CN104991060A - 一种白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域,特别是涉及一种白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明提供一种白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒,包括试纸卡,试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上包含胶体金标记的抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物,所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。本发明所提供的白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒兼具灵敏性和特异性,具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,特别是涉及一种白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。
背景技术
白色念珠菌(Canidia albicans)又称白假丝酵母菌,是一种条件致病菌,通常存在于正常人口腔,上呼吸道,肠道及阴道,一般在正常机体中数量少,不引起疾病,当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调,则易在局部大量生长繁殖,引起皮肤、黏膜甚至全身性白色念珠菌感染。白色念珠菌可引起女性的外阴及阴道炎症,主要表现为阴道分泌物粘稠、色黄或奶酪样斑片,外阴、阴道瘙痒或灼热感、豆渣样白带等临床症状。男性患者较少见,多经性接触传播,引发男性的念珠菌性龟头炎和包皮龟头炎。
近年来,念珠菌性阴道炎患病率居高不下,考虑与抗生素的滥用、避孕工具及卫生用品不洁、不当等因素有关。估计75%的妇女一生至少发生1次外阴阴道白色念珠菌病,5%~10%的妇女每年发生2次,我国各地感染率为0.65~39%不等,且白色念珠菌是阴道念珠菌病的主要病原体。真菌的临床耐药问题一直是国内外面临的重大问题之一,由于抗真菌药在临床上的大量使用或不规则应用,念珠菌耐药菌株也显著增加。
若病原菌不确定,治疗效果常不理想,复发率高,并可诱发耐药性及菌群失调,因此快速、灵敏、准确的鉴别诊断白色念珠菌对临床治疗十分重要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明采用以下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒,包括试纸卡,所述试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上包含胶体金标记的抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物,所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。
优选的,所述底板为PVC底板。
优选的,所述硝酸纤维素膜上,检测线位于离加样端较近一侧,质控线位于离加样端较远一侧。
优选的,所述检测线上包被有抗白色念珠菌单克隆抗体。
优选的,所述质控线上包被有羊抗兔IgG多克隆抗体。
优选的,所述抗白色念珠菌单克隆抗体为albicans antibody[6401](ab23368),所述羊抗兔IgG多克隆抗体购自MAXMED LABORATORIES INC.。
优选的,所述样品垫采用缓冲液处理,所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为50-100mM。
优选的,本发明所述的金标垫还经过预处理,预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为10-40mM。
更优选的,为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果,所述缓冲液还包括NaCl和冠醚,所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合,NaCl在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml。
更优选的,NaCl在缓冲液中的浓度为0.25-0.5mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为4-8mg/ml。
所述预处理缓冲液的溶剂为水。
所述预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡1.5~2h,取出放于36~38℃烘干。
所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
优选的,所述试剂盒还包括卡壳,所述卡壳包括背卡和上盖,所述背卡设有试纸卡卡槽,所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内,所述上盖设有测试窗和加样孔,所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合,所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
更优选的,所述卡壳为塑料卡壳。
优选的,所述检测试剂盒用于检测样品中的白色念珠菌抗原,所述样品可选自女性阴道分泌物。
本发明第二方面提供所述白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
1)用胶体金标记的抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物溶液喷涂金标垫,制得包含抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物的金标垫;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗白色念珠菌单克隆抗体及羊抗兔IgG多克隆抗体,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上,切裁制得检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
优选的,本发明所述的金标垫还经过预处理,预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为10-40mM。
更优选的,为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果,所述缓冲液还包括NaCl和冠醚,所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合,NaCl在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml。
更优选的,NaCl在缓冲液中的浓度为0.25-0.5mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为4-8mg/ml。
所述预处理缓冲液的溶剂为水。
所述预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡1.5~2h,取出放于36~38℃烘干。
所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
本发明第三方面提供所述白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒在白色念珠菌抗原检测领域的用途。
本发明的有益效果为:
本发明所提供的白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒兼具高灵敏性和高特异性,能够快速检测白色念珠菌抗原。此外,所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987 and periodic updates;the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODSIN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1 本发明试纸卡的制备
1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理,预处理缓冲液为:18-冠醚-66mg/ml氯化钠0.3mg/ml,甘氨酸2.0mg/ml的水溶液,pH=7.4,预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡2h,取出放于37℃烘干;然后用胶体金标记的抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物溶液喷涂经预处理的金标垫,制得包被抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物的金标垫,抗白色念珠菌抗体与兔IgG多克隆抗体的质量比为1:1(人抗白色念珠菌IgE抗体购自上海邦景实业有限公司,兔IgG多克隆抗体购自MAXMED LABORATORIES INC.),溶液中胶体金与复合物的质量比为5:1,溶液的浓度为10mg/ml,喷涂量为4ul/cm;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的albicansantibody[6401](ab23368)溶液和羊抗兔IgG多克隆抗体(购自MAXMED LABORATORIESINC.)溶液,喷涂量为1ul/cm,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上,切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
实施例2 对比试剂盒的制备
对比例试纸卡的制备:采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫,其他试剂及实验方法均同实施例1。
1)采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫,然后用胶体金标记的抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物溶液喷涂经预处理的金标垫,制得包被抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物的金标垫,抗白色念珠菌抗体与兔IgG多克隆抗体的质量比为1:1(人抗白色念珠菌IgE抗体购自上海邦景实业有限公司,兔IgG多克隆抗体购自MAXMEDLABORATORIES INC.),溶液中胶体金与复合物的质量比为5:1,溶液的浓度为10mg/ml,喷涂量为4ul/cm;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的albicansantibody[6401](ab23368)溶液和羊抗兔IgG多克隆抗体溶液,喷涂量为1ul/cm,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上,切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
实施例3 检测试剂盒的灵敏度实验
取实施例1、2制得的白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒,将试剂盒放置在水平台面上,分别检测0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml的白色念珠菌抗原标准品,每个浓度重复5次。用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中,在滴加样品后8-15分钟判读结果。
表1 试剂盒灵敏度结果
表1结果证实,本发明制得的白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒灵敏度≤0.03ng/ml,具有很高的灵敏度。进一步对实施例2的检测试剂盒进行灵敏度测试得知,实施例2的检测试剂盒灵敏度为≥5ng/ml。
实施例3
白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒与细菌培养对比实验:
试剂盒检测:
待测样品为女性阴道分泌物,使用10倍体积的0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释。
待测样品及试剂盒均平衡至室温开始检测,用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加3滴样本(约120-150ul)。15分钟时判读检测结果。
实验结果与细菌培养结果对比验证。白色念珠菌抗原检测试剂盒与阴道分泌物细菌培养结果如表2所示:
表2
实施例4
交叉实验:
在白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒分别滴加制备好的粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、克雷伯菌、乳酸杆菌、淋病奈瑟菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌、人型支原体、解脲脲原体、金黄色葡萄球菌、链球菌及幽门螺旋菌菌液(1×106CFU/ml),进行交叉实验检测,检测以上细菌是否对本试剂盒检测结果产生影响,白色念珠菌抗原胶体金检测试剂与细菌交叉实验结果如表3所示,各细菌交叉实验中均无交叉反应发生:
表3
交叉物 | 结果 | 交叉物 | 结果 |
粪肠球菌 | - | 淋病奈瑟菌 | - |
屎肠球菌 | - | 绿脓假单胞菌 | - |
大肠埃希菌 | - | 大肠杆菌 | - |
鲍曼不动杆菌 | - | 人型支原体 | - |
克雷伯菌 | - | 解脲脲原体 | - |
乳酸杆菌 | - | 金黄色葡萄球菌 | - |
幽门螺旋菌 | - | 链球菌 | - |
实施例4检测试剂盒的重复性和稳定性实验
一、试剂盒的批内和批间重复性实验
1.实验方法:
将同批和不同批次的白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒分别检测0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml的白色念珠菌抗原标准品,每个浓度重复5次,观察试剂盒的重复性。
2.实验结果:
经验证,白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒的批内和批间重复性为100%,假阳性率和假阴性率均为0。
二、试剂盒的稳定性实验
1.实验目的:
将白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒密封保存,并存放于4℃及室温(25℃左右)下,观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。
2.实验方法:
保存于4℃的试剂盒每周取出4盒,分别检测0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml的白色念珠菌抗原标准品;保存于室温(25℃)的试剂盒每3天取出4盒,分别检测0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml的白色念珠菌抗原标准品。
3.实验结果:
经验证,试纸盒在4℃下可保存21个月,在室温下可保存12个月;在可保存的期限内,试剂盒均可达到0.03ng/ml的检测灵敏度。
综上所述,本发明所提供的检测试剂盒具有且具有很好的灵敏性,阴性本底更低,有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种白色念珠菌抗原胶体金检测试剂盒,包括试纸卡,试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上包含胶体金标记的抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物,所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。
2.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述硝酸纤维素膜上,检测线位于离加样端较近一侧,质控线位于离加样端较远一侧。
3.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述检测线上包被有抗白色念珠菌单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,质控线上包被有羊抗兔IgG多克隆抗体。
5.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述样品垫采用缓冲液处理,所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为50~100mM。
6.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述金标垫采用缓冲液处理,所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为10~40mM。
7.根据权利要求6所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液中还包括NaCl和冠醚,所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合,冠醚在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml,NaCl在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml。
8.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,还包括卡壳,所述卡壳包括背卡和上盖,所述背卡设有试纸卡卡槽,所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内,所述上盖设有测试窗和加样孔,所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合,所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
9.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒用于检测样品中的白色念珠菌抗原。
10.根据权利要求1~9任一权利要求所述的胶体金检测试剂盒的制备方法,具体包括如下步骤:
1)用胶体金标记的抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物溶液喷涂经预处理的金标垫,制得包含抗白色念珠菌抗体、兔IgG多克隆抗体复合物的金标垫;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗白色念珠菌单克隆抗体及羊抗兔IgG多克隆抗体,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上,切裁制得检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
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