CN104977238A - 脉冲延迟自适应校准装置、方法和细胞分析仪 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脉冲延迟自适应校准装置、方法和细胞分析仪，所述方法包括：获取细胞分析仪的工作环境参数；根据获取的工作环境参数，向细胞分析仪提供相同工作环境条件下非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值；将脉冲延迟粗校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上。本发明通过自适应校准方法，精确地找出多通道脉冲信号的延迟时间，节省了脉冲延时电路部分的硬件资源。同时，脉冲经过模数转换之后的不经过延时对齐的原始波形数据可以得到完好的保存，能够更方便地支持后续的数据分析与比对。

Description

脉冲延迟自适应校准装置、方法和细胞分析仪

技术领域

本发明涉及细胞分析仪器领域，具体涉及一种脉冲延迟自适应校准装置、方法和细胞分析仪。

背景技术

流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种可以对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析仪器。

如图1所示，在流式细胞仪中，液路单元将待测的经过荧光染色后的细胞制成悬液，通过液体的压力差别将待测样本快速平稳地注入流动室，通过液流的鞘流技术将待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。系统通常以红蓝两路或多路激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生前向、侧向散射光和多种荧光信号，反映了细胞的各种特征信息，通过利用光电转换电路（光电二极管或光电倍增管）将光信号转换成脉冲电信号，通过数据处理单元对放大的脉冲电信号进行分析，就可以得到细胞分类和数目等信息，通过主控单元送到PC上来进行显示。

具体地，当有一个粒子或细胞通过流动室中的细胞检测区时，将在各个数据通道产生一组脉冲数据，称之为一个事件（event）。其中光信号的强度决定了脉冲的高度，粒子在激光束中的行走时间决定了脉冲的宽度，因此粒子或细胞产生的散射光或荧光总量决定了脉冲面积（强度和时间）。脉冲的高度、面积等信息可在数据处理单元通过脉冲识别算法来实现。

现有技术中，脉冲识别通常采用阈值法，在用户选定的参考通道根据用户设定的阈值检出一个脉冲的起始和结束，起始点和结束点之间时间的宽度为时间窗W。脉冲的脉冲幅值，即高度H，为时间窗内最大的数据点值减去基线值（即图2中所示波形左边的实线部分），为了在计算脉冲面积时不遗漏阈值（即图2中所示的虚线）以下基线以上的部分（如图2中所示的圆形圈选部分），需要将时间窗在脉冲起始点和结束点前后进行适当扩展，前后扩展的时间称为扩展时间窗E。

如图1所示，现有的一种流式细胞仪具有8个数据通道，其中有6个蓝光通道（如图1所示的FSC、SSC、FL1、FL2、FL3和FL5通道），2个红光通道（如图1所示的FL4和FL6通道），红色激光器和蓝色激光器通过透镜会聚到流动室检测区域的两个光斑之间会有200um左右的距离，当粒子或细胞随液流经过照射区时，先后经过蓝光和红光光斑，从而使得红光通道的脉冲数据与蓝光通道脉冲数据之间会有一定时间间隔的延迟，具体延迟时间受液体流速和激光器距离等因素影响。流式细胞仪中液流的流速通常在6m/s左右，因此，红光通道和蓝光通道的延迟时间通常在几十微秒，如图3所示。在脉冲计算过程中，为了得到同一个粒子或细胞在各个通道的特征信息，需要精确得到同一个粒子或细胞产生的脉冲信息在不同数据通道的延迟时间。

目前对于细胞分析系统中不同激光脉冲数据通道之间的脉冲延迟时间，通常根据不同激光器光斑之间的距离和样本流速来计算得到不同数据通道间的延时参数，在启动测量前将不同的脉冲延迟参数写入脉冲计算单元的延迟电路中，延迟电路根据脉冲延迟参数对不同数据通道的脉冲数据进行延迟，对齐不同脉冲数据通道的数据后进行脉冲计算，得到同一个粒子在各个通道的特征信息。

然而，这种处理方式明显具有以下缺陷：

1、针对流速波动引入的扩展窗会由于不同流速产生不同的波动，沿用固定的扩展窗存在一定缺陷；

2、该处理方式未考虑温度等环境因素对脉冲延迟时间造成的影响，经测试，不同温度下，脉冲延迟的变化量不容忽视；

3、如果综合考虑上述两个因素的影响，扩展窗的设置值会比较大，扩展窗不断增加，会导致纳入参数计算的点数增多，引入更多的噪声点，影响计算结果；同时，扩展窗重叠会导致粒子的丢弃，如果脉冲识别的扩展窗太大，会导致脉冲丢弃率上升，最高脉冲计算速度同时受到影响；

4、实际工作过程中，仪器由于温度变化造成激光器光斑距离漂移，液路流速波动等因素会引起延时参数的波动，默认固定延迟参数很难校准的比较精确，因此，会导致计算结果出现一定程度的偏差。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术中各种因素引起的脉冲延迟波动，提供一种脉冲延迟自适应校准装置、方法和细胞分析仪，更好的解决脉冲识别过程中由于不同因素引起的脉冲延迟参数波动造成的计算结果偏差。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种脉冲延迟自适应校准方法，用于对细胞分析仪中的基准激光器和非基准激光器之间的脉冲延迟进行校准，包括：

获取细胞分析仪的工作环境参数；

根据获取的工作环境参数，向细胞分析仪提供相同工作环境条件下非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值；

将脉冲延迟粗校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上。

一种脉冲延迟自适应校准装置，用于对细胞分析仪中的基准激光器和非基准激光器之间的脉冲延迟进行校准，包括：

环境监控单元，用于获取细胞分析仪的工作环境参数，发送给主控单元；

主控单元，用于向细胞分析仪提供非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟校准值；

所述主控单元包括粗校准值存储模块，用于存储预先在各种不同工作环境条件下测得的非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟参数，还用于根据环境监控单元获取的工作环境参数，通过匹配查询，获取相同工作环境条件下的脉冲延迟参数，作为非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值，提供给细胞分析仪。

一种具有脉冲延迟自适应校准功能的细胞分析仪，包括以上所述的脉冲延迟自适应校准装置，还包括机箱以及安装于机箱内的液路单元、脉冲识别计算单元和多个激光器；

所述脉冲延迟自适应校准装置的环境监控单元连接于机箱、液路单元或激光器上；

所述多个激光器中的一个为基准激光器，其余为非基准激光器；

所述脉冲识别计算单元与脉冲延迟自适应校准装置的主控单元连接，用于对每个激光器的多个数据通道进行脉冲识别以输出脉冲信号；还用于将主控单元提供的非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上。

本发明提供的脉冲延迟自适应校准装置、方法和细胞分析仪，通过自适应校准方法，精确地找出多通道脉冲信号的延迟时间，每一个脉冲信号都带有了一个精确的脉冲延迟校准值，利用这个脉冲延迟校准值就可以找出多通道脉冲信号的一一对应关系，不需要在流式细胞仪中增加脉冲延时电路以使多通道脉冲信号的延时物理对齐，省去了脉冲延时电路部分的硬件资源。同时，脉冲经过模数转换之后的不经过延时对齐的原始波形数据可以得到完好的保存，能够更方便地支持后续的数据分析与比对。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为流式细胞仪原理框图。

图2为脉冲识别示意图。

图3为不同数据通道脉冲延迟示意图。

图4为本发明实施例一提供的一种脉冲延迟自适应校准方法的流程示意图。

图5为本发明实施例二提供的一种具有脉冲延迟自适应校准功能的细胞分析仪的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在流式细胞仪的脉冲识别过程中，由于粒子流过液路单元过程中不同激光器照射会产生不同数据通道脉冲信号有一定时间的延迟。液体流速、温度等因素的变化会引起脉冲延迟时间的变化，使得脉冲计算的结果有偏差，影响成像质量和计算结果。本发明的目的在于，提供一种脉冲延迟自适应校准装置、方法和流式细胞仪系统，更好的解决脉冲识别过程中由于不同因素引起的脉冲延迟参数波动造成的计算结果偏差。

实施例一

如图4所示，本发明实施例提供了一种脉冲延迟自适应校准方法，用于对细胞分析仪中的基准激光器和非基准激光器之间的脉冲延迟进行校准。

本发明实施例中，所述细胞分析仪特指流式细胞仪，该流式细胞仪具有一个蓝光激光器和一个红光激光器，本发明选取红光激光器为基准激光器，蓝光激光器为非基准激光器，应当指出的是，在流式细胞仪的实际工作过程中，也可选择蓝光激光器为基准激光器，红光激光器为非基准激光器，本发明实施例仅仅是为了方便说明，选取了其中一种情况。其中，红光激光器发出的激光光束通过照射经过流式细胞仪的样本流，生成FL4和FL6两个数据通道；蓝光激光器发出的激光光束通过照射经过流式细胞仪的样本流，生成FSC、SSC、FL1、FL2、FL3和FL5六个数据通道。具体地，本发明实施例包括以下步骤：

S1、获取流式细胞仪的工作环境参数；

S2、根据获取的工作环境参数，向细胞分析仪提供相同工作环境条件下非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值；

S3、计算非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值；

S4、将脉冲延迟粗校准值和脉冲延迟细校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上。即将脉冲延迟粗校准值和脉冲延迟细校准值分别叠加到蓝光激光器生成FSC、SSC、FL1、FL2、FL3和FL5六个数据通道中输出的脉冲信号上。

需要说明的是，由于脉冲延迟一定需要选取一个参考目标为基准才能进行校准，本领域技术人员应当知道，基准激光器和非基准激光器并不是绝对的，流式细胞仪中的任何一个激光器均可以被选取为基准激光器；同时，非基准激光器也可以有多个，每一个非基准激光器均可分别按照本发明实施例提供的方法，以同一个基准激光器为基准，进行脉冲延迟校准工作。

由于在实际测量中，同一个激光器的多个数据通道之间不存在延迟或延迟小到几乎可以忽略，因此，为简化计算，可以分别从基准激光器和非基准激光器的数据通道中选取一个典型数据通道作为代表，进行计算；得出的两数据通道间的脉冲延迟粗校准值和脉冲延迟细校准值，即为两激光器间的脉冲延迟粗校准值和脉冲延迟细校准值。

具体地，在S1中，所述工作环境参数包括流式细胞仪的机箱温度、液路流量、激光器温度。由于在流式细胞仪中，激光器的温度可以通过PID控制器（比例、积分、微分控制器）严格控制，且激光器的温度对脉冲延迟的影响相对较小，所以在本发明实施例中，忽略激光器温度，选用机箱温度和液路流量两个参量对脉冲延迟进行校准。

在S2中，所述向流式细胞仪提供的相同工作环境条件下的脉冲延迟粗校准值，为流式细胞仪在对应的工作环境参数条件下进行脉冲识别时，非基准激光器的数据通道中的脉冲信号和基准激光器的数据通道中的脉冲信号间的脉冲延迟参数，是通过测量统计或拟合计算得到的，测量统计或拟合计算可以是预先进行的也可以是实时进行的；通过查询相同的工作环境参数，向细胞分析仪提供对应的脉冲延迟参数作为脉冲延迟粗校准值。

具体地，在本发明实施例中，采用测量统计的方法获取脉冲延迟粗校准值。具体地，可以预先建立一个两维的脉冲延迟参数表，脉冲延迟参数表的两个维度分别对应机箱温度和液路流量，在不同的工作环境参数条件下对非基准激光器和基准激光器的数据通道进行脉冲识别，获取各数据通道输出的脉冲信号；通过测量和对比运算获得不同的工作环境参数条件下的脉冲延迟参数并记录在表格中。在流式细胞仪开始脉冲识别前，根据获取的机箱温度和液路流量，在脉冲延迟参数表中查找对应的脉冲延迟参数，该脉冲延迟参数即为脉冲延迟粗校准值。

在另一个实施例中，还可以采用拟合计算的方法获取脉冲延迟粗校准值。具体地，在此例举两种拟合计算的方法，第一种方法为：针对每个常用的液路流量，建立一个关于脉冲延迟参数的直角坐标系，直角坐标系的横纵坐标分别对应为脉冲延迟参数和机箱温度，在对应的液路流量以及不同的机箱温度条件下对非基准激光器和基准激光器的数据通道进行脉冲识别，获取各数据通道输出的脉冲信号；通过测量和对比运算获得脉冲延迟参数并以坐标的形式记录在各对应的直角坐标系中；根据观察发现，一定的液路流量下，机箱温度和脉冲延迟参数基本上成线性关系；因此，可以根据各直角坐标系，拟合出不同液路流量下，机箱温度和脉冲延迟参数的关系式。在流式细胞仪开始脉冲识别前，根据获取的机箱温度和液路流量，将机箱温度代入对应液路流量下的关系式，得到脉冲延迟参数作为脉冲延迟粗校准值。

第二种方法为：建立一个三维直角坐标系，分别将液路流量、机箱温度和脉冲延迟参数作为三维直角坐标系的三条坐标轴。在不同的工作环境参数条件下对非基准激光器和基准激光器的数据通道进行脉冲识别，获取各数据通道输出的脉冲信号；通过测量和对比运算获得不同的工作环境参数条件下的脉冲延迟参数并记录在三维直角坐标系中；通过足够多的数据统计，采用拟合的方式得到液路流量、机箱温度和脉冲延迟参数的关系式。在流式细胞仪开始脉冲识别前，将获取的机箱温度和液路流量代入上述关系式，得到的脉冲延迟参数作为脉冲延迟粗校准值。

通过拟合计算获取脉冲延迟参数的实施方式既可以是预先处理的，也可以是实时处理的。具体地，采用预先处理的方式为：提前根据拟合计算出的关系式生成一个二维的延迟参数表，脉冲延迟参数表的两个维度分别对应机箱温度和液路流量，通过匹配相同的机箱温度和液路流量，可以得到当前的脉冲延迟粗校准值。采用实时处理的方式为：将当前的机箱温度和液路流量实时代入拟合计算出的关系式中，得到脉冲延迟粗校准值。

在S3中，计算非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值的方法包括：

S301、从基准激光器的多个数据通道中选取一个作为基准数据通道，从非基准激光器的多个数据通道中选取一个作为非基准数据通道；本发明实施例中，选取红光激光器的FL4通道作为基准数据通道，选取蓝光激光器的FL5通道作为非基准数据通道。

S302、根据脉冲延迟粗校准值，找到非基准数据通道上和基准数据通道上对应同一粒子的一对脉冲，计算所述一对脉冲的峰值偏差；

S303、重复S302，累积获取多对脉冲的峰值偏差，并计算峰值偏差的平均统计参数，其中，所述多对脉冲分别对应多个不同的粒子；所述平均统计参数可以是平均值或中位数等具有平均意义的统计参数，本实施例中选用峰值偏差的平均值作为平均统计参数；所述峰值偏差的平均值与脉冲延迟粗校准值的差即为非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值。

在S302中，查找非基准数据通道上和基准数据通道上对应同一粒子的一对脉冲的方法为：在基准数据通道的脉冲信号中选取一个脉冲作为参考脉冲；将S2中的脉冲延迟粗校准值叠加到非基准数据通道的脉冲信号上后，非基准数据通道的脉冲信号中与参考脉冲的位置基本一致的脉冲，为对应的同位脉冲；所述参考脉冲和同位脉冲是流经流式细胞仪的同一个粒子在不同数据通道上的信号体现，即为非基准数据通道上和基准数据通道上对应同一粒子的一对脉冲。如图3所示，假设蓝光通道和红光通道之间的脉冲延迟粗校准值为延迟时间Dt，将蓝光通道中脉冲信号的时间坐标信息加上延迟时间Dt后，在蓝光通道和红光通道上横坐标基本一致的两个脉冲，即为对应同一粒子的脉冲。

进一步地，为了保证细校准的精确度，还需对脉冲延迟细校准值的取值范围进行限定。本发明实施例中，所述脉冲延迟细校准值的取值范围为[-EW/2,EW/2]，其中，EW为流式细胞仪中设定的扩展时间窗；当脉冲延迟细校准值的实际值超出该取值范围时，取对应的边界值作为脉冲延迟细校准值。

实施例二

本发明还提供了一种具有脉冲延迟自适应校准功能的细胞分析仪。具体地，本发明实施例中，所述细胞分析仪为流式细胞仪。如图5所示，所述流式细胞仪包括脉冲延迟自适应校准装置，还包括机箱以及安装于机箱内的液路单元501、脉冲识别计算单元201和多个激光器601。液路单元501在流式细胞仪中主要承担样本输送功能，通过鞘流聚焦原理将被测细胞或微粒以一定流速，稳定、串行地通过多个激光器601照射的光学检测区，进而得到被测样本的信息。脉冲识别计算单元201则主要用于进行脉冲识别以识别输出多个不同数据通道的脉冲信号，进而进行脉冲计算。所述激光器601有两个，分别为红光激光器和蓝光激光器，其中，红光激光器被选取作为基准激光器，蓝光激光器为非基准激光器。

所述脉冲延迟自适应校准装置用于对不同因素引起的流式细胞仪的脉冲延迟参数波动进行校准，其主要包括：

环境监控单元，用于获取流式细胞仪的工作环境参数，发送给主控单元101；

主控单元101，用于向脉冲识别计算单元201提供非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟校准值；所述脉冲延迟校准值包括脉冲延迟粗校准值和脉冲延迟细校准值。

具体地，环境监控单元包括温度监控单元301，在温度监控单元301中带有多个温度传感器302，分别用于监测激光器601和机箱的温度。作为改进，所述流式细胞仪的激光器601上连接有温度PID控制模块，用于对激光器601进行温度PID控制，使激光器601的温度保持在相对恒定的温度，减少温度对光学系统的影响。当激光器601确定处于恒温状态时，则可不监控激光器601的温度，仅需使用温度传感器302实时监测机箱内的环境温度变化，将结果反馈给主控单元101。

进一步地，环境监控单元还包括流量监控单元401，用于获取液路单元501的液路流量。液路流量的获取途径即可以是通过传感器测量也可以是直接从流式细胞仪的相关功能模块中读取。具体地，所述流量监控单元401可以是安装于液路单元501内的流量传感器，用于实时监测液路单元501的液路流量，并将结果反馈给主控单元101。另一方面，可以在液路单元501上设置一流量控制单元，具体可以是流量控制阀，用于控制液路单元501的液路流量，当使用者将流量控制阀转换至不同档位时，液路单元501的液路流量随之调节；所述流量监控单元401与流量控制阀连接，用于根据流量控制阀所处的档位，获取对应的液路流量值，提供给主控单元101。

所述主控单元101包括粗校准值存储模块和细校准值计算模块，分别用于向脉冲识别计算单元201提供脉冲延迟粗校准值和脉冲延迟细校准值进而实现在脉冲计算过程中，对非基准激光器和基准激光器间的脉冲延迟进行粗补偿和细补偿。

具体地，所述粗校准值存储模块用于存储预先在各种不同工作环境条件下测得的非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟参数或其计算公式，还用于根据环境监控单元获取的工作环境参数进行数据匹配或代入计算，获取相同工作环境条件下的脉冲延迟参数，作为非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值，提供给脉冲识别计算单元201。本发明实施例中，脉冲延迟粗校准值是由机箱温度和液路流量共同决定的；可以预先建立一个两维的脉冲延迟参数表，脉冲延迟参数表的两个维度分别对应机箱温度（或机箱温度范围）和液路流量（或流量控制阀的档位），在不同的工作环境参数条件下进行脉冲识别，通过测量和对比运算获得不同的工作环境参数条件下的脉冲延迟参数并记录在表格中；测定的脉冲延迟参数表存储于粗校准值存储模块中。在流式细胞仪开始脉冲识别前，粗校准值存储模块首先利用环境监控单元读取机箱温度和液路流量，根据这两个数据在存储的脉冲延迟参数表中查找对应的脉冲延迟参数，并将该延迟参数作为脉冲延迟粗校准值提供给流式细胞仪的脉冲识别计算单元201，用于进行后续的脉冲计算。具体地，在进行脉冲计算时，脉冲识别计算单元201直接将脉冲延迟粗校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上，即可实现脉冲延迟的粗校准。

在本发明实施例中，脉冲识别计算单元201进行脉冲识别的过程如下：在开始识别前，选取红蓝两个激光器的典型通道，例如，蓝光选择前向角侧散光FSC通道，红光选择FL5荧光通道，在开始识别后，当上述通道上脉冲超过默认阈值时（例如，FSC通道阈值设定为2048，FL5通道阈值设定为128），认为脉冲有效。

在脉冲识别后，所述细校准值计算模块根据脉冲识别计算单元201输出的各数据通道的脉冲信号，计算脉冲延迟细校准值，并反馈给脉冲识别计算单元201。具体地，所述脉冲延迟细校准值的计算方法在实施例中已经说明，在此不再赘述。

为了保证细校准的精确度，还需对细校准中的脉冲延迟细校准值的取值范围进行限定。本发明实施例中，所述脉冲延迟细校准值的取值范围为[-EW/2,EW/2]，其中，EW为流式细胞仪中设定的扩展时间窗；当脉冲延迟细校准值的实际值超出该取值范围时，认为计算结果有误差，取对应的边界值作为脉冲延迟细校准值。

本发明提供的脉冲延迟自适应校准装置、方法和细胞分析仪，通过自适应校准方法，精确地找出多通道脉冲信号的延迟时间，每一个脉冲信号都带有了一个精确的脉冲延迟校准值，利用这个脉冲延迟校准值就可以找出多通道脉冲信号的一一对应关系，不需要在流式细胞仪中增加脉冲延时电路以使多通道脉冲信号的延时物理对齐，省去了脉冲延时电路部分的硬件资源。同时，脉冲经过模数转换之后的不经过延时对齐的原始波形数据可以得到完好的保存，能够更方便地支持后续的数据分析与比对。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (14)

1.一种脉冲延迟自适应校准方法，用于对细胞分析仪中的基准激光器和非基准激光器之间的脉冲延迟进行校准，其特征在于，包括：

获取细胞分析仪的工作环境参数；

根据获取的工作环境参数，向细胞分析仪提供相同工作环境条件下非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值；

将脉冲延迟粗校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：

计算非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值；

将脉冲延迟细校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上；

其中，计算非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值的方法包括：

从基准激光器的多个数据通道中选取一个作为基准数据通道，从非基准激光器的多个数据通道中选取一个作为非基准数据通道；

根据脉冲延迟粗校准值，找到非基准数据通道上和基准数据通道上对应同一粒子的一对脉冲，计算所述一对脉冲的峰值偏差；

重复上述步骤，累积获取多对脉冲的峰值偏差，并计算峰值偏差的平均统计参数，其中，所述多对脉冲分别对应多个不同的粒子；所述峰值偏差的平均统计参数与脉冲延迟粗校准值的差即为非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工作环境参数包括细胞分析仪的机箱温度和液路流量中的至少一个。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述工作环境参数还包括细胞分析仪的激光器的温度。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述向细胞分析仪提供的相同工作环境条件下的脉冲延迟粗校准值，为细胞分析仪在对应的工作环境参数条件下进行脉冲识别时，非基准激光器的数据通道中的脉冲信号和基准激光器的数据通道中的脉冲信号间的脉冲延迟参数，是通过测量统计或拟合计算得到的；通过匹配相同的工作环境参数，向细胞分析仪提供对应的脉冲延迟参数作为脉冲延迟粗校准值。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脉冲延迟细校准值的取值范围为[-EW/2,EW/2]，其中，EW为细胞分析仪中设定的扩展时间窗；当脉冲延迟细校准值的实际值超出该取值范围时，取对应的边界值作为脉冲延迟细校准值。

7.一种脉冲延迟自适应校准装置，用于对细胞分析仪中的基准激光器和非基准激光器之间的脉冲延迟进行校准，其特征在于，包括：

环境监控单元，用于获取细胞分析仪的工作环境参数，发送给主控单元；

主控单元，用于向细胞分析仪提供非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟校准值；

所述主控单元包括粗校准值存储模块，用于存储预先在各种不同工作环境条件下测得的非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟参数或其计算公式，还用于根据环境监控单元获取的工作环境参数进行数据匹配或代入计算，获取相同工作环境条件下的脉冲延迟参数，作为非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值，提供给细胞分析仪。

8.根据权利要求7所述的脉冲延迟自适应校准装置，其特征在于，所述环境监测单元包括温度监控单元和/或流量监控单元；

所述温度监控单元用于监测细胞分析仪的机箱温度；

所述流量监控单元用于获取细胞分析仪中的液路单元的液路流量。

9.根据权利要求8所述的脉冲延迟自适应校准装置，其特征在于，所述温度监控单元还用于监测细胞分析仪的激光器的温度。

10.根据权利要求7所述的脉冲延迟自适应校准装置，其特征在于，所述主控单元还包括细校准值计算模块，用于计算非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值，并反馈给细胞分析仪；

其中，计算非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值的方法包括：

从基准激光器的多个数据通道中选取一个作为基准数据通道，从非基准激光器的多个数据通道中选取一个作为非基准数据通道；

根据脉冲延迟粗校准值，找到非基准数据通道上和基准数据通道上对应同一粒子的一对脉冲，计算所述一对脉冲的峰值偏差；

重复上述步骤，累积获取多对脉冲的峰值偏差，并计算峰值偏差的平均统计参数，其中，所述多对脉冲分别对应多个不同的粒子；所述峰值偏差的平均统计参数与脉冲延迟粗校准值的差即为非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值。

11.根据权利要求10所述的脉冲延迟自适应校准装置，其特征在于，所述脉冲延迟细校准值的取值范围为[-EW/2,EW/2]，其中，EW为细胞分析仪中设定的扩展时间窗；当脉冲延迟细校准值的实际值超出该取值范围时，取对应的边界值作为脉冲延迟细校准值。

12.一种具有脉冲延迟自适应校准功能的细胞分析仪，其特征在于，包括权利要求7至11任一所述的脉冲延迟自适应校准装置，还包括机箱以及安装于机箱内的液路单元、脉冲识别计算单元和多个激光器；

所述脉冲延迟自适应校准装置的环境监控单元连接于机箱、液路单元或激光器上；

所述多个激光器中的一个为基准激光器，其余为非基准激光器；

所述脉冲识别计算单元与脉冲延迟自适应校准装置的主控单元连接，用于对每个激光器的多个数据通道进行脉冲识别以输出脉冲信号；还用于将主控单元提供的非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟粗校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上。

13.根据权利要求12所述的具有脉冲延迟自适应校准功能的细胞分析仪，其特征在于，所述脉冲识别计算单元还用于将主控单元提供的非基准激光器与基准激光器之间的脉冲延迟细校准值叠加到非基准激光器的各数据通道的脉冲信号上。

14.根据权利要求12所述的具有脉冲延迟自适应校准功能的细胞分析仪，其特征在于，所述液路单元上设有流量控制单元，用于控制液路单元的液路流量；所述环境监测单元与流量控制单元连接，用于根据流量控制单元的流量控制信号，获取对应的液路流量值。