CN104990901A - 一种蛋白质快速荧光标记的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对蛋白质进行快速荧光标记的方法，制备GFP帽子探针，利用它能与融合在蛋白质loop上的小肽GFP10-11通过特异性非共价相互作用结合后产生绿色荧光的性质，实现对蛋白质快速、特异性的荧光标记和定量检测。本发明特异性高，且基本无背景荧光。GFP帽子探针本身基本不能被激发出荧光，只有GFP帽子探针与GFP10-11特异性结合后才能产生荧光；使用方便；激发波长峰值为482nm左右，发生波长峰值为507nm左右，与绿色荧光蛋白基本一致，可采用常规的荧光显微镜、荧光光谱仪检测。实现荧光标记时间的控制，标记浓度的控制。本发明还能标记细胞表面蛋白，实现对细胞表面蛋白的定量以及示踪，能够用于筛选与细胞表面蛋白内化、多聚化等相关的药物。

Description

一种蛋白质快速荧光标记的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术，具体是一种蛋白质快速荧光标记的方法。

背景技术

活细胞水平上对目的蛋白质的荧光标记是研究目的蛋白质活动和特性的重要手段，GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)及其衍生物被广泛的应用于活细胞荧光显微成像。通常采取的策略是将全长的GFP融合到目的蛋白质的N-末端或者C-末端，以达到引入荧光标记的目的。但是对于很多特定的蛋白质而言，GFP融合于其中往往会导致其结构和功能遭到破坏或者GFP本身难以正确折叠，从而影响了对目的蛋白的研究。另一方面，通过将全长的GFP融合于目的蛋白引入荧光标记，GFP往往需要一个成熟的过程，这影响了对目的蛋白的实时监测。

Split-GFP是将GFP切开后分别融合于目的蛋白，利用GFP分开部分能自发结合的性质从而引入荧光标记。目前对于split-GFP的应用主要是将超折叠GFP上的末端的一条β-strand切下，或者借助circular permutation的手段将另外10条β-strand中的一条切下，然后融合表达在所要研究的目标蛋白的C-末端，通过加入体外制备的GFP1-10而引入荧光，以此来尽量的减小荧光标记对所研究系统的干扰。这限制了荧光标记的位置只能是目的蛋白的N-末端或者C-末端。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可在蛋白质任何一个loop区中引入荧光标记的蛋白质快速荧光标记的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种对蛋白质进行快速荧光标记的方法，将一段能与GFP帽子探针特异性结合的小肽GFP10-11融合于目的蛋白的loop区中，融合表达后加入体外制备的可溶的GFP帽子探针，GFP帽子探针即为GFP1-9探针，通过GFP1-9探针与小肽GFP10-11非共价作用特异性结合；结合后产生荧光，从而引入荧光标记，小肽GFP10-11的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

作为本发明进一步的方案：所述GFP1-9探针的制备方法：GFP1-9探针是由氨基酸序列如序列表中的序列1所示的绿色荧光蛋白经过分子生物学酶酶切而制备得到，酶切后得到的GFP1-9探针的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。

作为本发明进一步的方案：还能用于在细胞表面对蛋白质进行快速荧光标记。

作为本发明进一步的方案：用于细胞表面蛋白的表达水平的定量，用于示踪细胞表面蛋白的内化和多聚化，用于筛选细胞表面蛋白内化和多聚化相关的药物。

作为本发明进一步的方案：所述序列还包括其衍生和/或突变序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开了该荧光标记的方法，GFP1-9探针的制备方法，以及在溶液和细胞中的一般蛋白质荧光标记的方法。该荧光标记方法的特点有：(1)特异性高，且基本无背景荧光。GFP1-9探针本身基本不能被激发出荧光，只有GFP1-9探针与GFP10-11特异性结合后才能产生荧光；(2)使用方便，标记前后不需要反复洗掉多余探针，只需直接加入即可，而且可在一般的盐溶液中反应，无需特殊条件；(3)结合速度快，10min内可完成结合并可激发出荧光，能够实现快速的标记；(4)其激发波长峰值为482nm左右，发生波长峰值为507nm左右，与绿色荧光蛋白(GFP)基本一致，可采用常规的荧光显微镜、荧光光谱仪检测。可以实现荧光标记时间的控制，标记浓度的控制，而且，该荧光标记方法可以尽可能的减小对目的蛋白结构和功能的影响。该方法另一大优势是可特异性的标记细胞表面蛋白，实现对细胞表面蛋白的定量以及示踪。

附图说明

图1是本发明的探针用于在泛素中引入荧光标记的荧光光谱图；

图2是本发明的标记方法应用于一种G蛋白偶联受体GPR17的细胞外区域引入荧光标记图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

该标记方法在溶液中可溶性蛋白质上的应用

a、在大肠杆菌中表达的绿色荧光蛋白如序列表中的序列1所示；表达菌种：BL21*(DE3)，载体：pET-15b。在37℃摇至0D＝0.8，加入1mM IPTG，37℃诱导4h。高速离心收菌；

b、用Ni A缓冲液重悬菌体后高压裂菌，，其中Ni A缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷(简称为Tris)与200mM NaCl，pH为8.0。高速离心收集上清，过Ni柱，以60mL到200mM咪唑梯度洗脱。收集组分用超滤管浓缩换Ni A缓冲液至Q A缓冲液，其中Q A缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷，pH为8.0。过GE公司的Source Q柱，梯度80mL→30％Q B缓冲液，其中Q B缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷与1M NaCl，且其pH为8.0；收集对应组分；

c、过完Source Q柱后的样品脱盐至GE公司的苯甲脒亲和层析柱中的上样缓冲液，其中上样缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷与500mM NaCl，其pH为7.4；即胰酶酶切缓冲液。50μM的sfGFP样品加入10U/mL的胰酶酶切缓冲液，在37℃下酶切0.5h。过苯甲脒亲和层析柱，收集流出液，用超滤管换成Q A缓冲液，其中Q A缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷，且其pH为8.0。过Source Q柱，梯度60mL→20％Q B缓冲液，其中Q B缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷与1M NaCl，且pH为8.0；收集洗脱组分，加入盐酸胍固体至盐酸胍在溶液中的终浓度为4M，在4℃下放置2h，过分子筛S100色谱柱，其中分子筛S100色谱柱的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、300mM NaCl与3M GdHCl，且pH为8.0；收集组分，浓缩至约5mL，过夜透析，过夜透析时的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM NaCl与体积分数为10％的甘油，且pH为8.0；过分子筛S100色谱柱，其中分子筛S100色谱柱的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM NaCl与质量分数为10％的甘油，且pH为8.0；得到GFP1-9，收集后浓缩，分装保存；

d、GFP10-11在泛素中的插入：通过聚合酶链式反应在泛素的Leu8和Lys9两个氨基酸之间插入小肽GFP10-11对应的DNA序列，所得到得质粒对应表达的蛋白为ub/GFP10-11；

e、在大肠杆菌BL21*(DE3)中表达ub/GFP10-11，依次用阳离子交换柱Fast Flow S和分子筛S100色谱柱提纯，得到ub/GFP10-11，向ub/GFP10-11溶液中加入GFP1-9，数分钟后用荧光光谱仪观察标记结果。

结果如图1所示，本发明的探针用于在泛素中引入荧光标记，其中A图显示通过此种方法引入荧光标记其荧光基团的吸收光谱性质与GFP基本一致；B图显示通过此种方法引入荧光标记其荧光基团的荧光发射光谱性质与GFP基本一致；C图显示此方法可在10min内完成荧光标记。

实施例2

该标记方法在细胞水平细胞膜表面蛋白质上的应用

a、在大肠杆菌中表达的绿色荧光蛋白如序列表中的序列1所示；表达菌种：BL21*(DE3)，载体：pET-15b。在37℃摇至0D＝0.8，加入0.5mM IPTG，19℃诱导20h。高速离心收菌；

b、用Ni A缓冲液重悬菌体后高压裂菌，其中Ni A缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷(简称为Tris)与200mM NaCl，pH为8.0。高速离心收集上清，过Ni柱，先以20mM咪唑即10％Ni B缓冲液冲洗，再用200mM咪唑即40％Ni B缓冲液洗脱，其中Ni B缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷(简称为Tris)，200mM NaCl，500mM咪唑，pH为8.0。收集组分浓缩至约6mL，脱盐至Q A缓冲液，其中Q A缓冲液是20mM三羟甲基氨基甲烷，且其pH为8.0，过Source Q柱，梯度60mL→20％Q B缓冲液，其中Q B缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷与1M NaCl，且pH为8.0；跑胶鉴定后收集对应组分；

c、过完Source Q柱后的样品脱盐至苯甲脒亲和层析柱中的上样缓冲液，也即胰酶酶切缓冲液，50μM的sfGFP样品加入1U/mL的胰酶，在28℃下酶切0.5h。过苯甲脒亲和层析柱，收集流出液，用超滤管浓缩并换成Q A缓冲液，其中Q A缓冲液是20mM三羟甲基氨基甲烷，且其pH为8.0；过Source Q柱，梯度60mL→20％Q B缓冲液，其中Q B缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷与1M NaCl，且其pH为8.0；收集洗脱组分，加入盐酸胍固体至盐酸胍在溶液中的终浓度为4M，在4℃下放置2h，过分子筛S100色谱柱，其中分子筛S100色谱柱的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、300mM NaCl与3M GdHCl，且pH为8.0；收集组分，浓缩至约5mL，过夜透析，其中过夜透析的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM NaCl与体积分数为10％的甘油，且pH为8.0；过分子筛S100色谱柱，其中分子筛S100色谱柱的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM NaCl与体积分数为10％的甘油，且pH为8.0；得到GFP1-9，收集后浓缩，分装保存；

d、GFP10-11在GPR17的插入：通过聚合酶链式反应在GPR17的loop3区的R291位氨基酸对应的碱基序列后插入小肽GFP10-11对应的DNA序列，所得到的质粒对应表达的蛋白为GPR17R291/GFP10-11；

e、转染用于表达GPR17R291/GFP10-11的质粒到HEK293细胞，表达后，加入GFP1-9，孵育20min后在荧光显微镜下观察，发现实现细胞表面特异性标记。

结果如图2所示，通过本发明的标记方法，可以对GPR17的细胞外区域实现特异性的荧光标记。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种对蛋白质进行快速荧光标记的方法，其特征在于，将一段能与GFP帽子探针特异性结合的小肽GFP10-11融合于目的蛋白的loop区中，融合表达后加入体外制备的可溶的GFP帽子探针，GFP帽子探针即为GFP1-9探针，通过GFP1-9探针与小肽GFP10-11非共价作用特异性结合；结合后产生荧光，从而引入荧光标记，小肽GFP10-11的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

2.根据权利要求1所述的对蛋白质进行快速荧光标记的方法，其特征在于，所述GFP1-9探针的制备方法：GFP1-9探针是由氨基酸序列如序列表中的序列1所示的绿色荧光蛋白经过分子生物学酶酶切而制备得到，酶切后得到的GFP1-9探针的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。

3.根据权利要求1所述的对蛋白质进行快速荧光标记的方法，其特征在于，还能用于在细胞表面对蛋白质进行快速荧光标记。

4.根据权利要求1-3任一所述的对蛋白质进行快速荧光标记的方法，其特征在于，用于细胞表面蛋白的表达水平的定量，用于示踪细胞表面蛋白的内化和多聚化，用于筛选细胞表面蛋白内化和多聚化相关的药物。

5.根据权利要求1-3任一所述的对蛋白质进行快速荧光标记的方法，其特征在于，所述序列还包括其衍生和/或突变序列。