CN104977339A - 一种用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器，包括绝缘性基体、形成在该基体上的含有工作电极、参比电极和对电极的电极系统，所述工作电极上固定有生物酶层，该生物酶层包括磁性纳米粒子修饰的蛋白磷酸酶2A（PP2A）以及电子传递体，所述磁性纳米粒子的直径为250nm～350nm，还涉及该种酶传感器的制备方法。与普通的酶传感器相比，经磁性纳米粒子修饰的PP2A酶有效提高了工作电极表面PP2A酶的负载率，使得该酶传感器的电流响应值比普通PP2A酶传感器提高10倍以上，在用于检测水产品大田软海绵酸时，检出限低于0.20μg/L、重现性RSD＜5%，检测耗时小于0.5h。

Description

一种用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器及制备方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种用于检测贝类毒素大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器及制备方法。

背景技术

大田软海绵酸（okadaic acid,OA），一种小分子海洋聚醚类毒素，是分布最广、发病率最高的海洋毒素之一，常蓄积于贝类等海洋生物体内，可经食物链引发多种以腹泻为主要特征的食物中毒，能导致严重的胃肠功能紊乱，中毒症状极易与细菌性胃肠炎混淆。大田软海绵酸中毒后无特效药救治，沿海地区时有误食腹泻性贝类毒素污染的贻贝等而引发中毒，严重影响了人们的身体健康和海产品的开发利用。因此，建立快速、灵敏和可靠的大田软海绵酸的检测方法以及检测设备对保障海产品安全尤为重要。

目前大田软海绵酸的生物检测方法中常用的有小鼠生物法和酶联免疫吸附检测法（ELISA）等，其中小鼠生物法比较直观，可直接判断该样品是否可供使用，但检测周期长、灵敏度低、个体差异大，不能确定毒素的组成成分，定量困难，假阳性率高、重现性差。ELISA法具有较高的敏感度，但ELISA法中抗体往往只针对主要成分，其类似物可能会产生交叉反应，从而出现假阳性或对毒性的估计不准确，而且单克隆抗体的制备困难，试剂盒价格昂贵，我国目前尚没有商品化ELISA试剂盒可售。

申请号为ZL201010266834.9（授权公告号为CN101975768B）的中国发明专利《腹泻性贝类毒素检测方法》中公开了一种检测大田软海绵酸的方法，该方法通过建立大田软海绵诱导HL-7702肝细胞F-肌动蛋白（F-actin）解聚的标准曲线，根据HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围，同时选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分STX、DA、YTX中的一种或几种作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性。该方法与小鼠生物法相比具有符合3R原则、灵敏度高、特异性较好、重复性好以及样品提取简便，基质效应低等优点；与ELISA法相比具有特异性较好，灵敏度更高的优点，但该方法中以细胞为实验对象，培养周期和成本较高，且检测结果不直观，不适应快速检测的需要。

酶生物传感器是以固定化酶膜为物质识别元件，以基本电极为信号转换器的生物传感器，当酶膜上发生酶促反应时，产生的电活性物质由基体电极对其响应，基体电极使化学信号转变为电信号，从而对目标物质加以检测。大田软海绵酸是蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase2A，PP2A）的烈性抑制剂，能抑制蛋白磷酸酶活性而导致蛋白质过磷酸化，利用大田软海绵酸对PP2A酶活力抑制的这一特性，已经发展和建立了大田软海绵酸的蛋白磷酸酶活力抑制法，然而，非固定化的PP2A酶稳定性不高，且不能实现在线、实时快速检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种准确率高、实时快速的用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器，包括绝缘性基体、形成在该基体上的含有工作电极、参比电极和对电极的电极系统，其特征在于，所述工作电极上固定有生物酶层，该生物酶层包括磁性纳米粒子修饰的蛋白磷酸酶2A（PP2A）以及电子传递体，所述磁性纳米粒子的直径为250nm～350nm。

磁性纳米粒子可通过多种方式修饰PP2A酶，作为优选，所述磁性纳米粒子为镍修饰磁性纳米粒子，而所述PP2A酶蛋白质链氨基末端修饰有能与所述镍修饰磁性纳米粒子共轭链接的hexa-His。

所述电子传递体为对硝基苯磷酸二钠盐，对硝基苯磷酸二钠盐在PP2A作用下产生对硝基苯和磷酸盐离子，对硝基苯磷酸二钠盐的去磷酸化反应可以电化学信号记录。

作为优选，所述参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为石墨电极，Ag/AgCl电极是重现性和稳定性最好的参比电极之一，对电极在三电极系统中仅起到与工作电极形成回路，以使电极系统中电流通过的左右，因此选择较稳定的石墨作为对电极。

上述用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器的制备方法包括以下步骤：首先将镍修饰的磁性纳米粒子与所述PP2A酶偶联吸附连接形成磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，然后将该磁性纳米粒子修饰的PP2A酶通过光交联法或琼脂糖包埋法固定在所述工作电极上。

所述镍修饰的磁性纳米粒子与所述PP2A酶偶联吸附连接包括以下步骤：（1）将15～30ul的Ni-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入到预装有150～300ul结合缓冲液的容器中，并用所述结合缓冲液清洗，以去除非特异性结合，所述结合缓冲液的pH为8-8.5，含有Tris–HCl、NaCl以及叠氮化钠；

（2）将1～2个单位PP2A酶/ul的PP2A酶溶液加入到所述容器中，以600-1000转/min的转速震摇所述容器10～20min，以使所述磁性纳米粒子与所述PP2A酶充分偶联吸附结合，所述PP2A酶溶液与所述NI-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液的体积比为50～100:3，所述1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（3）用所述结合缓冲液清洗所述磁性纳米粒子，以去除非结合的所述PP2A酶。

作为优选，所述结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，该Tris溶液含有500mMNaCl和0.09%叠氮化钠。

上述光交联法的具体步骤为：

（1）将所述磁性纳米粒子修饰的PP2A酶溶解在pH8～8.5缓冲液A中制成1～2个单位/ul的固定酶溶液，在该酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶与所述PVA-AWP的质量比为1～2:1，均质后形成固定溶液，所述缓冲液A包含Tris–HCl、EDTA以及MgCl₂，所述1单位磁性纳米粒子修饰的PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（2）然后滴加2.5～3.5ul所述固定溶液至工作电极表面，3～5℃下在功率为12～15W的日光灯下照射3～6h；

（3）光照后，3～5℃下干燥12～24h，干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，最后将制得的固定化磁性纳米粒子修饰的PP2A酶电极在4℃下保存备用。

作为优选，所述缓冲液A包含30mM Tris–HCl、2mM EDTA和20mM MgCl₂。

所述琼脂糖包埋法的具体步骤为：（1）将0.1～0.2g琼脂糖加入到50～100ml pH为8～8.7的Tris–HCl缓冲液中，55～65℃加热4～6min，充分溶解后得琼脂糖溶液，待该琼脂糖溶液降温至20～27℃时，将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶加入到琼脂糖溶液中并充分混合形成混合液，该混合液中磁性纳米粒子修饰的PP2A酶的浓度为1～2个单位PP2A酶/ul，其中所述1单位磁性纳米粒子修饰的PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（2）上述混合液3～5℃放置11～13h后，取2.5～3.5ul滴涂于所述工作电极表面，室温下干燥成膜5～6h；

（3）干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化PP2A酶电极在4℃下保存备用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中PP2A酶通过磁性纳米粒子修饰，由于纳米粒子表面呈球状，因此其比表面积远大于平面结构，单位体积内可以负载更多的反应酶，从而提高工作电极表面PP2A酶的负载率，提高该酶传感器的检出敏感性，本发明制备的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶传感器，其电流的响应值比普通PP2A酶传感器提高10倍以上。同时本发明利用大田软海绵酸对PP2A酶活力的抑制作用制成以PP2A酶为固定化酶层的生物传感器，通过PP2A酶活性抑制的程度测定样品中大田软海绵酸含量的高低，即将样品中大田软海绵酸浓度转换为电信号进行检测，检测结果更加直观，同时利用PP2A酶促反应的专一性和高效性，使得检测过程特异性高，检测结构准确率高，同时检测周期短，可实现即时、快速检测的需要，本发明用于检测水产品大田软海绵酸时，检出限低于0.20μg/L、重现性RSD<5%，检测耗时小于0.5h。

附图说明

图1为本发明中用于检测贝类毒素大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器的结构示意图；

图2为图1中酶传感器的原理示意图；

图3为本发明中磁性纳米粒子与PP2A酶通过Ni-His吸附固定示意图；

图4本发明中不同浓度的标准液中大田软海绵酸对PP2A酶活性的抑制率（%）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

如图1所示为一种用于检测贝类毒素大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器，包括PVC膜基体1，该基体1上丝网印刷有含工作电极2、参比电极3和对电极4的三电极系统，且工作电极2、参比电极3和对电极4分别通过传导带5与基体1外的传导终端6连接。工作电极2近似圆形以方便样品的滴加，参考电极3和对电极4呈圆弧条状，对称设置在工作电极2的两侧，工作电极2上固定有生物酶层21，该生物酶层21包括磁性纳米粒子修饰的蛋白磷酸酶2A（PP2A）以及电子传递体。如图2所示，对硝基苯磷酸二钠盐在PP2A酶作用下分解为对硝基苯酚和磷酸盐离子，大田软海绵酸是PP2A酶的烈性抑制剂，能抑制蛋白磷酸酶活性而导致蛋白质过磷酸化，本发明利用大田软海绵酸对PP2A酶活力抑制的这一特性，选用硝基苯磷酸二钠盐作为电子传递体，Ag/AgCl电极作为参比电极，石墨电极作为对电极，从而构成用于检测大田软海绵酸的生物传感器。由于纳米粒子表面呈球状，比表面积远大于平面结构，单位体积内可以负载更多的反应酶，因此本发明中的PP2A修饰有磁性纳米粒子后可增加工作电极表面PP2A酶的负载率，从而提高酶传感器检测过程中的敏感性，减少样品的使用。进一步，本发明中的磁性纳米粒子选用镍修饰磁性纳米粒子，而PP2A酶选用氨基末端修饰有hexa-His的基因工程PP2A酶（GTP Technology，法国），hexa-His能与镍修饰的磁性纳米粒子共轭连接，使得镍修饰的磁性纳米粒子通过共轭方式修饰PP2A酶。如图3所示，本发明中的镍修饰磁性纳米粒子与基因工程PP2A酶的偶联吸附是基于Ni²⁺能强烈地与含有组氨酸或半胱氨酸残基的蛋白质或氨基酸反向结合，吸附时采用亚氨基二乙酸（IDA）作为螯合剂，因此本发明中采用的磁性纳米粒子为含有镍-亚氨基二乙酸（Ni-IDA）的复合物（Ademtech，法国），而PP2A酶采用基因工程修饰的含有组氨酸标签的PP2A酶。

下面通过实施例1～6来具体阐述用于检测贝类毒素大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器的制备方法：

实施例1：

将30ul直径为300nm的Ni-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入预装有300ul结合缓冲液的微管中，充分混匀后，将该微管放置在磁力架（Adem Mag SV magnetic support,法国）上，以去除微管中的液体，这样就完成了磁性纳米粒子的清洗，按照上述步骤重复清洗一次，以充分去除非特异性结合，其中该结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，溶液含有500mM NaCl和0.09%叠氮化钠。

Ni-IDA磁性纳米粒子充分清洗后，将0.5ml1个单位/ul PP2A酶溶液加入到微管中，以800转/min的转速震摇微管15min，以使磁性纳米粒子胶状悬浮液与基因工程PP2A酶充分进行偶联吸附结合，反应结束后将微管放置在磁力架上以去除溶液，制得磁性纳米粒子修饰的PP2A酶。用上述结合缓冲液清洗制得的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，以去除未与磁性纳米粒子结合的PP2A酶，所述1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量。

清洗表面具有工作电极、参比电极和对电极的PVC膜基体（西格玛奥德里奇公司，美国），烘干备用。将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶溶解在pH为8.4包含30mM Tris–HCl,2mM EDTA和20mM MgCl2的缓冲液A中，制成1个单位/ul的酶溶液，其中1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶量。在该酶溶液中加入PVA-AWP（聚乙烯醇-具有叠氮化物单元侧基的(azide-unit pendant)水溶性光聚合物，Toyo Gosey Kogyo corporation，日本），磁性纳米粒子修饰的PP2A酶与PVA-AWP的质量比为2:1，均质后形成固定溶液。然后滴加3ul固定溶液至工作电极表面，4℃下在功率为15W的日光灯下照射3h。光照结束后，进一步在4℃下干燥24h，干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化PP2A酶电极在4℃下保存备用。

实施例2：

将15ul直径为300nmNi-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入预装有150ul结合缓冲液的微管中，充分混匀后，将该微管放置在磁力架上，以去除微管中的液体，这样就完成了磁性纳米粒子的清洗，按照上述步骤重复清洗一次，以充分去除非特异性结合，其中该结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，溶液含有500mM NaCl和0.09%叠氮化钠。

Ni-IDA磁性纳米粒子充分清洗后，将0.45ml1个单位/ul PP2A酶溶液加入到微管中，以750转/min速转速震摇微管18min，以使磁性纳米粒子胶状悬浮液与基因工程PP2A酶充分进行偶联吸附结合，反应结束后将微管放置在磁力架上以去除溶液，制得磁性纳米粒子修饰的PP2A酶。用上述结合缓冲液清洗制得的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，以去除为与磁性纳米粒子结合的PP2A酶，所述1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量。

清洗表面具有工作电极、参比电极和对电极的PVC膜基体，烘干备用。将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶溶解在pH为8包含30mM Tris–HCl,2mM EDTA和20mM MgCl2的缓冲液A中，制成1.5个单位/ul酶溶液，其中1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶量。在该酶溶液中加入PVA-AWP，磁性纳米粒子修饰的PP2A酶与PVA-AWP的质量比为1:1，均质后形成固定溶液。然后滴加2.5ul固定溶液至工作电极表面，4℃下在功率为15W的日光灯下照射3h。光照结束后，进一步在4℃下干燥24h，干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化PP2A酶电极在4℃下保存备用。

实施例3：

将20ul直径为350nmNi-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入预装有200ul结合缓冲液的微管中，充分混匀后，将该微管放置在磁力架上，以去除微管中的液体，这样就完成了磁性纳米粒子的清洗，按照上述步骤重复清洗一次，以充分去除非特异性结合，其中该结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，溶液含有500mM NaCl和0.09%叠氮化钠。

Ni-IDA磁性纳米粒子充分清洗后，将0.6ml2个单位/ul PP2A酶溶液加入到微管中，以850转/min速转速震摇微管20min，以使磁性纳米粒子胶状悬浮液与基因工程PP2A酶充分进行偶联吸附结合，反应结束后将微管放置在磁力架上以去除溶液，制得磁性纳米粒子修饰的PP2A酶。用上述结合缓冲液清洗制得的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，以去除为与磁性纳米粒子结合的PP2A酶，所述1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量。

清洗表面具有工作电极、参比电极和对电极的PVC膜基体，烘干备用。将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶溶解在pH为8.7包含30mM Tris–HCl,2mM EDTA和20mMMgCl2的缓冲液A中，制成2个单位/ul酶溶液，其中1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶量。在该酶溶液中加入PVA-AWP（聚乙烯醇-具有叠氮化物单元侧基的(azide-unit pendant)水溶性光聚合物），磁性纳米粒子修饰的PP2A酶与PVA-AWP的质量比为1.5:1，均质后形成固定溶液。然后滴加2.5ul固定溶液至工作电极表面，3℃下在功率为12W的日光灯下照射6h。光照结束后，进一步在5℃下干燥12h，干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化PP2A酶电极在4℃下保存备用。

实施例4：

将25ul直径为250nmNi-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入预装有250ul结合缓冲液的微管中，充分混匀后，将该微管放置在磁力架上，以去除微管中的液体，这样就完成了磁性纳米粒子的清洗，按照上述步骤重复清洗一次，以充分去除非特异性结合，其中该结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，溶液含有500mM NaCl和0.09%叠氮化钠。

Ni-IDA磁性纳米粒子充分清洗后，将0.5ml1.5单位/ul PP2A酶溶液加入到微管中，以850转/min速转速震摇微管12min，以使磁性纳米粒子胶状悬浮液与基因工程PP2A酶充分进行偶联吸附结合，反应结束后将微管放置在磁力架上以去除溶液，制得磁性纳米粒子修饰的PP2A酶。用上述结合缓冲液清洗制得的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，以去除为与磁性纳米粒子结合的PP2A酶。

清洗表面具有工作电极、参比电极和对电极的PVC膜基体，烘干备用。将0.2g琼脂糖加入到100ml pH8.0的Tris–HCl缓冲液中，65℃加热4min，充分溶解后得琼脂糖溶液。将制得的琼脂糖溶液室温下放凉，待该琼脂糖溶液降温至20℃时，将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶加入到琼脂糖溶液中并充分混合形成1.5个单位/ul酶混合液。上述混合液3℃放置13h后，取2ul滴涂于工作电极表面，室温下干燥成膜4h。干燥后用双蒸水冲洗两遍，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化PP2A酶电极在4℃下保存备用。

实施例5：

将15ul直径为300nmNi-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入预装有150ul结合缓冲液的微管中，充分混匀后，将该微管放置在磁力架上，以去除微管中的液体，这样就完成了磁性纳米粒子的清洗，按照上述步骤重复清洗一次，以充分去除非特异性结合，其中该结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，溶液含有500mM NaCl和0.09%叠氮化钠。

Ni-IDA磁性纳米粒子充分清洗后，将0.5ml1个单位/ul PP2A酶溶液加入到微管中，以800转/min速转速震摇微管15min，以使磁性纳米粒子胶状悬浮液与基因工程PP2A酶充分进行偶联吸附结合，反应结束后将微管放置在磁力架上以去除溶液，制得磁性纳米粒子修饰的PP2A酶。用上述结合缓冲液清洗制得的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，以去除为与磁性纳米粒子结合的PP2A酶。

清洗表面具有工作电极、参比电极和对电极的PVC膜基体，烘干备用。将0.1g琼脂糖加入到100ml pH8.4的Tris–HCl缓冲液中，55℃加热6min，充分溶解后得琼脂糖溶液。将制得的琼脂糖溶液室温下放凉，待该琼脂糖溶液降温至25℃时，将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶加入到琼脂糖溶液中并充分混合形成1个单位/ul酶混合液。上述混合液4℃放置12h后，取3ul滴涂于工作电极表面，室温下干燥成膜5h。干燥后用双蒸水冲洗两遍，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化PP2A酶电极在4℃下保存备用。

实施例6：

将20ul直径为270nmNi-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入预装有200ul结合缓冲液的微管中，充分混匀后，将该微管放置在磁力架（Adem Mag SV magnetic support,法国）上，以去除微管中的液体，这样就完成了磁性纳米粒子的清洗，按照上述步骤重复清洗一次，以充分去除非特异性结合，其中该结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，溶液含有500mM NaCl和0.09%叠氮化钠。

Ni-IDA磁性纳米粒子充分清洗后，将0.5ml1个单位/ul PP2A酶溶液加入到微管中，以800转/min速转速震摇微管20min，以使磁性纳米粒子胶状悬浮液与基因工程PP2A酶充分进行偶联吸附结合，反应结束后将微管放置在磁力架上以去除溶液，制得磁性纳米粒子修饰的PP2A酶。用上述结合缓冲液清洗制得的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，以去除为与磁性纳米粒子结合的PP2A酶。

清洗表面具有工作电极、参比电极和对电极的PVC膜基体，烘干备用。将0.2g琼脂糖加入到200ml pH8.0的Tris–HCl缓冲液中，60℃加热4min，充分溶解后得琼脂糖溶液。将制得的琼脂糖溶液室温下放凉，待该琼脂糖溶液降温至27℃时，将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶加入到琼脂糖溶液中并充分混合形成1个单位/ul酶混合液。上述混合液5℃放置11h后，取2.5ul滴涂于工作电极表面，室温下干燥成膜6h。干燥后用双蒸水冲洗两遍，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化PP2A酶电极在4℃下保存备用。

实施例7：

取90ul不同浓度的大田软海绵酸标准液（0.1，0.2，0.4，0.8，1,2，4，10，20μg/L，西格玛奥德里奇公司，美国）和10ul50mM对硝基苯磷酸二钠盐底液充分混合后滴加在工作电极上，室温下育温20min使之形成反应层，利用循环伏安法或计时电流法检测上述生物传感器中电流的变化，通过测定电流值来评价试样中大田软海绵酸的浓度。由本实施例可的PP2A酶活性抑制率（%）与标准液中大田软海绵酸浓度成良好的相关性（图4），检测时，重复以上步骤，通过测定加入检测样品时，电流值的变化来评价样品中大田软海绵酸的浓度。利用本发明中的固定化PP2A酶传感器检测水产品大田软海绵酸，其检出限低于1.00μg/L、重现性RSD<5%，检测耗时小于0.5h。

Claims (10)

1.一种用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器，包括绝缘性基体、形成在该基体上的含有工作电极、参比电极和对电极的电极系统，其特征在于，所述工作电极上固定有生物酶层，该生物酶层包括磁性纳米粒子修饰的蛋白磷酸酶2A（PP2A）以及电子传递体，所述磁性纳米粒子的直径为250nm～350nm。

2.如权利要求1所述的酶传感器，其特征在于，所述磁性纳米粒子为镍修饰磁性纳米粒子，而所述PP2A酶蛋白质链氨基末端修饰有能与所述镍修饰磁性纳米粒子共轭链接的hexa-His。

3.如权利要求2所述的酶传感器，其特征在于，所述镍修饰磁性纳米粒子的直径为300nm。

4.如权利要求1所述的酶传感器，其特征在于，所述电子传递体为对硝基苯磷酸二钠盐。

5.如权利要求1或2或4所述的酶传感器，其特征在于，所述参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为石墨电极。

6.一种如权利要求2所述的用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器的制备方法，其特征在于，首先将镍修饰的磁性纳米粒子与所述PP2A酶偶联吸附连接形成磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，然后将该磁性纳米粒子修饰的PP2A酶通过光交联法或琼脂糖包埋法固定在所述工作电极上。

7.如权利要求6所述的酶传感器的制备方法，其特征在于，所述镍修饰的磁性纳米粒子与所述PP2A酶偶联吸附连接包括以下步骤：

（1）将15～30ul的Ni-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入到预装有150～300ul结合缓冲液的容器中，并用所述结合缓冲液清洗，以去除非特异性结合，所述结合缓冲液的pH为8-8.5，含有Tris–HCl、NaCl以及叠氮化钠；

（2）将1～2个单位PP2A酶/ul的PP2A酶溶液加入到所述容器中，以600～1000转/min的转速震摇所述容器10-20min，以使所述磁性纳米粒子与所述PP2A酶充分偶联吸附结合形成磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，所述PP2A酶溶液与所述NI-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液的体积比为50～100:3，所述1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（3）用所述结合缓冲液清洗所述磁性纳米粒子，以去除未结合的所述PP2A酶。

8.如权利要求7所述的酶传感器的制备方法，其特征在于，所述结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，该Tris溶液含有500mM NaCl和0.09%叠氮化钠。

9.如权利要求6所述的酶传感器的制备方法，其特征在于，所述光交联法包括以下步骤：

（1）将所述磁性纳米粒子修饰的PP2A酶溶解在pH8～8.5缓冲液A中制成1～2个单位/ul的固定酶溶液，在该酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶与所述PVA-AWP的质量比为1～2:1，均质后形成固定溶液，所述缓冲液A包含Tris–HCl、EDTA以及MgCl₂，所述1单位磁性纳米粒子修饰的PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（2）然后滴加2.5～3.5ul所述固定溶液至工作电极表面，3～5℃下在功率为12～15W的日光灯下照射3～6h；

（3）光照后，3～5℃下干燥12～24h，干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，最后将制得的固定化磁性纳米粒子修饰的PP2A酶电极在4℃下保存备用。

10.如权利要求6所述的酶传感器的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖包埋法包括以下步骤：

（1）将0.1～0.2g琼脂糖加入到50～100ml pH为8～8.7的Tris–HCl缓冲液中，55～65℃加热4～6min，充分溶解后得琼脂糖溶液，待该琼脂糖溶液降温至20～27℃时，将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶加入到琼脂糖溶液中并充分混合形成混合液，该混合液中磁性纳米粒子修饰的PP2A酶的浓度为1～2个单位PP2A酶/ul，其中所述1单位磁性纳米粒子修饰的PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（2）上述混合液3～5℃放置11～13h后，取2.5～3.5ul滴涂于所述工作电极表面，室温下干燥成膜5～6h；

（3）干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化磁性纳米粒子修饰的PP2A酶电极在4℃下保存备用。