CN104981696B - 诊断和治疗前列腺癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用抑制可溶性腺苷酸环化酶(sAC)蛋白活性的物质来抑制前列腺癌细胞增殖的方法。本发明还涉及通过评估对象的sAC基因或蛋白的表达来诊断和预后对象前列腺癌的方法。

Description

诊断和治疗前列腺癌的方法
关于联邦政府资助的研究与开发的声明
本发明是根据国家癌症研究所(NCI)授予的基金号NCI K08 CA 160657由政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。
电子提交材料的参考并入
全部并入本文作为参考的是同期提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，所述序列表确认如下：一份生成于2013年12月11日，命名为“715739_ST25.TXT”的4,225字节ASCII(文本)文件。
背景技术
前列腺癌是最为常见的恶性疾病，是第二大导致美国男性死亡的疾病(Li等,Biochim.Biophys.Acta,1704:87-102(2004))。国家癌症研究所(NCI)估计，2013年美国诊断出超过230,000例的新增前列腺癌病例，并且超过29,000名男性将死于前列腺癌。前列腺特异性抗原或PSA测试依然被广泛应用于前列腺癌早期检测。虽然PSA测试检测出无症状男性中所患有的大部分前列腺癌((Mettlin等,Cancer,83(8):1679-1684(1998a)；Mettlin等,Cancer,82(2):249-251(1998b)；Humphrey等,J.Urol.,155:816-820(1996)；和Grossfeld等,Epidemiol.Rev.,23(1):173-180(2001))，但是PSA检测的特异度较差，当PSA截止值被设为2.6ng/mL时，特异度将低至33％(Thompson等,N.Engl.J.Med.,350:2239-2246(2004))，虽然灵敏度可高达83％。PSA检测特异度差的直接原因是其他前列腺疾病如良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎中PSA分泌的增加。因此，PSA水平升高指示需要进行额外筛查，所述筛查通常以穿刺活检的形式进行。最终，穿刺活检的结果决定前列腺癌的诊断。每年有超过一百万例前列腺的穿刺活检，每例活检成本约为1500美元，并且还会引起患者的不适。然而其中只有不到二十万名被诊断为前列腺癌。因此，大部分穿刺活检是不必要的。
目前，临床上有许多诊断标志物被用于区分良性前列腺组织与恶性前列腺组织，所述标志物包括例如α-甲基酰基-辅酶A消旋酶(AMACR，p504s)(Zhou等,Amer.J.SurgicalPathology,27(6):772–778(2003))和TMPRSS2-ERG融合基因(Yu等,Cancer Cell,17(5):443–54(2010))。但是这些标志物缺乏进行持续可靠诊断所需的特异度。相似地，预后(prognostic)标志物(如TMPRSS2-ERG融合基因、PTEN缺失以及SPINK1过表达)也在评估各种前列腺癌时缺乏特异度，导致相当数量的前列腺癌除了计算癌症格里森评分外没有更进一步的预后信息。目前还没有已知的生物标记物可以指示已经侵袭进入前列腺周围软组织的前列腺癌。
因此，有必要采用非侵入式方法对前列腺癌进行诊断与预后，并改善前列腺癌的治疗方法。本发明提供了这种方法。
发明概述
本发明提供了一种抑制前列腺癌细胞增殖的方法，所述方法包括使前列腺癌细胞与抑制可溶性腺苷酸环化酶(sAC)蛋白活性的物质接触，从而使前列腺癌细胞的增殖受到抑制。
本发明还提供了一种诊断男性对象前列腺癌的方法，所述方法包括：(a)从男性对象的前列腺获取细胞样品，(b)分析所述样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成，以及(c)将样品中sAC基因表达水平或sAC蛋白生成水平与对照进行比较，其中与所述对照相比，所述样品中sAC基因或sAC蛋白的过量表达指示所述男性对象患有前列腺癌。
本发明提供了一种为前列腺癌对象选择治疗方案的方法，所述方法包括：(a)从前列腺癌对象获取前列腺癌细胞样品，(b)检测所述样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成，(c)将所述样品中sAC基因或蛋白表达的水平与对照进行比较，(d)根据(c)的比较来预后所述对象的前列腺癌，(e)根据(d)中对所述对象的预后来选择对象的治疗方案，以及(f)向所述对象提供所述治疗方案。
附图概述
图1A显示了使用如下未经处理细胞系的裂解液进行sAC表达的蛋白印迹分析的数据：PNT2、PC3和LNCaP。图1B显示了在PC3与LNCaP细胞系中使用R40抗体(只识别“睾丸型”sAC同种型)和R21抗体(识别sAC“睾丸型”和“躯体型”同种型)进行sAC同种型特异性蛋白印迹分析获得的数据。
图2显示了sAC抑制剂KH7对前列腺癌细胞增殖的效果实验数据。KH7处理后24小时对细胞cAMP含量和每皿的细胞数量(起始密度：150,000个细胞/皿)进行统计分析。值为平均值±SEM(N＝5-8)。*相比0μmol/L KH7，P<0.05。
图3A显示了使用sAC特异性或乱序(scrambled)的siRNA处理72小时后(左图)或使用sAC特异性或乱序(scrambled)shRNA处理72小时后(右图)，使用LNCaP细胞裂解液进行蛋白印迹分析的数据。图3B-D显示了siRNA或shRNA转染对细胞增殖的影响(图3B)，细胞培养液中LDH活性(相对单位(r.u.))(图3C)与半胱天冬酶-3切割(图3D)的实验数据。值为平均值±S.E.(N＝5-6)，*：相比对照或乱序P<0.05。蛋白印迹数据代表了具有相似结果的五个独立实验。
图4A-4F显示的实验数据说明了抑制或敲减sAC诱导细胞周期停滞在G2期。图4A-4C显示了使用流式细胞仪对对照LNCaP细胞、使用sAC抑制剂KH7(20mol/L)或非活性类似物KH7.15(20mol/L)处理24小时的细胞或者转染sAC-特异性siRNA或乱序siRNA的细胞进行细胞周期统计分析。图4D包括的图和图像分别显示了LNCaP细胞使用sAC抑制剂KH7处理48小时后G2期细胞群和半胱天冬酶-3切割的时间进程。值为平均值±S.E.(n＝8-10)，*：相比对照或乱序siRNA P<0.05。图4E和4F显示了使用对照LNCaP细胞、或者用KH7处理24小时的细胞或sAC敲减(siRNA)的细胞的裂解液，对控制细胞周期进程通过G2/M期和G1/S期检测点的蛋白进行的蛋白印迹分析。处理条件与图4A-4D中描述的条件类似。所有的蛋白印迹数据代表三到五个具有相似结果的独立实验。
图5A-5E显示的实验数据表明sAC以PKA非依赖性和EPAC依赖性的方式来控制增殖和细胞周期。图5A-5C的图显示了每皿细胞数量的统计分析(图5A)、细胞培养基中的LDH活性(相对单位(r.u.))(图5B)以及G2期细胞群(图5C)。处理(全部均为24小时)如下：20mol/LKH7，20mol/L KH7.15，100mol/L 8-pCPT-cAMP(8-pCPT)，100mol/L N 6-苯甲酰基-cAMP(6-Bnz)，3mol/L H-89，或100mol/L(Rp)-cAMP-S(RpcAMP)。值为平均值±S.E.(n＝8-11)，*：相比对照P<0.05；#：相比KH7P<0.05。图5D和5E显示了使用LNCaP细胞裂解液对Rap1(Rap1-GTP)的活性形式和B-Raf的磷酸化形式进行蛋白印迹分析。处理条件与图5A-5C描述的条件类似。处理进行18小时。所有的蛋白印迹数据代表四到六个具有类似结果的独立实验。
具体实施方式
本发明提供了基于可溶性腺苷酸环化酶(sAC)蛋白的表达来抑制前列腺癌细胞增殖、诊断前列腺癌、以及为前列腺癌患者选择治疗方案的方法。sAC是参与环AMP(cAMP)生成的可溶性信号酶(见，例如国际专利申请公开版WO2001/085753和美国专利6,544,768)。sAC的表达已在角质形成细胞、黑素细胞、单核细胞、小汗腺管和人类皮肤神经(Zippin等，J.Invest.Dermatol.,130:1279-1287(2010年))、以及身体的其他区域中发现。cAMP介导细胞对营养条件和细胞外信号的应答，并且早已知道cAMP对细胞生长和增殖会产生刺激效果和抑制效果(Dumont等,Trends Biochem.Sci.,14:67-71(1989)；和Rozengurt等,Science,234:161-166(1986))。
cAMP依赖性信号传导已经被显示在控制细胞增殖和凋亡的数个信号传导途径中发挥作用；然而，还没有很好地确定cAMP信号对增殖和凋亡的特异性效果。例如，通过刺激G蛋白响应的跨膜腺苷酸环化酶(tmAC)或使用cAMP类似物处理来增加细胞内cAMP的含量已在不同细胞类型中显示能诱导或抑制增殖(参见，例如Hochbaum等,J.Biol.Chem.,283:4464-4468(2008)；Misra和Pizzo,J.Cell.Biochem.,108:998-1011(2009)；Hewer等,J.Mol.Cell.Cardiol.,50:87-98(2011)；和Lucchi等,PLoS One,6:e20785(2011))。类似地，已经报道了cAMP信号传导对凋亡的多种影响(见，例如Leone等,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,293:G673-681(2007)；Rudolph等,J.Biol.Chem.,279:14828-14834(2004)；Smith等,Blood,105:308-316(2005)；以及Zhang和Insel,J.Biol.Chem.,279:20858-20865(2004))。这些差异可能是由于细胞类型或实验模型的差异，或者由于tmAC依赖性信号缺乏特异性。
sAC依赖的cAMP在调控细胞增殖中的作用尚不清楚。除了在胞质中有定位，sAC也存在于细胞核中，在那里其通过蛋白激酶A(PKA)依赖性磷酸化来控制核cAMP反应元件结合蛋白(CREB)转录因子的活性(见，例如Zippin等,FASEB J.,17:82-84(2003))。最近的研究还表明当角质形成细胞和黑素细胞从良性细胞转变为癌(如皮肤鳞状细胞癌和黑色素瘤)时，sAC从细胞质向细胞核迁移(见，例如，Zippin等,J.Invest.Dermatol.,130:1279-1287(2010)；和Magro等,Arch.Dermatol.,148:335-344(2012))。
在一个实施方式中，本发明提供了抑制前列腺癌细胞增殖的方法，所述方法包括使前列腺癌细胞与抑制可溶性腺苷酸环化酶(sAC)蛋白活性的物质接触。术语“前列腺癌”与术语“前列腺肿瘤(carcinoma)”为同义词，指前列腺组织中形成的癌症。“前列腺癌细胞”指从前列腺癌中获得或衍生的细胞。在另一个实施方式中，抑制sAC蛋白活性的物质可用于抑制增生性前列腺细胞增殖而非恶性前列腺细胞增殖，例如，高度前列腺上皮内瘤(HGPIN)或良性前列腺增生(BPH)，也被称为良性前列腺肿大(BEP)，腺纤维肌瘤性增生及良性前列腺肥大。
所述前列腺癌细胞可以处于任何等级或阶段，其由组织病理学和格里森评分(下文讨论)进行测定，和/或根据如Edge等(编),美国癌症联合委员会(AJCC)分级手册(American Joint Committee on Cancer(AJCC)Staging Manual),第7版(2010)或SEER程序编码和分级手册(SEER Program Coding and Staging Manual),NIH出版，第13-5581号,美国卫生与公众服务部国立癌症研究所(U.S.Department of Health and HumanServices National Cancer Institute)(2013)所述的标准确定。
前列腺癌细胞可与任何合适的抑制可溶性腺苷酸环化酶(sAC)蛋白活性的物质接触。此类物质在本申请中也被称为“sAC抑制剂”。例如，sAC抑制剂可以是任何腺苷酸环化酶抑制剂，其中多种为本领域已知并且可从商业来源获得，例如西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯)。在一个实施方式中，抑制sAC活性的物质是小分子。术语“小分子”是指非生物(即非蛋白、非核酸)物质或化合物，分子量小于约1,000g/mol。腺苷酸环化酶的小分子抑制剂包括，例如环戊基腺嘌呤单甲基磺酸盐(C4479)，2',5'-二脱氧腺苷(D7408)，2',5'-二脱氧腺苷3'-三磷酸四钠盐(D0939)，顺式-N-(2-苯基环戊基)-硫唑嘌呤环十三碳醛-1-烯-2-胺盐酸盐(MDL-12,330A盐酸盐或M182)，2'/3'-O-(N-甲基邻氨基苯甲酰)鸟苷-5'-(γ-硫代)三磷酸三乙基铵盐溶液(M6317)，和(E)-2-(1H-苯并[d]咪唑-2-基硫基)-N'-(5-溴-2-羟基苯亚甲基)丙酰肼(KH7)。优选抑制sAC蛋白活性的小分子是(E)-2-(1H-苯并[d]咪唑-2-基硫代)-N’-(5-溴-2-羟基苯亚甲基)丙酰肼(KH7)。
在另一个实施方式中，抑制sAC活性的物质是干扰RNA分子。RNA干扰(RNAi)指RNA分子通常通过破坏特异mRNA分子来抑制基因表达的生物学方式。所述RNAi分子可以是小干扰RNA(siRNA)、短发夹miRNA(shMIR)、微小RNA(miRNA)或反义核酸。在一个实施方式中，sAC抑制剂优选是专门靶向sAC蛋白的编码基因的siRNA。RNAi分子可以使用本领域中任何己知的合适方法产生(见，例如Seyhan等,RNA,11(5):837-846(2005)；Huang等,Nat.Biotechnol.,31(4):350-356(2013)；Sui等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:5515-20(2002)；Brummelkamp等,Science,296:550-3(2002)；Paul等,Nature Biotechnology,20:505-8(2002)；Lee等,Nature Biotechnology,20:500-5(2002)；以及Castanotto等,RNA,8:1454-60(2002))。
在一个优选实施方式中，通过直接对男性前列腺癌对象给予sAC抑制剂，使前列腺癌细胞与抑制sAC蛋白活性的物质接触。当sAC抑制剂是RNAi分子时，所述RNAi分子可以通过载体给予男性前列腺癌对象。所述载体可以是，例如质粒、粘粒、病毒载体(例如逆转录病毒或腺病毒)或噬菌体。合适的载体和载体的制备方法是本领域熟知的(见，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第四版,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约州冷泉港，2012))。sAC抑制剂，或编码该sAC抑制剂的载体，优选存在于组合物中。优选地，该组合物是药学上可接受(如生理学上可接受)的组合物，所述组合物包含运载体，优选药学上可接受(如生理学上可接受)的运载体，和sAC抑制剂或编码该sAC抑制剂的载体。可在本发明的上下文中使用任何合适的运载体，并且此类运载体是本领域中熟知的。运载体的选择将部分根据所述组合物的具体给予位点和用于给予所述组合物的具体方法来确定。所述组合物可以是无菌的。所述组合物可以被冷冻或冻干以用于储存，并且在使用前重构于适当的无菌运载体中。所述组合物可以根据下面文献中所描述的常规技术来生成：例如雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy),第21版,利平科特威廉姆斯&威尔金斯公司(LippincottWilliams&Wilkins),宾夕法尼亚州费城(2001)。
包含sAC抑制剂的组合物可以使用标准的给药技术给予男性前列腺癌对象，所述给药技术包括口服、静脉内、腹腔、皮下、肺、经皮、肌肉、鼻内、颊、舌下或栓剂给药。所述组合物优选适合于肠胃外给药。本申请所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠和腹膜内给药。更优选地，所述组合物通过经由静脉内、腹膜内或皮下注射的外周系统递送给予哺乳动物。
一旦给予男性前列腺癌对象，所述sAC抑制剂抑制前列腺癌细胞的增殖。在这方面，sAC抑制剂在男性前列腺癌对象中产生治疗效果并治疗前列腺癌。本申请所用术语“疗法”、“治疗”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。优选地，所述效果是治疗性的，即所述效果部分或完全治愈疾病和/或该疾病造成的不利症状。为此，本发明的方法包括给予“治疗有效量”的抑制sAC蛋白活性的物质。“治疗有效量”是指为了获得期望的治疗结果，在剂量和必需的时间段上有效的量。治疗有效量可根据因素而变化，所述因素例如个体的疾病状态、年龄、体重以及sAC抑制剂在个体中引发期望的应答的能力。例如，本发明中sAC抑制剂的治疗有效量是指在人体中降低sAC蛋白生物活性的量。
sAC抑制剂可以单独给予或与其它前列腺癌的治疗或药物(例如作为佐剂)组合给予。在这方面，sAC抑制剂可以与，例如主动监测、外科手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗、生物治疗、二磷酸盐治疗、单克隆抗体治疗、冷冻手术、高强度聚焦超声、和/或质子束放射治疗组合使用。
本发明还提供了在男性对象中诊断前列腺癌的方法。所述方法包括：(a)从男性对象的前列腺获取细胞样品，(b)分析所述样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成，以及(c)将样品中sAC基因表达水平或sAC蛋白生成水平与对照进行比较，其中与所述对照相比，所述样品中sAC基因的过量表达或sAC蛋白的过量生成指示所述男性对象患有前列腺癌。细胞样品优选通过组织活检、手术切除(例如，通过根治性前列腺切除)或细针抽吸(FNA)来获得。如本申请所使用，“样品”或“组织活检”指的是从用于诊断分析的对象取走的生物标本。“细针抽吸”是通过将细的中空的针插入到包块中以进行细胞取样，用以调查浅表肿块或包块的诊断过程。通常，所述样品包含含有或怀疑含有过度增殖细胞的前列腺区域的组织活检切片。所述样品可以通过经直肠或经会阴针刺活检得到。通常，样品将经由福尔马林固定和/或石蜡包埋以便于操作。
细胞样品中sAC基因表达的存在与否可以通过任何合适的测量基因表达的方法来确定与评估(例如测定)。此类方法在本领域已知，包括例如PCR、定量RT-PCR、实时PCR、RNA扩增、原位杂交、核酸微阵列、基因表达系列分析(SAGE)(Velculescu等，Science,270:484-487(1995))和核酸印迹杂交。
细胞样品中sAC蛋白生成与否可以使用任何合适的蛋白质检测方法来确定与评估(例如测定)。此类方法是本领域已知的，包括例如ELISA、放射免疫测定(RIA)、FACS、免疫组织化学、免疫细胞化学和蛋白印迹杂交。在一个实施方式中，样品用免疫组织化学通过针对sAC的抗体对样品进行染色，来测定sAC蛋白的表达。本申请所用的术语“染色”或“免疫染色”是指(i)使sAC蛋白特异性抗体在细胞外或细胞内与怀疑含有sAC蛋白的样品在某种条件下接触，所述条件是所述抗体与样品中的蛋白之间可以形成稳定的抗原-抗体复合物的条件，和(ii)使用本领域中已知的任何合适方法来检测步骤(i)中形成在的任何抗原-抗体复合物，其中检测到复合物指示sAC蛋白存在于样品中。
定向针对sAC的抗体(即“抗sAC抗体”)可以是任何抗体，或结合至sAC的抗原结合片段。抗sAC抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或结合sAC的Fab片段。例如，抗sAC抗体可以是定向针对单一sAC表位的单克隆抗体、定向针对单一sAC抗原组分的不同表位的单克隆抗体的组合、定向针对不同sAC抗原组分的表位的单克隆抗体、定向针对同一sAC抗原的多克隆抗体、或定向针对不同sAC抗原的多克隆抗体。
抗体可以靶向sAC任意剪切体的任意表位。sAC有数个剪切体，包括48kDa的剪切体和187kDa的剪切体(参见，Buck等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:79-84(1999)；和Jaiswal等,J.Biol.Chem.,276:31698-31708(2001))。也可以存在其他的剪切体。全长sAC(sACfl)和截短sAC(sACt)的氨基酸序列在美国专利申请公开2013/0065246中已披露。针对sAC的抗体或其抗原结合片段可以使用任何合适的方法来制备。例如，多克隆抗体可以使用sAC多肽或其衍生物(如片段或融合蛋白)通过免疫(如注射)宿主动物来制备。单克隆抗体可以使用杂交瘤法(见，例如Kohler和Milstein,Nature,256:495-497(1975))、三源杂交瘤法、人类B细胞杂交瘤法(见，例如Kozbor等,Immunol.Today,4:72(1983)；和Cote等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026-2030(1983))、EBV杂交瘤技术(参见，如Cole等,单克隆抗体和肿瘤治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中的“EBV杂交瘤技术及其在人肺癌中的应用(The EBV-hybridoma technique and its application to humanlung cancer)”,艾伦R利斯公司(Alan R.Liss,Inc.),第77-96页(1985))、或通过CDR移植(见，例如美国专利5,585,089、5,693,761、5,693,762和5,225,539)来制备。可以例如通过将sAC多肽特异性小鼠抗体基因与具有适当生物活性的人类抗体基因进行剪接来制备嵌合抗体，(Morrison等,J.Bacteria,159:870(1984)；Neuberger等,Nature,312:604-608(1984)；和Takeda等,Nature,314:452-454(1985))。单链抗体可以使用如美国专利5,476,786、5,132,405,和4,946,778中披露的方法来制备。
结合sAC蛋白的抗体片段可以使用本领域中已知的任何合适技术生成。抗体片段的示例包括但不限于，F(ab')2片段，所述F(ab')2段可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生，Fab'片段，所述Fab'片段可通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生，以及Fab片段，所述Fab片段可通过木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体产生。
检测针对sAC的抗体，如结合样品中sAC的抗体，以便获得或辨别sAC染色模式。针对sAC抗体的检测可以通过任何合适的技术来完成，所述技术包括但不限于酶介导(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等)技术或荧光基团介导(例如FITC、TRITC、AMCA等)技术。在一个实施方式中，抗体结合是通过检测sAC抗体的标记来检测的。在另一个实施方式中，初级抗体是通过检测二级抗体或与一级抗体结合的试剂而进行来检测，其中，在进一步的实施方式中，二级抗体被标记并进行检测。
可以使用任何合适的标记以获得或辨别sAC染色模式。合适的标记包括但不限于，基于酶、荧光、化学发光、放射性和染料分子。其它试剂和材料可用于获得或辨别sAC染色模式，如将石蜡包埋样品进行脱蜡的脱蜡组分、预处理和封闭试剂、扩增试剂、洗涤缓冲液、封闭试剂、和共染色试剂。
几种抗sAC抗体已经确定，包括例如R5、R6.2、R7、R14、R21、R33、R37、R40、R41、R47.1、R52、R53、R54和R59(参见例如Kamenetsky,“哺乳动物具有多种不同的受调控的cAMP信号转导级联反应(Mammalian Cells Possess Multiple,Distinctly Regulated cAMPSignaling Cascades)”博士论文，康奈尔大学威尔医学院(Weill Medical College ofCornell University)，公开号AAT3251733[ProQuest Document ID 1276395511](2006))。这些抗体的靶向sAC的表位在SEQ ID NOS：1-8中提供。优选的抗体包括R21抗体，所述R21抗体是一种定向针对人sACfl蛋白的203-216位氨基酸的小鼠单克隆抗体(Zippin等,J.Invest.Dermatol.,130(5):1279-1287(2010))，R40抗体以及R52抗体，所述R52抗体能与包含SEQ ID NO：9的表位结合。
相比于对照组，男性对象样品中sAC基因或蛋白的过量表达指示男性对象患有前列腺癌。当sAC基因的表达高于正常水平或sAC蛋白的生成高于正常水平时，分别为sAC基因“过量表达”或sAC蛋白质“过量生成”。sAC基因的正常表达或sAC蛋白的正常生成分别是在非患病对象或者在怀疑患有前列腺癌的男性患者的非患病组织中，sAC基因的表达或sAC蛋白的生成。
sAC基因的过量表达或sAC蛋白的过量生成可以通过分别比较样品与对照(例如阳性或阴性对照)中sAC基因表达或sAC蛋白生成的水平进行检测。对照可以通过例如在已知前列腺癌或相关病症为阴性的人类对象或样品，或在怀疑患有前列腺癌的男性对象的非疾病组织(阴性对照)，或者是在已知前列腺癌或相关病症为阳性的人类对象或样品(阳性对照)中，测量sAC基因表达的水平或sAC蛋白的生成。对照还可以通过由任何合适的制备方法由预先确定的标准来提供(例如从已知前列腺癌或相关病症是阳性或阴性的对象群体中得到的sAC基因的表达状况或sAC蛋白的生成状况)。当与阴性对照比较sAC基因的表达或sAC蛋白的生成时，过量表达或过量生成可分别定义为表达或生成水平分别比对照的表达或生成水平高出任意倍数(例如，相比于阴性对照的1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍，甚至更高的表达)。
本发明还提供了为前列腺癌对象选择治疗方案的方法。该方法包括(a)从前列腺癌对象获取前列腺癌细胞样品，(b)检测所述样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成，(c)将所述样品中sAC基因表达水平或sAC的蛋白生成水平与对照进行比较，(d)根据(c)的对比结果预后所述对象的前列腺癌，(e)根据(d)中对所述对象所做的预后选择对象的治疗方案，以及(f)向所述对象提供所述治疗方案。上述与本发明其它实施方式有关的前列腺癌细胞样品和测定sAC基因表达及sAC蛋白生成的描述，也适用于上述为前列腺癌对象选择治疗方案的方法的相同的方面。
本文所使用的术语“预后”，是指预测患者病情的结果。在为前列腺癌患者选择治疗方案的发明方法的上下文中，对照可以通过例如在已知各阶段前列腺癌为阳性的人类对象集合中测量sAC基因的表达或sAC蛋白的生成来提供。对照也可以通过任何合适的制备方法、由在各前列腺癌阶段中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成的预先确定的标准来提供(如已知不同阶段的前列腺癌为阳性的对象群体中获得的sAC基因的表达状况或sAC蛋白的生成状况)。在这种方式中，临床医生可以将前列腺癌对象的样品与多个不同的前列腺癌阶段进行比较，以便更准确地确定前列腺癌对象疾病的阶段和侵袭性。
所述发明性方法中的预后前列腺癌进一步包括计算前列腺癌细胞样品的格里森(Gleason)评分。格里森评分(或格里森分级系统)基于病理学来分级前列腺癌。较高的格里森评分指示癌症的侵袭性更强并且预后性更差。确定格里森评分首先涉及使用低显微镜检查特定前列腺癌样品的特异性肿瘤模式，所述模式被指定为模式1-5，如表1中所述。
表1-用于确定格里森评分的模式
格里森评分被计算为两个数字的总和：(1)最常见模式评分和(2)第二常见模式评分。格里森评分范围为2至10，10分表示预后性最差。然后根据格里森评分评定格里森等级，将癌症分为低级、中级、高级。在这方面，低级肿瘤的格里森评分为6或更小，中级肿瘤的格里森分值为7，高级肿瘤的格里森评分为8-10。
如果例如格里森评分的预后检测表明对象的前列腺癌可能已扩散进入前列腺或身体的其他部分(即转移)，将进行附加检测以确定癌症的确切阶段，以便选择针对该阶段的最有效的治疗方案。可确定前列腺癌准确阶段的附加检测和程序包括，但不限于骨扫描、磁共振成像(MRI)、CAT扫描(CT扫描)、盆腔淋巴结切除术以及精囊活检。可以根据例如Edge等(编),美国癌症联合委员会(AJCC)分期手册(American Joint Committee on Cancer(AJCC)Staging Manual),第7版(2010)或SEER编码和分期手册(SEER Program Coding andStaging Manual),NIH出版号13-5581,美国卫生与人类服务部国家癌症研究所(2013)中描述的指南，将前列腺癌分为I期、II期、III期或IV期。
一旦确定前列腺癌对象的预后，本发明的方法包括根据对象的预后来选择对象的治疗方案，并为对象提供所述治疗方案。对对象的前列腺癌进行准确分期可以更好的选择并应用治疗方法。影响对象前列腺癌确切分期的知识使得临床医生对该患者选择最恰当和最有用的治疗或处理方法，同时避免无效甚至适得其反的治疗方法。
选择的治疗方案可以包括在本领域中已知的任何合适的、并在治疗任何阶段前列腺癌中都显示出效果的治疗方案或药物制剂，包括但不限于主动监测、外科手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗、生物治疗、二磷酸盐治疗、单克隆抗体治疗、冷冻手术、高强度聚焦超声和/或质子束放射治疗(参见，例如，Horwich,A.,Ann.Oncol.,17Suppl.10:x211-213(2006)；和Postma R.,Ann.Oncol.,17Suppl.10:x207-210(2006))。例如，护理I期前列腺癌的现行标准可包括动态监测、根治性前列腺切除术(通常与盆腔淋巴结切除术)、外粒子束放射治疗、内放射治疗、高强度聚焦超声临床试验和/或冷冻手术临床试验。护理II期、III期和IV期前列腺癌的标准包括许多在I期前列腺癌中采用的治疗方法，但还进一步包括质子束放射治疗、控制癌症和减轻泌尿症状的治疗(例如，激素治疗、内放射治疗、经尿道前列腺切除术(TURP)和新型放射治疗)、和癌已转移至骨的控制疼痛的治疗(例如，止痛药、外粒子束放射和单克隆抗体靶向治疗)。
下列实施例进一步说明本发明，但是当然，不应以任何方式被解释为限制其范围。
实施例1
本实施例证明sAC蛋白在前列腺癌细胞中过量生成。
对良性和恶性前列腺组织样品中的sAC基因表达、sAC蛋白亚细胞定位以及sAC蛋白分布进行了检测。对来自12例前列腺癌根治术标本的肿瘤和良性组织用鼠单克隆sAC抗体(R21)进行免疫组织化学染色。两例肿瘤良好分化(格里森评分6)，7例中度分化(格里森评分7)，3例低分化(格里森评分8-10)。
简言之，对5微米厚的福尔马林固定石蜡包埋组织切片进行脱蜡，并根据制造商的热诱导表位修复1方法及其配套试剂，通过Bond III自动染色机(Autostainer)(LeicaMicrosystems公司,伊利诺伊州布法罗格罗夫(Buffalo Grove))对其进行染色。如前所述(Zippin等,J.Invest.Dermatol.,130:1279-1287(2010)；和Magro等,Arch.Dermatol.,148:335-344(2012))，小鼠单克隆R21sAC抗体(CEPBiotech公司,R21-IHC,佛罗里达州塔马拉克(Tamarac))以1：750的稀释度使用，接着在次级(post primary)碱性磷酸酶步骤中处理20分钟进行信号放大，应用3，3'-二氨基联苯胺处理10分钟，最后洗脱并用盖玻片装配。
所有载玻片由有经验的泌尿病理学家以非盲方式评价。在对研究案例进行评估之前，前列腺测试案例由两位医师进行检查，以确定相对染色强度分类为弱(1+)、中等(2+)、以及强(3+)。一种将针对每个强度水平的组织染色百分比纳入考量的组织学评分系统(H-评分(Barnes等,Br.J.Cancer.,74:445-51(1996)))被用于量化染色量。H-评分按照如下等式来计算：H-评分＝(％细胞染色“1+”)×1+(％细胞染色“2+”)×2+(％细胞染色“3+”)×3。因此，H-评分范围为0到300。对每个案例的细胞中染色定位(即，细胞质区室，顶端/管腔边界(apical/luminal border)或核小室)进行记录。当sAC特异性DAB沉淀物(棕色)覆盖并遮蔽苏木精染色(蓝色)的细胞核时，核染色为阳性。细胞质染色被定义为sAC-特异性DAB沉淀不覆盖细胞核。每个案例的染色分布变化(即靠近前列腺外围(“囊状”)的组织相对于更靠近内部的区域)也进行记录。
sAC基因表达/sAC蛋白生成的分析结果示于表2。所有前列腺腺体，无论良性或恶性，均表现出至少为sAC弱(1+)的细胞质染色。当对sAC基因表达/sAC蛋白生成的水平进行分析时，前列腺癌腺体相比于良性腺体的sAC染色显著增加(H-评分分别为189.2与144.3；P<0.01)。
表2-sAC基因表达/sAC蛋白生成的分析结果
在靠近前列腺“囊状”的前列腺癌前沿和肿瘤中心相关的肿瘤前列腺外病灶处，可观察到sAC上调，但当肿瘤更深入地浸润到前列腺腺体时并未观察到染色的显著增加。与之相反，与前列腺更深处的良性腺体相比，前列腺“囊状”附近的良性腺体通常没有表现出任何sAC上调。
sAC的亚细胞定位分析显示sAC在所有细胞中具有弥散性细胞质染色。一些腺体也显示了细胞核或细胞顶端/管腔边界的更强烈的染色。统计分析显示在良性前列腺组织与肿瘤样品中，sAC的亚细胞分布模式没有任何显著性差异。
本实施例的结果表明，前列腺癌中sAC蛋白的生成升高。
实施例2
该实施例证明在前列腺癌细胞中sAC蛋白过量生成。
从威尔康乃尔医学院外科病理科的数据库中对前列腺癌案例进行回顾性鉴定。针对存档的福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品使用0.6毫米核心来构建组织微阵列(TMA)，每个区域一式三份。如果可能的话，针对每个案例均进行良性前列腺组织、高度前列腺上皮内瘤(HGPIN)和侵袭性前列腺腺癌的区域采样；然而，在某些情况下，不是所有组织类型都存在以用于采样/评估。
使用三种sAC抗体(R21、R40和R52)在TMA载玻片上进行免疫组织化学染色。TMA包括50例良性前列腺组织样品，35例HGPIN样品，65例局限性前列腺腺癌样品以及25例神经内分泌前列腺癌(NEPC)、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)和/或转移性前列腺腺癌的样品。65例局限性前列腺癌中，50例为器官局限型(病理分期T2)，15例为前列腺外扩散和/或精囊侵袭(病理分期T3a或T3b)。局限性前列腺癌中，10例为良性分化(格里森评分为6)，50例为中度分化(格里森评分为7)，和5例为恶性分化(格里森评分为8-10)。
除非另有说明，5μm厚、含福尔马林固定、石蜡包埋的组织核心的TMA块切片进行脱蜡，并使用BOND-Ⅲ自动染色机(Leica Microsystems,伊利诺伊州布法罗格罗夫)及配套试剂进行染色。对于R 21和R 52抗体，使用制造商的热诱导表位修复1方法进行抗原修复。对于R40抗体，没有进行抗原修复。如先前所述(Zippin等,J.Invest.Dermatol.,130:1279-1287(2010)；和Magro等,Arch.Dermatol.,148:335-344(2012))，针对R21、R40和R52的小鼠抗sAC单克隆抗体(CEP Biotech公司,佛罗里达州塔马拉克)分别以1：750、1:75和1：250稀释度使用。使用抗体孵育，接着进行次级碱性磷酸酶步骤处理20分钟进行信号放大，应用3,3'-二氨基联苯胺10分钟，最后洗脱并用盖玻片装配。
所有的载玻片由经验丰富的泌尿病理学家以半盲方式评估。对研究案例进行评估之前，前列腺测试案例由两位医师进行检查，以确定相对染色强度分类为弱(1+)、中度(2+)以及强(3+)。H-评分(Barnes等，同上)根据实施例1中的描述进行计算并用于量化染色量。对每个案例的细胞内染色定位(细胞质小室、顶端/管腔的边界、或核小室)进行记录。当sAC特异性二氨基联苯胺沉淀物(棕色)覆盖并遮蔽苏木精染色(蓝色)的细胞核时，核染色呈阳性。在某些情况下，只有核仁有反应。细胞质染色被定义为sAC特异性二氨基联苯胺沉淀物不覆盖细胞核。对于R40抗体，核染色阳性(包括那些只有核仁染色)的百分比也进行记录。使用R21、R40和R52抗体进行sAC染色的结果分别示于表3、4和5。
表3-sAC表达/生成的R21免疫组织化学分析
H-评分(均值)
良性/恶性
良性 135.2
HGPIN 152.9
恶性 192.1
肿瘤组中
pT2 172.1
pT3 210.4
格里森6 152.7
格里森7 171.9
格里森8-10 195.0
转移性前列腺癌
良性 135.2
局限性前列腺癌 192.1
Met/CRPC/NEPC 185.6
R21染色总是在细胞质中，并且管腔边界和/或核染色处偶有增强。相比良性前列腺组织，恶性肿瘤显示出显著增强的染色。高度前列腺上皮内瘤(HGPIN)，被认为是癌症的前兆和/或癌症风险的标志物，显示出比良性前列腺组织的染色增强，但比侵袭性腺癌的染色少。在肿瘤组中，更高等级和更高阶段的肿瘤有更高的H-评分(即，更可能有3+染色)。转移性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)以及神经内分泌性前列腺癌(NEPC)的染色有变化，并不一定比局部前列腺癌有增加，但大于良性前列腺组织。
表4-sAC表达/生成的R40免疫组织化学分析
H-评分(均值)
良性/恶性
良性 53.6
HGPIN 64.2
恶性 82.8
肿瘤组中
pT2 81.1
pT3 83.7
格里森6 80.9
格里森7 84.5
格里森8-10 79.2
转移性前列腺癌
良性 53.6
局限性前列腺癌 82.8
Met/CRPC/NEPC 50.4
R40染色在细胞质中，强度很少为3+，大多数情况下(良性或恶性)显示为0或1+染色。没有观察到明显的管腔处增加和/或核阳性。在肿瘤组中，更高等级和更高阶段的肿瘤有类似的H-评分。与局限性前列腺癌中阴性(0+)染色的频率增加相比，转移性前列腺癌去势抵抗性前列腺癌(CRPC)以及神经内分泌性前列腺癌(NEPC)显示出R40表达/生成的减少。
表5-sAC表达/生成的R52免疫组织化学分析
H-评分(均值) 均值％细胞核阳性
良性/恶性
良性 42.0 1.3
HGPIN 45.7 2.2
恶性 62.7 5.9
肿瘤组中
pT2 60.8 3.4
pT3 68.2 7.5
格里森6 50.1 2.3
格里森7 59.9 3.6
格里森8-10 69.1 8.9
转移性前列腺癌
良性 42.0 1.3
局限性前列腺癌 62.7 5.9
Met/CRPC/NEPC 72.4 13.6
R52染色主要在细胞质中，并且一般不存在或很弱(即0或1+染色，偶尔2+，很少3+)。恶性肿瘤的细胞质染色比良性前列腺组织中略有增加。使用R52抗体染色揭示了良性细胞中核阳性很少见，并且在恶性肿瘤中sAC阳性细胞核(包括一些核仁阳性)的百分比增加。在肿瘤组中，更高等级和更高阶段的肿瘤表现出类似的细胞质H-评分，但sAC阳性细胞核(包括核仁阳性)的百分比更高。相比于局限性前列腺癌，转移性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)以及神经内分泌前列腺癌(NEPC)显示sAC阳性细胞核(包括核仁阳性)的百分比增加。
本实施例结果表明，前列腺癌中sAC蛋白的生成升高。
实施例3
本实施例证明通过抑制可溶性腺苷酸环化酶(sAC)蛋白的活性来抑制前列腺癌细胞增殖的方法。
雄激素敏感的LNCaP(ATCC-Nr.CRL-1740D)人前列腺癌细胞系、雄激素不敏感的PC3(ATCC-Nr.CRL-1435D)人前列腺癌细胞系和神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(ATCC-Nr.CRL-2266)购于美国模式培养物保藏所，人正常前列腺上皮细胞系PNT2购于西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司(Cat.Nr.95012613)。细胞在购买四周内扩增并等分冷冻。细胞解冻并培养不超过三代。PNT2细胞使用添加10％胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640培养基进行培养。所有其他细胞使用添加5％胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基进行培养。每个实验提前24小时将细胞(1.5x105)接种于含2％胎牛血清的培养基中。
在LNCaP和PC3前列腺癌细胞系中sAC蛋白的生成通过蛋白印迹进行分析。具体而言，细胞使用含有2％SDS、10％甘油、5％2-巯基乙醇、0.002％溴酚蓝以及0.0625mol/L的Tris-HCl的Laemmli缓冲液裂解。等量的总蛋白使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离，并转移至硝酸纤维素膜上。使用以下一抗：sAC(克隆R21和R40；J.Buck博士提供)和肌动蛋白(密理博公司(Millipore),马萨诸塞州比尔里卡)。过氧化物酶联和辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育后，使用ECL Plus试剂盒通过化学发光显影，可以看到特定的条带。使用RESTORETM蛋白印迹剥离缓冲液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific),伊利诺伊州罗克福德)剥离膜，接着用抗肌动蛋白抗体处理，以确定样品的上样量相同。
相比于正常人PNT2前列腺上皮细胞，LNCaP和PC3前列腺癌细胞系表现出增加的sAC生成，如图1A所示。此外，使用R40抗体和R21抗体来分析同种型特异性表达，所述R40抗体只识别“睾丸型”同种型，所述R21抗体可识别“睾丸型”和“躯体型”同种型(参见Farrell等,PLoS ONE,22:e3251(2008))，显示了这两个细胞系有弱表达的“睾丸型”同种型，如图1B所示，表明“躯体型”同种型是sAC在这些细胞中主要形式。
使用选择性sAC抑制剂KH7处理PC3和LNCaP细胞来抑制sAC的活性。以往研究表明，KH7在10-30μmol/L的浓度范围内能抑制各种细胞类型内的sAC，但即使高达100μmol/L对tmAC和可溶性鸟苷酸环化酶也没有影响(Hess等，Dev.Cell.,9:249-259(2005))。为进一步区分KH7可能的非特异性sAC非依赖性效果，使用KH7的无活性类似物KH7.15(Wu等,Nat.Neurosci.,9:1257-1264(2006))。
KH7处理在两个细胞系中以剂量依赖性方式降低细胞内cAMP含量并抑制细胞增殖，在20μmol/L时有最大效果，如图2所示。使用20μmol/L KH7处理48小时后进行细胞生长和死亡分析，显示抑制sAC的抗增殖效果伴随着LDH的释放和凋亡，如亚G1群和半胱天冬酶3的剪切的增加所测定。与此相反，使用非活性类似物KH7.15处理没有效果，这表明KH7处理所观察到的效果是sAC依赖性的。
为了进一步证实sAC在细胞生长和死亡中的作用，LNCaP细胞中sAC基因的表达/sAC蛋白的生成受到抑制。两种不同的sAC基因敲减方法，以基于脂质体转染的sAC特异性siRNA或腺病毒转染的shRNA，被用来进一步排除KH7脱靶效应的可能性。对于以基于脂质体的siRNA转染，使用由四个预先设计基于靶向到人sAC mRNA序列(GenBank登录号NM_001167749；Dharmacon公司,科罗拉多州拉斐特；目录号L-006353-00,)的不同序列组成的siRNA双链体来处理LNCaP细胞。在对照组中，细胞用乱序非靶向siRNA处理(Dharmacon公司,科罗拉多州拉斐特；目录号D-001810-10)。根据制造商的说明进行细胞转染。简言之，将细胞在转染前1天染接种在补充有2％胎牛血清、不含抗生素的杜尔贝科改良的伊格氏培养基中。靶向或非靶向siRNA与Lipofectamine 2000(密苏里州圣路易斯)在Opti-MEM培养基(Life Technologies公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)中室温下混合20分钟，然后加入细胞培养基中，终浓度为40nmol/L。将细胞在37℃下孵育6小时，将培养基换成正常培养基(1％胎牛血清)，再培养42小时。然后将胎牛血清的浓度增加至2％，将细胞再培养24小时。
在LNCaP细胞中使用腺病毒驱动的shRNA转录用于sAC基因敲减的实验步骤和方法是根据之前的方案进行修改(Rinne等,J.Muscle Res.Cell.Motil.,27:413-421(2006))。具体地，使用AdEasy腺病毒载体系统构建shRNA腺病毒载体。通过使用BglII和KpnI限制性位点，pAd-Track-CMV穿梭载体用于插入鼠源U6启动子和抗sAC-定向的shRNA序列作为双链寡核苷酸。包含鼠源U6snRNA启动子的pmU6pro载体作为模板。为产生编码shRNA的载体，U6启动子和发夹结构使用通用的U65-引物与包含靶向大鼠sAC mRNA序列(GenBank登录号NM_021684.1；粗体)的siRNA和互补的U6启动子序列(斜体)的3-引物进行融合：
5-GGGGTACCAAAAAA TCTCTTGAA -3(SEQ ID NO:10)。下划线序列对应发夹环。尽管同源性不是100％，该序列有效抑制人sAC的表达/sAC蛋白的生成。基于SEQ ID NO:9的随机序列(乱序)作为对照。通过在大肠杆菌中pAd-Track-sh-sAC和pAd-Easy1的同源重组产生重组腺病毒质粒，从而生成重组病毒。重组病毒在HEK293细胞中繁殖和经过多次冻融循环回收。使用106病毒颗粒/mL的培养基来感染细胞。
两种敲减方法均使得50kDa的sAC同种型的表达降低≥80％，如图3A所示。类似于KH7药物抑制sAC，两种sAC基因敲减的方法均显著抑制了LNCaP细胞的增殖(siRNA处理下细胞数从6.37x105减少至3.25x105，shRNA处理下减少至3.56x105)，诱导LDH的释放，并导致半胱天冬酶3切割，如图3B-3D所示。与此相反，用乱序siRNA或shRNA处理对这些参数没有影响。
这些结果证明了通过抑制sAC基因表达/sAC蛋白生成从而抑制前列腺癌细胞增殖的方法。
实施例4
本实施例证明了抑制sAC表达/sAC蛋白生成导致细胞周期停滞。
为理解抑制sAC的抗增殖作用的机制，使用基于FACS的细胞周期分析进行细胞周期分析。具体而言，将LNCaP细胞用70％乙醇固定，使用碘化丙啶染色，并使用RNA酶(BD生物科学公司(BD Biosciences),加利福尼亚州圣何塞)处理。使用FACSCALIBURTM流式细胞仪(BD生物科学公司,加利福尼亚州圣何塞)和FLOWJOTM软件对DNA含量进行分析。
LNCaP细胞中，sAC活性的药物抑制或遗传抑制显著增加了G2期细胞的百分比，并随后降低了G1期细胞的百分比，表明细胞周期停滞的发展是在G2/M期检查点，如在图4A-4C所示。细胞周期停滞过程的进一步动力学分析表明，G2期的细胞百分比在sAC抑制剂处理12小时后开始上升并在24小时时达到最大值，如图4D所示。与此相反，半胱天冬酶3的切割在24小时后首次出现。因此，凋亡似乎是细胞周期停滞的结果而不是原因。
为研究sAC如何控制G2/M期过渡，各种细胞周期蛋白和CDK1的表达通过之前描述的蛋白印迹使用以下一抗进行检测：CDK1、磷酸化CDK1、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3和细胞周期蛋白E2。KH7处理显著抑制了细胞周期蛋白B1和CDK1(磷酸化和非磷酸化形式)，由光学条带密度减少所证实，和对照水平相比，与肌动蛋白条带密度的比率为66％(细胞周期蛋白B1)、64％(CDK1)和78％(磷酸化CDK1)。sAC敲减后发现了类似的效果：与对照水平相比减少了70％(细胞周期蛋白B1)、75％(CDK1)和78％(磷酸化CDK1)，如图4E所示。与此相反，sAC抑制没有改变负责G1/S过渡的蛋白(细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3和细胞周期蛋白E2)的表达，如图4F所示。因此，这些数据支持sAC在控制G2/M过渡中的独特作用。
PKA和cAMP激活的交换蛋白(EPAC)是cAMP的两个主要下游靶标。因此，对这些蛋白在sAC依赖性增殖调控中的潜在作用进行了研究。PKA的作用首先通过应用PKA-特异性激活剂N6-苯甲酰基-cAMP进行研究。使用该化合物处理对照细胞或sAC抑制剂KH7处理的细胞，对增殖均没有影响，如图5A-5C所示。分别使用下列两种结构不同的PKA抑制剂处理细胞，ATP结合位点抑制剂H-89(3μmol/L)和cAMP结合位点抑制剂RpcAMP(100μmol/L)。使用这些抑制剂处理对增殖，细胞毒性或细胞周期中细胞群的分布均没有影响，如图5A-5C所示。
为了检测EPAC在增殖调控中的作用，对LNCaP细胞中抑制sAC对EPAC活性的影响进行了检测。为追踪EPAC活性，激活型Rap1，GTP结合Rap1，的表达通过之前所述的蛋白印迹使用抗Rap1A一抗(Jena Bioscience,德国耶拿市(Jena))进行分析。使用KH7抑制sAC显著消耗Rap1-GTP，而使用它的非活性类似物KH7.15处理则无影响，如图5D所示。类似地，抑制sAC降低了B-Raf(受Rap1活化的下游激酶)的磷酸化，如通过蛋白印迹使用磷酸化B-Raf和B-Raf一抗(细胞信号转导公司(Cell Signaling),德国法兰克福市)所证明。分析以与肌动蛋白条带密度比率来表示的光学条带密度并未显示出任何KH7处理对Rap1表达(0.81±0.07对比对照组中的0.79+0.01，n＝6)或B-Raf表达(1.02+0.04对比对照组中的1.13+0.06，n＝8)有任何显著影响。
使用选择性EPAC活化剂8-pCPT处理，逆转了KH7对Rap1-GTP表达的影响，如图5E所示。进一步的分析表明，使用EPAC活化剂处理阻止了由于sAC抑制诱发的细胞增殖下降、LDH释放以及细胞周期阻滞。
这些结果证明sAC以EPAC/Rap1依赖性、PKA非依赖性的方式来调控细胞周期和增殖。
在此引用的所有参考文献，包括公开、专利申请及专利系以引用的方式全部并入本文中，其引用的程度如同每个参考文献被单独并具体地指出通过引用被并入并在本文中整体阐述。
在描述本发明的上下文中(特别是在下文权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一个”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一个”连在一个或多个项目后面使用(例如，“至少一个A和B”)应被解释为从列出的项目中选择一个项目(A或B)或所列出的项目的两个或更多个的组合(A和B)，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”和“含有”被解释为开放式术语(即，意思是“包括，但不限于，”)，除非另有说明。本文所述的数值范围仅旨在用作独立涉及落在该范围内的每个单独数值的速记方法，除非在此另有说明，并且每个单独数值并入本说明书中，如同其在本文中单独列举一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本文所提供的任何和所有实施例的使用或示例性语言(例如，“如”)的使用，仅仅是为了更好地阐明本发明，而对本发明的范围不构成限制，除非另有要求。说明书中的任何语言均不应被解释为表示对本发明实践所必需的任何未要求保护的元素。
在本发明中描述的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了前面的描述，这些优选实施方式的变化可以对于本领域普通技术人员变得明显。发明人期望熟练的技术人员适当采用这些变型，并且发明人希望本发明也以不同于本文具体描述的方式进行。因此，本发明包括法律允许的本文所附的权利要求书中主题的所有修改和等同。此外，本发明包括上述元素的所有可能的变化中的任意组合，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。

Claims (14)

1.抑制可溶性腺苷酸环化酶(sAC)蛋白活性的物质在制备用于抑制前列腺癌细胞增殖的试剂中的用途，所述抑制包括使前列腺癌细胞与所述物质接触，从而抑制前列腺癌细胞的增殖。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制sAC蛋白活性的物质是(E)-2-(1H-苯并[d]咪唑-2-基硫代)-N’-(5-溴-2-羟基苯亚甲基)丙烷酰肼(KH7)、特异性靶向sAC蛋白编码基因的小干扰RNA(siRNA)或小发夹结构RNA(shRNA)。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的用途，其中将所述抑制sAC蛋白活性的物质给予男性前列腺癌对象。
4.一种用于分析样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成的物质在制备用于诊断男性对象前列腺癌的诊断试剂中的用途，所述诊断包括：
(a)从男性对象的前列腺获取细胞样品，
(b)用所述诊断试剂分析所述样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成，以及
(c)将所述样品中sAC基因表达水平或sAC蛋白生成水平与对照进行比较，其中与所述对照相比，所述样品中sAC基因的过量表达或sAC蛋白的过量生成指示所述男性对象患有前列腺癌。
5.一种用于检测样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成的物质在制备用于为前列腺癌对象选择治疗方案的诊断试剂中的用途，所述选择包括：
(a)从前列腺癌对象获取前列腺癌细胞样品，
(b)用所述诊断试剂检测所述样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成，
(c)将所述样品中sAC基因表达水平或sAC蛋白生成水平与对照进行比较，
(d)根据(c)的比较来预后所述对象的前列腺癌的病情，
(e)根据(d)中对所述对象的预后来选择所述对象的治疗方案，以及
(f)向所述对象提供所述治疗方案。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其中所述细胞样品来源于活体检查、组织切除或细针抽吸(FNA)。
7.根据权利要求4或5所述的用途，其中所述样品用于分析sAC基因的表达。
8.根据权利要求4或5所述的用途，其中所述样品用于分析sAC蛋白的生成。
9.根据权利要求5所述的用途，其中对所述对象前列腺癌的预后包括计算Gleason评分和/或确定所述样品的前列腺癌的阶段。
10.根据权利要求5所述的用途，其中所述治疗方案是主动监测、外科手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗、生物治疗、二磷酸盐治疗、冷冻手术、高强度聚焦超声，或上述治疗方案的任意组合。
11.根据权利要求6所述的用途，其中所述样品用于分析sAC基因的表达。
12.根据权利要求6所述的用途，其中所述样品用于分析sAC蛋白的生成。
13.根据权利要求10所述的用途，其中所述放射治疗是质子束放射治疗。
14.根据权利要求10所述的用途，其中所述生物治疗是单克隆抗体治疗。
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