/kg时，海兔素的ED50；B点为β-胡萝卜素20mg/kg时，海兔素的ED50；C点为β-胡萝卜素30mg/kg时，海兔素的ED50。
图2显示的是试验例2中各组大鼠HE染色肝组织病理切片的显微照片，其中A是正常组大鼠，B是酒精模型大鼠，C是20mg/kgβ-胡萝卜素组大鼠，D是30mg/kg海兔素组大鼠，E是20mg/kgβ-胡萝卜素+30mg/kg海兔素组大鼠。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
其中，海兔素由青岛大学医学院医学营养研究所从三列凹顶藻中提取纯化蜘，由中国科学院海洋研究所鉴定，其分子式为C15H19OBr，分子量为295。
实施例1一种组合物
原料(摩尔比)：
β-胡萝卜素：海兔素＝1:10.92
实施例2一种组合物
原料(摩尔比)：
β-胡萝卜素：海兔素＝1:9.1
实施例3一种组合物
原料(摩尔比)：
β-胡萝卜素：海兔素＝1:3.64
实施例4一种组合物
原料(摩尔比)：
β-胡萝卜素：海兔素＝1:2.73
实施例5一种组合物
原料(摩尔比)：
β-胡萝卜素：海兔素＝1:1.82
实施例6一种组合物
原料(摩尔比)：
β-胡萝卜素：海兔素＝1:1.21
实施例7一种组合物
原料(摩尔比)：
β-胡萝卜素：海兔素＝1:0.61
实施例8一种片剂
取实施例4所述的组合物与适量淀粉混合均匀，压片，即得。
实施例9一种胶囊剂
取实施例7所述的组合物与适量淀粉混合均匀，湿法造粒，整粒，装胶囊，即得
试验例1β-胡萝卜素和海兔素预防和治疗酒精性肝病的相互作用研究
1.实验方法
1.1动物分组和处理方案健康雄性Wistar大鼠，随机分为19组，每组10只，具体分组情况如下：
A.正常对照组：1组，生理盐水灌胃；
B.酒精模型组：1组，56°红星二锅头灌胃连续10周：第1周5.5ml/(kg·bw·d)，第2周7.5ml/(kg·bw·d)，第3周8.0ml/(kg·bw·d)，第4周9.0ml/(kg·bw·d)，第5周～第10周11ml/(kg·bw·d)；
C.β-胡萝卜素干预组：下设4个组(C1，C2，C3，C4)，分别灌胃给予10、20、30、40mg/(kg·bw·d)β-胡萝卜素+56°红星二锅头(56°红星二锅头灌胃剂量和方式同酒精模型组)；
D.海兔素干预组：下设4个组(D1，D2，D3，D4)，分别灌胃给予30、50、70、90mg/(kg·bw·d)海兔素+56°红星二锅头(56°红星二锅头灌胃剂量和方式同酒精模型组)；
E.药物联合应用干预I组：下设3个组(E1，E2，E3)，分别灌胃给予10mg/(kg·bw·d)β-胡萝卜素+海兔素40、50、60mg/(kg·bw·d)+56°红星二锅头(56°红星二锅头灌胃剂量和方式同酒精模型组)；
F药物联合应用干预II组：下设3各个组(F1，F2，F3)，分别灌胃给予20mg/(kg·bw·d)β-胡萝卜素+20、30、40mg/(kg·bw·d)海兔素+56°红星二锅头(56°红星二锅头灌胃剂量和方式同酒精模型组)；
G药物联合应用干预III组：下设3各个组(G1，G2，G3)30mg/(kg·bw·d)β-胡萝卜素+10、20、30mg/(kg·bw·d)海兔素+56°红星二锅头灌胃(56°红星二锅头灌胃剂量和方式同酒精模型组)；
各组大鼠均持续灌胃10周，一天一次；末次灌胃后禁食12h，戊巴比妥麻醉，腹主动脉取血，同时摘取肝组织，用于指标检测。
1.2酒精模型成立及药物保肝效应有效标准
酒精模型组与正常对照组比较，血清总胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)和总胆红素(TBIL)含量均升高有统计学意义(P<0.05)，作为酒精模型建立成功标准。在模型成立的前提下，药物干预组血清CHOL、LDL和TBIL含量与酒精模型组比较均降低，差异有显著性(P<0.05)，作为药物保肝效应有效的标准。
1.3β-胡萝卜素与海兔素联合应用保肝效应判定标准
通过公式1计算单用β-胡萝卜素或海兔素的半数有效量(ED50)。
ED50＝lg-1[Xm-i×(∑P-0.5)] 1
其中，Xm为最大剂量组剂量对数值；
i为相邻两组剂量高剂量与低剂量值比的对数；
P为各组动物有效率；
∑P为各组动物产生药效数之总和。
将β-胡萝卜素单用的ED50标在X轴上，海兔素单用的ED50标在Y轴上，两点相连即为相加线。将β-胡萝卜素与海兔素联合应用的ED50标在坐标轴上，同时标上其95％可信区间，如ED50落在相加线左侧，则两药为协同效应，如落在相加线右侧则两药为拮抗作用，如落在相加线上，则为相加作用。
2.结果与讨论
2.1各组大鼠血清CHOL、LDL和TBIL含量
结果见表1。
表1药物对酒精性肝病大鼠血清学指标的影响
*：P<0.05，与正常对照组比较；#：P<0.05，与酒精模型组比较。
2.1.1酒精模型组与正常对照组比较，血清CHOL、LDL和TBIL含量均显著升高(P<0.05)，表明酒精模型建立成功。
2.1.2单独应用40mg/kgβ-胡萝卜素组及单独应用70、90mg/kg海兔素组，血清CHOL、LDL和TBIL含量与酒精模型组比较均明显降低，差异有显著性(P<0.05)，表明单独应用β-葫芦萝卜素和海兔素分别达到上述剂量才能对酒精性肝病具有保护效应。
2.1.3 10mg/kgβ-胡萝卜素与50、60mg/kg海兔素联合应用组、20mg/kgβ-胡萝卜素与30、40mg/kg海兔素联合应用组及30mg/kgβ-胡萝卜素与10、20、30mg/kg海兔素联合应用组，血清CHOL、LDL和TBIL水平较酒精模型组均显著降低(P<0.05)。在上述联合应用组中，β-胡萝卜素和海兔素的剂量都低于单独应用达到相同药效水平时的剂量，尤其是20mg/kgβ-胡萝卜素与30mg/kg海兔素组以及30mg/kgβ-胡萝卜素与10mg/kg海兔素组，海兔素的剂量远低于其单独应用时的显效剂量，且组合物总剂量与β-胡萝卜素的单用有效剂量相近，甚至相同。
2.2β-胡萝卜素与海兔素保肝效应的相互作用
利用公式1，计算出β-胡萝卜素和海兔素单独应用时的ED50，以及与β-胡萝卜素10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg合用时海兔素的ED50，结果见表2。
表2药物对酒精性肝病的ED50
从表2的数据可以看出，随着β-胡萝卜素剂量的增加，海兔素的ED50逐渐降低，说明β-胡萝卜素可以增强海兔素的作用。
依照前述1.3的方法绘制出β-胡萝卜素和海兔素相互作用关系图，见图1。联合用药组三点，A点的95％可信区间与相加线相交，表明在该配比关系时两药产生相加作用，而B点和C点，95％可信区间与相加线都未重叠且在左侧，表明在该配比关系下两药产生协同效应，且B点(20mg/kgβ-胡萝卜素与30mg/kg海兔素联用)协同效应最强，是本发明优选的组合物。
试验例2β-胡萝卜素与海兔素协同对酒精性肝损伤的保护作用机制研究
1.实验方法
取试验例1中的正常对照组、酒精模型组、20mg/kgβ-胡萝卜素组、30mg/kg海兔素组及20mg/kgβ-胡萝卜素+30mg/kg海兔素联用组大鼠肝组织、红细胞、血浆及血清进行如下指标检测。
1.1肝脏指数的计算
肝脏指数(％)＝肝脏重量(g)/体重(g)×100％
1.2 HE染色进行肝脏病理学检查
操作步骤为：
(1)肝组织标本经10％中性甲醛固定、二甲苯透明、石蜡包埋后，4-5μm厚连续切片。
(2)切片行二甲苯脱蜡、梯度乙醇(100％,95％,80％,75％)漂洗及蒸馏水冲洗洗。
(3)切片行苏木素染色后以自来水冲洗；盐酸乙醇分化、自来水浸泡后置于伊红染液中。
(4)切片经常规脱水、透明、封片及中性树脂封固。
(5)在OLYMPAS BX60多功能显微镜下，选取不同视野进行病理学观察并照相。
1.3血清肝功能酶学指标的测定
采用赖氏法检测血清谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)活力，采用微量酶标法检测血清碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活力，测定步骤严格按试剂盒说明进行。
1.4血清内毒素水平测定
采用显色基质鲎试剂法检测血清内毒素水平，所有使用容器均经180℃、24小时去热原处理，实验步骤严格按照试剂盒说明进行。
1.5β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠抗氧化系统的影响
1.5.1血浆脂质过氧化物(LPO)含量检测
采用微板法检测血浆LPO含量，按照试剂盒说明书进行操作。
1.5.2血浆丙二醛(MDA)含量检测
采用硫代巴比妥酸法(TBA法)测定血浆过氧化脂质降解产物中MDA水平。测定过程严格按试剂盒说明进行。
1.5.3肝组织及线粒体还原性谷胱甘肽(GSH)水平测定
采用二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)比色法检测GSH水平，按照试剂盒说明书进行操作。
1.5.4血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定
采用DNTB比色法测定血浆GSH-Px活性，按照试剂盒说明书进行操作。。
1.5.5血浆及线粒体超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
采用黄嘌呤氧化酶法检测血浆及线粒体SOD活力，测定方法严格按照试剂说明书进行。线粒体制备方法如下：
①取新鲜肝脏，用预冷的生理盐水进行清洗，滤纸吸干，在平皿中剪碎，整个过程在冰浴上完成。
②将肝碎块盛入50ml离心管，按1:3比例加预冷的匀浆介质，将其置于组织捣碎机制成匀浆。
③浆制备好的匀浆液于1500r/min，4℃离心10min，弃沉淀，留取上清。
④将上述上清液以10000r/min，4℃离心15min，沉淀即为线粒体，上清为胞浆液。
⑤将胞浆液提出，沉淀用4℃，30％甘油0.01M PBS液体(按1g/ml)混匀，重悬，分装于2ml EP管中冻存于-80℃冰箱。
1.5.6血浆过氧化氢酶(CAT)活性测定
采用可见光法检测CAT活性，具体测定方法严格按照试剂说明书进行。
1.6肝组织NAD+/NADH测定
采用酶法分别测得肝组织乳酸和丙酮酸的含量，以乳酸/丙酮酸表示NAD+/NADH，所有步骤严格按试剂盒说明进行。
1.7红细胞膜流动性测定
1.7.1红细胞膜的制备
采用低渗一步溶血法制备红细胞膜。取新鲜肝素钠抗凝血，4℃，3000r/min，离心5min，取下层红细胞沉淀，用10倍体积预冷的生理盐水洗3次，弃上清。将红细胞沉淀加入预冷的10mM Tris-HCl缓冲液(PH7.4)中，缓冲液与红细胞体积比为20:1。震荡使其充分混匀，置于4℃冰箱中50min充分溶血。4℃，12000r/min，离心10min，小心留取下层红细胞膜。加入Tris-HCl缓冲液充分混匀，4℃，12000r/min，离心10min，重复3次，得到乳白色血影膜，将其悬浮于Tris-HCl缓冲液缓中，得到红细胞膜悬液。采用考马斯亮兰法测定膜蛋白浓度，调整膜蛋白浓度为500～800μg/ml。
1.7.2红细胞膜荧光标记
取上述红细胞膜悬液2.0ml，加入2.0×10-6mol/L的DPH 2.0ml，37℃温育30min，4000r/min离心10min。采用pH7.4PBS缓冲液，4000r/min，离心10min洗2遍，去残余标记液，将样本悬浮在4ml PBS溶液中。
7.3红细胞膜荧光偏振度测定
采用荧光偏振光分光光度计测定荧光偏振度。将石英杯置于受测台上，设定激发波长(Ex)与发射波长(Em)分别为362nm及432nm，激发狭缝与发射狭缝分别为5nm及10nm。激发光光轴呈水平方向时测得水平及垂直方向的荧光强度为IHH及IHV；呈垂直方向时水平及垂直方向的荧光强度为IVH及IVV。通过公式2和公式3计算计算荧光偏振度(fluorescencepolarization，P)和微粘度(microviscosity，η)。
P＝IVV-GIVH/IVV+GIVH 2
其中，IVV为起偏器与检偏器的光轴均为垂直方向时的荧光强度；
IvH为起偏器的光轴为垂直方向，检偏器的光轴为平行方向时的荧光强度；
IHV为起偏器的光轴为平行方向，检偏器的光轴为垂直方向时的荧光强度；
IHH为起偏器与检偏器的光轴均为平行方向时的荧光强度；
G为光栅因子，G＝IHV/IHH。
η＝2P/(0.46-P) 3
1.8统计学分析
采用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，对于分布呈正态且方差齐的资料，多组间比较采用ANOVA，对于分布呈正态但方差不齐的资料，多组比较采用Kruskal–Wallis H检验，检验水准α＝0.05。
2.结果与讨论
2.1各组大鼠生长发育状况及肝脏指数变化
结果显示，正常对照组大鼠生长发育状况良好，体毛顺滑富有光泽，饮食及粪便均正常，体重亦持续增加；酒精模型组大鼠体毛粗糙杂乱无光泽，精神不佳，食欲减退、部分大鼠出现稀软便；20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组大鼠精神状态、体毛、饮食、大便情况均较酒精模型组无明显改善，而二者联合应用则使大鼠生长发育状况得到显著改善。
上述各组大鼠体重、肝脏指数见表3。
表3各组大鼠体重、肝脏指数
*：与正常对照组比较，P＜0.05；#：与酒精模型组比较，P＜0.05；★：与酒精模型组比较，P＞0.05。
表3的数据显示，与正常对照组比较，酒精模型组大鼠周体重轻微降低，而肝脏指数则显著升高(P<0.05)。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组大鼠周体重及肝脏指数均较酒精模型组无显著差异(P＞0.05)。联合应用组，大鼠周体重较酒精模型组轻微升高(P＞0.05)，而肝脏指数则明显低于酒精模型组(P<0.05)。上述结果表明，长期酒精摄入可对机体生长发育状况及肝组织产生不利影响，一定剂量及配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精损伤大鼠生长发育状况及肝组织发挥良好的改善作用。
2.2β-胡萝卜素与海兔素联合应用对大鼠肝脏组织病理学改变的影响
各组肝组织切片HE染色结果见图2。
图2显示，正常对照组(A)大鼠肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，肝细胞结构正常，无明显脂肪变性。酒精模型组大鼠(B)肝小叶结构不清，肝索排列紊乱，可见炎性细胞浸润和坏死，肝细胞肿胀，出现明显脂肪变性，胞浆空泡化。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组(C、D)，肝小叶及肝索排列仍较为紊乱，肝细胞脂肪变性及炎性细胞浸润程度亦未得到明显改善。而二者联合应用后(E)，肝小叶结构趋向正常，肝索排列也较为整齐，肝细胞脂肪变性明显得到改善。
实验结果表明，长期酒精摄入可造成肝组织脂肪变性、炎细胞浸润等病理学改变，一定剂量及配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用对缓解酒精损伤大鼠肝组织病理学损伤具有一定的保护作用。
2.3β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠血清肝功能酶学指标影响
各组的血清ALT、AST和ALP测定结果见表4。
表4各组大鼠血清肝功酶学指标
*：P<0.05，与正常组比较；★：P＞0.05，与酒精模型组比较；#：P<0.05，与酒精模型组比较。
表4数据显示，与正常对照组比较，酒精模型组大鼠血清ALT、AST和ALP水平明显升高(P<0.05)，分别为正常对照组的1.59、1.50和2.09倍。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组血清ALT、AST和ALP水平与酒精模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。而二者联合应用后，血清ALT、AST及ALP水平则较酒精模型组显著降低(P<0.05)。
研究结果表明，长期酒精摄入可导致机体肝功能受损，一定剂量和配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用对改善酒精损伤大鼠肝脏功能具有良好的修复作用。
2.4β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠血清内毒素水平影响
各组血清内毒素水平测定结果见表5。
表5各组大鼠血清内毒素水平
*：P<0.05，与正常组比较；★：P＞0.05，与酒精模型组比较；#：P<0.05，与酒精模型组比较。
内毒素是肠道内G-菌产生的一种毒素，当肠粘膜受到损伤通透性增大时，内毒素可渗漏入血并诱发肝组织炎性损伤。表5的数据显示，与正常对照组比较，酒精模型组大鼠血清内毒素水平显著升高(P<0.05)，达到正常对照组的1.35倍。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组血清内毒素水平与酒精模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，而二者联合应用后，血清内毒素水平则较酒精模型组显著降低(P<0.05)。
研究结果提示，长期酒精摄入可能引起肠粘膜损伤，造成内毒素血症，损伤肝脏。一定剂量和配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用可能通过修复肠粘膜损伤，减少内毒素渗漏，从而发挥保肝作用。
2.5β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠抗氧化系统的影响
2.5.1β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠血浆脂质过氧化物水平影响
各组大鼠血浆脂质过氧化物含量测定结果见表6。
表6各组大鼠血浆脂质过氧化物含量
*：P<0.05，与正常组比较；★：P＞0.05，与酒精模型组比较；#：P<0.05，与酒精模型组比较。
大量研究表明，长期酒精摄入可诱导机体发生氧化应激，产生过量LPO及MDA等脂质过氧化物，对机体组织造成损伤。表6数据显示，与正常对照组比较，酒精模型组血浆LPO水平及MDA含量均显著升高(P<0.05)，分别达到正常对照组的2.40倍和1.46倍，提示酒精损伤可诱导大鼠机体产生氧化应激反应，与相关报道一致。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组大鼠血浆LPO及MDA水平与酒精模型组比较均无显著性差异(P＞0.05)。而二者联合应用后，大鼠血浆LPO水平及MDA含量明显降低，与酒精模型组比较，分别降低了34.05％和22.83％，差异具有显著性(P<0.05)。试验结果提示一定剂量和配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用可能通过缓解氧化应激，减少脂质过氧化物的产生，从而对酒精损伤大鼠肝组织发挥保护作用。
2.5.2β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠GSH水平的影响
各组大鼠肝脏及线粒体中GSH含量测定结果，见表7。
表7各组大鼠GSH含量测定结果
*：P<0.05，与正常组比较；★：P＞0.05，与酒精模型组比较；#：P<0.05，与酒精模型组比较。
GSH是机体内重要的非酶性抗氧化物质，能直接清除机体内氧化应激过程中生成的活性氧(ROS)，同时也是许多解毒抗氧化酶的底物之一。表7数据显示，与正常对照组比较，酒精模型组大鼠肝脏及线粒体GSH含量分别降低了54.16％和49.92％，差异具有显著性(P<0.05)。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组大鼠肝脏及线粒体GSH含量与酒精模型组比较均无显著性差异(P＞0.05)。二者联合应用后，大鼠肝脏及线粒体GSH含量明显升高，与酒精模型组比较，分别升高了73.78％和69.13％，差异具有显著性(P<0.05)。
结论：长期酒精摄入可引起机体抗氧化物质消耗甚至耗竭，导致活性氧等脂质过氧化物清除障碍，对机体造成损伤。一定剂量和配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用可能通过提高机体抗氧化物质的生成，以加快机体对脂质过氧化物的清除，以发挥保肝作用。
2.5.3β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠抗氧化酶活性的影响
各组大鼠的血清SOD、血清GSH-Px、肝脏CAT及肝线粒体Mn-SOD测定结果见表8。
表8各组大鼠抗氧化酶活性水平测定结果
*：P<0.05，与正常组比较；★：P＞0.05，与酒精模型组比较；#：P<0.05，与酒精模型组比较。
GSH-Px，SOD和CAT为机体重要的酶性抗氧化物质，它们与GSH等非酶性抗氧化物质共同维持着机体正常的氧化平衡。表8数据显示，与正常对照组比较，酒精模型组大鼠血清SOD、GSH-Px、肝脏CAT及肝线粒体Mn-SOD活性均明显降低(P<0.05)。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组大鼠各抗氧化酶指标与酒精模型组比较均无显著性差异(P＞0.05)。二者联合应用后，大鼠血清SOD、GSH-Px、肝脏CAT及肝线粒体Mn-SOD活性分别较酒精模型组升高了15.60％、31.86％、19.15％和27.07％，差异具有显著性(P<0.05)。
结论：长期酒精摄入同样可引起机体抗氧化酶活力减弱或耗竭，导致脂质过氧化物堆积，损伤机体组织。一定剂量和配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用可能通过提高机体抗氧化酶活力，以提高机体对脂质过氧化物的清除能力，从而对肝组织发挥保护作用。
2.6β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠肝脏NAD+/NADH的影响
各组大鼠肝脏NAD+/NADH测定结果见表9。
表9各组大鼠肝脏NAD+/NADH测定结果
*：P<0.05，与正常组比较；★：P＞0.05，与酒精模型组比较；#：P<0.05，与酒精模型组比较。
有研究显示，NAD+/NADH与酒精性肝损伤引起的氧化应激密切相关，且乳酸与丙酮酸浓度的比例可以反映NAD+/NADH。表9数据显示，与正常对照组比较，酒精模型组大鼠肝脏NAD+/NADH比率降低了45.16％，差异具有显著性(P<0.05)。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组大鼠肝脏NAD+/NADH与酒精模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。二者联合应用后，大鼠肝脏NAD+/NADH比率较酒精模型组提高了58.82％，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论：长期酒精摄入可诱导机体发生氧化应激，造成NAD+/NADH比率发生改变。一定剂量和配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用可能通过改善机体氧化应激状况，从而发挥保肝作用。
2.7β-胡萝卜素与海兔素联合应用对酒精暴露大鼠红细胞膜流动性的影响
各组大鼠红细胞膜偏振度(P)和微粘度(η)测定结果，见表10。
表10各组大鼠红细胞膜流动性测定结果
*：P<0.05，与正常组比较；★：P＞0.05，与酒精模型组比较；#：P<0.05，与酒精模型组比较。
红细胞膜流动性的改变在氧化损伤早期即可表现出来，常作为检测细胞早期氧化损伤的敏感指标。荧光偏振法测得的偏振度(P)和微粘度(η)可较好反映红细胞膜流动性状态，其值与细胞膜流动性成反比。表10的数据显示，与正常对照组比较，酒精模型组大鼠红细胞膜偏振度和微粘度明显升高，膜流动性显著下降(P<0.05)。20mg/kgβ-胡萝卜素或30mg/kg海兔素单独干预组大鼠红细胞膜流动性与酒精模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。二者联合应用后，大鼠红细胞膜偏振度和微粘度显著降低，膜流动性较酒精模型组显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论：长期酒精摄入产生的自由基可能对膜脂质造成损伤，导致红细胞膜流动性下降。一定剂量和配比关系的β-胡萝卜素与海兔素联合应用可能通过缓解氧化应激，改善膜脂质损伤，从而对肝组织发挥保护作用。
本试验例结果表明，长期酒精暴露会对机体的各项生理、生化指标产生显著影响，进而带来肝损伤。20mg/kgβ-胡萝卜素和30mg/kg海兔素单独应用时，对长期酒精暴露大鼠肝损伤有关的各项生理、生化没有影响。而两者作为组合物联合给药，相互之间通过协同作用，能够显著逆转酒精对包括肝脏指数、肝功能酶学指标(ALT、AST和ALP)、血清内毒素水平、血浆过氧化水平、抗氧化能力(还原性谷胱甘肽、过氧化物歧化酶、过氧化氢酶)、肝组织NAD+/NADH比率、红细胞膜流动性等的生理、生化指标的影响，从而起到保护肝脏，预防和治疗酒精性肝病的作用。
总之，本发明提供了一种包括维生素A或其前药，和海兔素的组合物。在所述组合物中，两种组分发挥相加或协同的作用，对酒精性肝损伤大鼠有显著的治疗作用，能够保护肝脏功能，通过多种途径逆转酒精对肝脏的损伤。以本发明所述组合物为活性成分的药物应用于临床，对酒精性肝损伤病人，尤其是酒精性脂肪肝病人具有积极的意义。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (10)
1.一种用于预防和治疗酒精性肝病的组合物，由β-胡萝卜素和海兔素组成；所述组合物中，所述两个组分摩尔比为：
β-胡萝卜素：海兔素=1:0.5~11。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，所述两个组分摩尔比为：
β-胡萝卜素：海兔素=1:0.5~4。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，所述两个组分摩尔比为：
β-胡萝卜素：海兔素=1:0.6~3。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，所述两个组分摩尔比为：
β-胡萝卜素：海兔素=1:2~3。
5.权利要求1至4中任一项所述组合物在制备预防和治疗酒精性肝病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酒精性肝病是指轻微酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝。
7.一种预防和治疗酒精性肝病的药物，包括权利要求1至4中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可以接受的辅料。
9.根据权利要求7或8所述的药物，其特征在于，所述药物为口服制剂，选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂和口服液中的一种。
10.权利要求7至9中任一项所述的药物的制备方法，包括将权利要求1至4中任一项所述组合物和药学上可以接受的辅料混合，按照常规的方法制备成临床上可以接受的制剂。
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| 海兔素对酒精性肝损伤大鼠Ｆａｓ／ＦａｓＬ及ＴＮＦ－α表达的影响;丰暖 等;《中国海洋药物》;20140430;第33卷(第2期);24-30 * |
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