CN104977260A - 一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术。本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术为对不同物种的抗凝血样品进行预处理，利用透射光谱扫描测定样品在特定波长光谱的光吸收，判断样品物种来源。本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术基于不同物种的血液样品自身成分的差异，利用透射光谱扫描测定样品在特定波长位置的光吸收，判断样品物种来源，实现血液样品的物种来源的鉴别。与现有技术相比，本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术操作简单、快捷，鉴定结果稳定可靠，应用范围广，适用于血液制品的管理和海关进出口行业中不同物种血液样品的检测。

Description

一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术。

背景技术

中国血液制品行业发展迅速，当前，我国在血液制品产业上的监管日益严格，措施及整治方案频出。如《关于进一步加强人体血液、组织器官管理有关问题的通知》（卫药发（1996）27号）《艾滋病防治条例》第三十七条规定：进口人体血液、血浆、组织、器官、细胞、骨髓等，应当经过国务院卫生主管部门批准。《通知》中第一条规定：人体血液的采集、供应、加工生产和进出口均由卫生部统一归口管理；血液和血液制品的进出口没有卫生部的批件或证书，任何单位均不得经营，口岸药检所不得接受报验，海关不予放行。技术部门需对进出口物品的生物安全性做技术审核。

但是在国家管理和控制领域仍然存在一些问题。《中华人民共和国进出口动植物检疫条例》虽然涵盖了动物来源的血液样品的检疫要求，但没有给出相关的检测方法。而随着科技的发展，我国对我国的多样性的生物资源的保护也越来越重视。现阶段我国特有和稀有物种的血液制品存在着流失的可能。而进口的血液制品也存在一定隐患。此外没有管理控制的进口血液制品也有可能成为生物入侵途径，造成生物安全隐患。因此需要对我国的血液制品，特别是进出口血液制品做物种来源的分析。但是目前对于血液制品的物种来源除了现有的核酸聚合酶链式反应以外，没有一种快速高效的检测手段。而使用核酸聚合酶链式反应在稀有样品的采样中存在困难。因此有必要开发一种快速高效的鉴别血液样品物种来源的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术，对不同物种的抗凝血样品进行预处理，利用透射光谱扫描测定样品在特定波长光谱的光吸收，判断样品物种来源。

优选的，所述特定波长为300nm～700nm。

优选的，所述特定波长为344nm、405nm和544nm。

优选的，所述预处理为对抗凝血样品按30倍～40倍的稀释倍数进行稀释。

优选的，所述抗凝血样品为以柠檬酸钠、肝素或EDTA为抗凝剂制备的抗凝血样品。

优选的，所述抗凝血样品为新鲜采集的样品。

优选的，所述抗凝血样品为全血。

优选的，本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术，还包括应用不同物种血液样品的标准质控品对检测仪器进行标定的步骤。

优选的，所述鉴别技术具体为对不同物种的以EDTA为抗凝剂的新鲜采集全血按30倍的稀释倍数进行稀释，利用透射光谱扫描测定样品在344nm、405nm和544nm光谱的光吸收，判断样品物种来源；

若在344nm下的光吸收范围为3.459±0.170，则为小鼠；

若在344nm下的光吸收范围为2.882±0.396，则为大鼠；

若在344nm下的光吸收范围为3.502±0.292，则为恒河猴。

本发明还提供了一种用于不同物种血液样品光谱学鉴别的稀释液，由pH值为7.2的缓冲液、氯化钠、氯化钾、EDTA、牛血清白蛋白组成。

本发明提供了一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术对不同物种的抗凝血样品进行预处理，利用透射光谱扫描测定样品在特定波长光谱的光吸收，判断样品物种来源。本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术基于不同物种的血液样品自身成分的差异，利用透射光谱扫描测定样品在特定波长位置的光吸收，判断样品物种来源，实现血液样品的物种来源的鉴别。与现有技术相比，本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术操作简单、快捷，鉴定结果稳定可靠，应用范围广，适用于血液制品的管理和海关进出口行业中不同物种血液样品的检测。

附图说明

图1示实施例2中10倍倍比稀释的血液样品的透射光谱扫描图；

图2示实施例2中30倍倍比稀释的血液样品的透射光谱扫描图；

图3示实施例3中小鼠30倍倍比稀释的血液样品的透射光谱扫描图；

图4示实施例3中大鼠30倍倍比稀释的血液样品的透射光谱扫描图；

图5示实施例4中不同抗凝剂采集的大鼠血液30倍倍比稀释的血液样品的透射光谱扫描图；

图6示实施例6中洗涤处理对血液样品透射光谱扫描影响的结果图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

血液是在循环系统、心脏和血管腔内循环流动的一种组织，由血浆和血细胞组成。血浆内含血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原）、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧、激素、酶、抗体和细胞代谢产物等。血细胞有红细胞、白细胞和血小板。这些血液成分在不同物种的血液中存在可鉴别光谱学差异。

但是用分光光度计对血液制品进行检测时，一束单色光垂直照射某物质的溶液后，一部分光被体系吸收。由于样品溶液的本身性质不同，便可测得该物种特定波长相对应的光吸收。将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该样品的吸收光谱曲线。

对于不同物种的血液样品由于其自身成分存在差异，不同物种血液样品就有其特异的吸收光谱曲线，不同血液样品在特定波长位置可能存在物种差异，利用此差异可以实现血液样品的物种来源的鉴别。

因此本发明提供了一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术，对不同物种的抗凝血样品进行预处理，利用透射光谱扫描测定样品在特定波长光谱的光吸收，判断样品物种来源。

不同物种的血液样品其透射光谱存在一定差异，其中本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术所述特定波长为300nm～700nm。

进一步的，本申请使用EDTA抗凝法，分别无菌采集大鼠、小鼠和恒河猴的血液样品，利用透射光谱扫描测定样品的光吸收，结果显示，不同物种的血液样品在344nm、405nm和544nm存在着透射光谱的差异，这些差异在特定波长有一定统计学意义。因此本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术所述特定波长为344nm、405nm和544nm。

在一些实施例中所述特定波长为344nm。在一些实施例中所述特定波长为405nm。在一些实施例中所述特定波长为544nm。

本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中所述预处理为对抗凝血样品进行有限稀释。而不同稀释倍数的血液样品的透射光谱扫描结果存在差异。本申请采用稀释剂对血液样品进行有限稀释，然后对不同稀释倍数的血液样品进行透射光谱扫描，结果显示较低稀释倍数时（1倍～10倍），不同来源的血液样品均无明显的检测特征，光线透过率差。在稀释倍数在30倍～40倍时，不同来源的血液样品有明显的特异性光吸收，可作为物种来源的鉴别检测特征。而在较高稀释倍数时（50倍～100倍时），不同来源的血液样品的特异性光吸收消失，无法物种来源的鉴别检测特征。因此，本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中所述预处理优选为对抗凝血样品按30倍～40倍的稀释倍数进行稀释。在一些实施例中为按30倍的稀释倍数进行稀释。在一些实施例中为按35倍的稀释倍数进行稀释。在一些实施例中为按40倍的稀释倍数进行稀释。

本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中所述预处理中所述稀释的稀释液为包含抗凝剂的稀释液。

进一步的，上述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中，所述稀释液还包括pH值为7.2的缓冲液。所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可以为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液。

在一些实施方案中，上述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中，所述稀释液由pH值为7.2的缓冲液、氯化钠、氯化钾、EDTA、牛血清白蛋白（BSA）组成。

在某些具体实施例中，上述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中，所述稀释的稀释液每升含有：

本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中不同物种血液样品的透射光谱扫描测定数据还受到血液样品的抗凝方式的影响。本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中所述抗凝血样品优选为以柠檬酸钠、肝素或EDTA为抗凝剂制备的抗凝血样品。

进一步的，本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中所述抗凝血样品为以EDTA为抗凝剂制备抗凝血样品。

按照本发明，上述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中，所述预处理的稀释液中的抗凝剂优选为柠檬酸钠、肝素或EDTA。更优选为EDTA。

进一步的，血液样品的新鲜度也会对本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中血液样品的透射光谱扫描测定数据造成影响。本申请使用EDTA作为抗凝剂采集大鼠血液，将抗凝血做30倍稀释，利用透射光谱扫描分别测定新鲜采集的样品、放置过夜后的样品和放置2-3天的样品在特定波长光谱的光吸收，结果显示，大鼠EDTA抗凝血新鲜采集的样品（1小时内测定）其透射光在344nm处光吸收较高，而低温放置过夜后（24小时内）再测量，在344nm处的光吸收明显下降。放置2-3天的样品光吸收数据较稳定，与低温放置过夜后的样品光吸收结果相似。因此，本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中所述抗凝血样品优选为新鲜采集的样品。

进一步的，血浆成分对于血液样品的透射光谱数值也会造成影响，血液样品的洗涤处理会干扰血液样品的透射光谱信息。因此本发明所述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中，所述抗凝血样品优选为未经洗涤处理的全血。

按照本发明，在一些实施方案中，对不同物种的以EDTA为抗凝剂的新鲜采集全血按30倍的稀释倍数进行稀释，利用透射光谱扫描测定样品在344nm、405nm和544nm光谱的光吸收，判断样品物种来源；

若在344nm下的光吸收范围为3.459±0.170，则为小鼠；

若在344nm下的光吸收范围为2.882±0.396，则为大鼠；

若在344nm下的光吸收范围为3.502±0.292，则为恒河猴。

在一些实施方案中，上述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中，还包括应用不同物种血液样品的标准质控品对检测仪器进行标定的步骤。

按照本发明，上述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中，所述标准质控品的制备方法具体为采用EDTA抗凝法无菌采集血液样品，使用稀释保存液对血液样品做35倍稀释，2℃-8保存。

其中，上述稀释保存液包括抗凝剂、pH值7.2的缓冲液、氯化钠、氯化钾、牛血清白蛋白和叠氮钠（NaN₃）。所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可以为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液。

在一些实施方案中，上述稀释保存液由磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液、氯化钠、氯化钾、EDTA、BSA和NaN3组成。

在某些具体实施例中，上述稀释保存液为添加有0.05g/L NaN3的稀释液，其具体为每升含有：

按照本发明，在一些实施方案中，上述不同物种血液样品光谱学鉴别技术中，所述血液样品来源于大鼠、小鼠或恒河猴。其中，所述大鼠可以为近交品系大鼠，包括ACI、BVF、F344、PA、M520、WAB、WAC、WKA、SD、RF等品系；也可以为非近交品系大鼠，包括Wistar大鼠、Sherman大鼠、Oshorne-Mendel大鼠、Sprague Dawley大鼠、Long Evans大鼠、August大鼠。所述小鼠可以为远交群小鼠，包括昆明小鼠（KM）、NIH小鼠、LACA小鼠；也可以为近交品系品系，包括AKR小鼠、BALB／c小鼠、C3H小鼠、C57BL小鼠、DBA小鼠、TA1小鼠、TA2小鼠、615小鼠等。

本发明还提供了一种用于不同物种血液样品光谱学鉴别的稀释液，包含抗凝剂。

进一步的，上述用于不同物种血液样品光谱学鉴别的稀释液中，所述稀释液还包括pH值为7.2的缓冲液。所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可以为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液。

在一些实施方案中，上述用于不同物种血液样品光谱学鉴别的稀释液中，所述稀释液由pH值为7.2的缓冲液、氯化钠、氯化钾、EDTA、牛血清白蛋白（BSA）组成。

在某些具体实施例中，上述用于不同物种血液样品光谱学鉴别的稀释液中，所述稀释的稀释液每升含有：

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细说明。

实施例1：血液样品稀释液的制备

使用上述稀释液对利用EDTA抗凝剂法采集的不同的血液样品进行不同稀释度的稀释。

实施例2：血液样品稀释倍数确定

取实施例1制得的稀释液对血液样品进行有限稀释，稀释倍数包括原倍（×1）、5倍（×5）、10倍（×10）、20倍（×20）、30倍（×30）、35倍（×35）、40倍（×40）、50倍（x50）、100倍（×100）。对不同稀释倍数的血液样品进行透射光谱扫描，结果见表1。

表1不同稀释倍数的血液样品透射光谱扫描结果

注：“-”为无明显的检测特征；“√”有明显的特异性光吸收。

由上述结果可见，上述稀释样品分别进行透射光谱扫描，在较低稀释倍数时（1倍～10倍），不同来源的血液样品均无明显的检测特征（如图1所示），光线透过率差。在稀释倍数在30倍～40倍时，不同来源的血液样品有明显的特异性光吸收（如图2所示），可作为物种来源的鉴别检测特征。而在较高稀释倍数时（50倍～100倍时），不同来源的血液样品的特异性光吸收消失，无法物种来源的鉴别检测特征。

进一步的，经多次试验证明在稀释倍数35倍时稀释样品不同来源的血液样品特异性光吸收最明显。

实施例3：鉴定波长的确定

使用EDTA抗凝法，分别无菌采集大鼠、小鼠和恒河猴的血液样品，采用实施例1制得的稀释液对采集的血液样品进行30倍倍比稀释，然后利用透射光谱扫描测定样品在特定波长光谱的光吸收，结果见图3和图4。

对小鼠和大鼠EDTA抗凝血（采集24小时内测定）吸收光谱做分析，结果显示，两个物种的透射光谱有相似性。两个物种血液样品在可见光范围内均存在数个吸收峰，吸收峰的位置相似，分别在344、405和544nm位置。而在特征波峰的光吸收范围有一定差异，统计结果见表2。

表2大鼠、小鼠和恒河猴特征波峰的光吸收范围的差异

小鼠和大鼠的血液样品在344nm处的光吸收值比较存在统计学差异（P＜0.05），大鼠血液在405nm处的光吸收略低于小鼠血液，但无统计学差异，小鼠和大鼠在544nm处的光吸收值无明显差异。405nm与344nm波长（两个波峰）的比值在大鼠和小鼠的物种之间存在统计学差异。

而恒河猴血液样品（EDTA抗凝，采集24小时内测定）的透射光谱显示，猴血344nm处光吸收与小鼠血样接近，也高于大鼠344nm光吸收；在405nm的光吸收高于大鼠和小鼠；而在544nm处的光吸收也高于大鼠和小鼠。

由上述数据，不同物种的血液样品在344nm、405nm和544nm存在着透射光谱的差异，这些差异在特定波长有一定统计学意义，可以作为血液样品物种来源的鉴别指征。

实施例4：不同的抗凝剂对于血液样品的透射光谱的影响。

分别使用柠檬酸钠、肝素和EDTA三种抗凝剂采集大鼠血液，将抗凝血做30倍稀释，透射光谱扫描测定样品在特定波长光谱的光吸收，结果如图5所示。

由图5结果可见，大鼠新鲜采集的血液样品在400nm-445nm范围内的透射光下的吸收光谱图像一致。但是在344nm、544nm及577nm处的光吸收存在差异。且以EDTA为抗凝剂采集的血液样品在上述3个波长下的吸收峰的位置要高于以枸橼酸钠和肝素为抗凝剂采集的血液样品。表明不同抗凝剂的使用会对血液样品透射光谱数据信息产生影响。

实施例5：血液采集与测试时间间隔对测试结果的影响。

使用EDTA作为抗凝剂采集大鼠血液，将抗凝血做30倍稀释，利用透射光谱扫描分别测定新鲜采集的样品、放置过夜后的样品和放置2-3天的样品在特定波长光谱的光吸收。

结果显示，大鼠EDTA抗凝血新鲜采集的样品（1小时内测定）其透射光在344nm处光吸收较高，而低温放置过夜后（24小时内）再测量，在344nm处的光吸收明显下降。放置2-3天的样品光吸收数据较稳定，与低温放置过夜后的样品光吸收结果相似。

实施例6：血液样品的洗涤处理对测试结果的影响

使用EDTA作为抗凝剂采集恒河猴血液，分为两份，一份为采用生理盐水进行洗涤，另一份未采用生理盐水进行多次洗涤（去除血浆成分），两份样品分别进行30倍稀释，然后利用透射光谱扫描分别测定特定波长光谱的光吸收，结果见图6。

结果显示，经生理盐水洗涤的血液样品在344nm处的吸收光明显降低，而在405nm处的光吸收吸收峰偏移，吸收峰面积减小，在544和577nm处的光吸收峰值也下降。表明，血浆成分对于血液样品的透射光谱数值有影响，血液样品的洗涤处理会干扰血液样品的透射光谱信息。

实施例7：不同物种标准血液样品的制备和保存

1、血液样品稀释保存液的制备

2、不同物种标准血液样品的制备和保存

使用EDTA抗凝法无菌采集血液样品，使用上述稀释保存液对血液样品做35倍稀释，2℃-8保存3个月。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种不同物种血液样品光谱学鉴别技术，其特征在于，对不同物种的抗凝血样品进行预处理，利用透射光谱扫描测定样品在特定波长光谱的光吸收，判断样品物种来源。

2.根据权利要求1所述的鉴别技术，其特征在于，所述特定波长为300nm～700nm。

3.根据权利要求1所述的鉴别技术，其特征在于，所述特定波长为344nm、405nm和544nm。

4.根据权利要求1所述的鉴别技术，其特征在于，所述预处理为对抗凝血样品按30倍～40倍的稀释倍数进行稀释。

5.根据权利要求1所述的鉴别技术，其特征在于，所述抗凝血样品为以柠檬酸钠、肝素或EDTA为抗凝剂制备的抗凝血样品。

6.根据权利要求1所述的鉴别技术，其特征在于，所述抗凝血样品为新鲜采集的样品。

7.根据权利要求1所述的鉴别技术，其特征在于，所述抗凝血样品为全血。

8.根据权利要求1所述的鉴别技术，其特征在于，还包括应用不同物种血液样品的标准质控品对检测仪器进行标定的步骤。

9.根据权利要求1所述的鉴别技术，其特征在于，所述方法具体为对不同物种的以EDTA为抗凝剂的新鲜采集全血按30倍的稀释倍数进行稀释，利用透射光谱扫描测定样品在344nm、405nm和544nm光谱的光吸收，判断样品物种来源；

若在344nm下的光吸收范围为3.459±0.170，则为小鼠；

若在344nm下的光吸收范围为2.882±0.396，则为大鼠；

若在344nm下的光吸收范围为3.502±0.292，则为恒河猴。

10.一种用于不同物种血液样品光谱学鉴别的稀释液，其特征在于，由pH值为7.2的缓冲液、氯化钠、氯化钾、EDTA、牛血清白蛋白组成。