CN104974230B - 抗菌星型聚多肽、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗菌材料技术领域,特别涉及星型聚多肽、其制备方法及用途。该方法通过核优先法(core‑first法),并利用N‑羧基‑α‑氨基酸酐聚合方法(NCA聚合方法)为手段,合成分子结构可控的三臂星形聚多肽。该人工高分子抗菌剂具有高效靶向的抗菌性,不易被降解,且对于革兰氏阴性和革兰氏阳性菌都具有很好的抗菌活性。另外,这种高分子抗菌剂不会导致抗药菌产生,不会渗入人体的皮肤和毛孔中,是抗生素药物的理想替代品。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌材料技术领域,特别涉及抗菌星型聚多肽、其制备方法及用途。
背景技术
抗生素类抗菌剂的滥用会导致超级抗药菌的生成,且会随着皮肤渗透或血液循环到未被细菌感染的器官,从而造成毒副作用。因此,如何利用新型抗菌剂替代传统的抗生素类抗菌剂一直以来都是全球性的科学课题。
二十世纪九十年代,生物学家在用微生物诱导天蚕蛹时发现天蚕蛹的免疫系统产生了一种多肽类物质,该多肽物质具有杀菌活性。科学家命名此多肽为天蚕素(Cecmpins),天蚕素作为世界上第一个抗菌肽正式被人们所认识。天然抗菌肽的氨基酸残基数目一般为15-50个,并且具有加热后稳定性高,在水中溶解性较好等优点。天然抗菌肽受到人们的关注正是因为它们具有的独特功能,比如有些天然抗菌肽能够对细菌、病毒、真菌、原生动物等具有较强的抑制作用,而且部分天然抗菌肽在杀灭癌细胞的同时又对真核细胞毒副性较小。但目前天然抗菌肽依然存在来源有限(天然提取资源有限,难以产业化)、成本高、提取工艺复杂、容易被酶降解等问题。
人工广谱高分子抗菌剂是一种带有大量表面正电荷的高分子,它可以通过静电相互作用靶向地与细菌的细胞膜结合并插入细胞膜内,造成细菌细胞膜的解体。由于高分子抗菌剂直接作用于细菌的细胞膜表面而并非像传统的抗生素一样作用于细菌的DNA,所以其不会造成超级抗药菌的产生(Word Notes on Antibiotics,2009,Vol,No.4),且对于野生菌种和耐药性菌种均有效果。另外,由于人体的正常细胞表面的负电荷要远远少于细菌表面的负电荷,因此其不会破坏人体的正常细胞。同时,高分子抗菌剂不会通过渗透作用进入皮肤或者细胞膜内,因此无毒副作用,是一种理想的传统抗生素替代品。
非线形聚丙烯酸酯类聚合物,由于其较大的表面正电荷密度以及其较高的分子链柔性,更加容易与细胞膜特异性结合并使细菌细胞膜解体,是一种高效靶向的广谱高分子抗菌剂。且其合成方法简单,有望被大规模生产。因此,提供一种星型聚多肽及其制备方法和其用作抗菌剂的用途。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种星型聚多肽、其制备方法及用途。以NCA聚合为手段,合成三臂星形聚多肽,相比于其它方法如固相合成法或用微生物合成法,其施行简单,提纯方便,且其产率高达到95%。和已有的产品相比价格低,因此是目前合成三臂星形聚多肽最行之有效的方法。本方法合成的三臂星形聚多肽分子量较窄,PDI(分子量分布)只有1.1,合成的星形聚多肽与天然多肽分子结构基本一致,可作为生物医用级抗菌剂给人类使用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种三臂星型聚多肽,其结构如式Ⅰ所示
式Ⅰ
其中,
n=50~200。
星形聚多肽类聚合物,由于其表面正电荷密度较大以及具有较好的生物相容性,因此更容易与细菌的细胞膜特异性结合并使细菌细胞膜解体,是一种高效靶向的广谱高分子抗菌剂。所合成的聚多肽,与天然多肽分子结构基本一致,可作为医用级抗菌剂给人类使用。
现今合成星形聚合物的方法主要有核优先法和臂优先法。而这些合成方法往往需要通过活性聚合来实现,阴离子聚合、阳离子聚合及活性自由基聚合均可合成出分子结构可控的星形聚合物。
N-羧基-α-氨基酸酐聚合方法(NCA聚合方法)是生物化学方面非常重要的一个反应,是现今为止唯一一种通过一步法即可得到聚氨基酸的反应。这种方法相比于现今常用的固相合成法,其合成成本大大降低;相比于微生物合成法,其避免了复杂的提纯过程。NCA聚合机理上属于阴离子开环聚合,可以通过四种模式引发反应,即伯胺引发、叔胺引发、金属化配位合物引发已经硅-氮化合物引发。其中伯胺引发的NCA聚合符合活性聚合特征,可以使得到的聚氨基酸带有末端基团,方便聚多肽链的修饰,并可通过末端基团进行复杂高分子链的构筑,是一种合成聚多肽的反应。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽,其结构如式Ⅱ所示
式Ⅱ
其中,n=50~200。
本发明还提供了所述三臂星型聚多肽的制备方法,以三功能度的NCA为引发剂,取苄基氨基甲酸酯保护的N-羧基-α-赖氨酸酐与DMSO发生聚合反应,获得中间产物,通过钯碳催化加氢脱掉苄基氨基甲酸酯的保护,即得。反应方程式如下:
其中,三功能度的NCA的制备方法的反应方程式可以为:
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽的制备方法中,三功能度NCA引发剂、苄基氨基甲酸酯保护的N-羧基-α-赖氨酸酐与DMSO的物质的量比为1:(50~200):(50~200)。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽的制备方法中,所述聚合反应在氮气环境下发生。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽的制备方法中,所述聚合反应的时间为60h~70h。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽的制备方法中,所述中间产物与氢气的物质的量的比为1:3000。
本发明还提供了所述制备方法制得的三臂星型聚多肽。
本发明还提供了所述三臂星型聚多肽在制备抗菌剂中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽的应用中,所述抗菌剂用于抑制细菌。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽的应用中,所述抗菌剂用于抑制革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽的应用中,所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。大肠杆菌可以为普通野生大肠杆菌,还可以为抗药性大肠杆菌。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明提供的三臂星型聚多肽的应用中,所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。
本发明提出基于核优先法(core-first法)聚多肽类人工光谱抗菌剂的制备方法及其抗菌用途。并以NCA聚合为手段,通过调控引发剂和单体的比例可控合成出生物医用级的聚多肽类的人工高分子广谱抗菌剂。提出一种可取代传统抗生素的新型高分子抗菌剂。利用侧基带有氨基的四臂的星形聚合物作为高分子抗菌剂,可以靶向进攻细菌细胞膜却不破坏人体正常细胞,且具有非常好的抗菌效果。以解决目前现有的高分子抗菌剂往往是一些天然的多肽,其产量低、价格高,且在人体中易被酸或蛋白酶水解,因此往往难以被大规模应用的问题。
本发明制备方法与现有技术相比具有以下优点:
1.本方法采用arm-first法,并以NCA聚合为手段,合成三臂星形聚多肽,相比于其它方法如固相合成法或用微生物合成法,其施行简单,提纯方便,且其产率高(达到95%),中国专利(CN1635010A)报道的一种高分子抗菌剂只有50%-80%的产率。和已有的产品相比价格低,因此是目前合成三臂星形聚多肽最行之有效的方法。
2.本方法合成的三臂星形聚多肽分子量较窄,PDI(分子量分布)只有1.1,合成的星形聚多肽与天然多肽分子结构基本一致,可作为生物医用级抗菌剂给人类使用。
本发明制备方法与现有技术相比还具有以下优点:
1.与现有的天然高分子抗菌剂相比,人工合成的聚多肽类产品产量高、价格低、更易于合成。
2.非线形的分子结构可以提供更加高的表面正电荷密度,有利于高分子抗菌剂与细菌表面的细胞膜特异性结合,从而大幅提高抗菌效率。
3.本产品具有广谱抗菌型,对于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效。
4.本产品直接使细菌细胞膜解体,不会产生抗药的超级细菌,且对于耐药菌种有很好的效果。
5.本产品分子结构与天然多肽极为类似,不会随人体皮肤毛孔和血液循环渗透入人体正常细胞,对人体毒副作用极小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明制备的三臂星形聚多肽的反应方程式;
图2示本发明实施例1中的三臂星形聚多肽核磁共振氢谱图;
图3示本发明实施例1中苄基氨基甲酸酯保护的星形聚多肽凝胶渗透色谱曲线;纵坐标为信号强度,没有单位;分子量为15000,PDI分布为1.1说明可控合成比较有效果;
图4示本发明提供的三臂星形聚多肽的浓度和杀菌效果曲线;在产物浓度大于4μg/ml时,对普通野生大肠杆菌杀灭为99.99%,对抗药性大肠杆菌杀灭为99%;
图5示本发明提供的三臂星形聚多肽的最低抑菌浓度测量实验;最低抑菌浓度测量,显示MIC(最低抑菌浓度)为0.02%-0.05%;
图6示本发明提供的三臂星形聚多肽的浓度和杀菌效果曲线;在产物浓度大于8μg/ml时,对普通和耐药性金黄色葡萄球菌的杀菌率达到99.9%以上;
图7示本发明提供的三臂星形聚多肽的最低抑菌浓度测量实验;最低抑菌浓度测量,显示金黄色葡萄球菌的MIC(最低抑菌浓度)为0.04%-0.2%。
具体实施方式
本发明公开了一种星型聚多肽、其制备方法及用途,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的星型聚多肽、其制备方法及用途中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
将三功能度NCA引发剂:苄基氨基甲酸酯保护的N-羧基-α-赖氨酸酐:DMSO按物质的量比为1:150:150加入三口烧瓶中,通氮气反应60-70小时。在水中将苄基氨基甲酸酯保护的星形聚多肽沉淀出来。所得固体在钯碳催化下与按产物:氢气=1:3000通氢气进行还原加氢反应,真空干燥过夜,即可得到纯品星形聚多肽类,产率达到95%。
实施例2
将三功能度NCA引发剂:苄基氨基甲酸酯保护的N-羧基-α-赖氨酸酐:DMSO按物质的量比为1:50:50加入三口烧瓶中,通氮气反应60-70小时。在水中将苄基氨基甲酸酯保护的星形聚多肽沉淀出来。所得固体在钯碳催化下与按产物:氢气=1:3000通氢气进行还原加氢反应,真空干燥过夜,即可得到纯品星形聚多肽类,产率达到96%。
实施例3
将三功能度NCA引发剂:苄基氨基甲酸酯保护的N-羧基-α-赖氨酸酐:DMSO按物质的量比为1:200:200加入三口烧瓶中,通氮气反应60-70小时。在水中将苄基氨基甲酸酯保护的星形聚多肽沉淀出来。所得固体在钯碳催化下与按产物:氢气=1:3000通氢气进行还原加氢反应,真空干燥过夜,即可得到纯品星形聚多肽类,产率达到98%。
实施例4
将大肠杆菌菌株接种在新鲜的大豆蛋白冻(TSB,2.5mL)中,之后在37℃的恒温培养箱中培养18h。从中取40L培养液,稀释到4mLTSB中,再在37℃的恒温培养箱中培养约1~2h至OD600值在0.5~0.7之间。离心使菌株沉降,转速为5000rpm,离心5min,除去上清液,之后利用2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸盐(HEPES)缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,pH7.4)洗涤剩余的菌株两次。得到的菌液放入96微孔板中进行杀菌实验,利用二倍稀释的方法,将三臂星形聚多肽的HEPES缓冲液加入96微孔板中。配方为三臂星形聚多肽的HEPES缓冲液20L利用HEPES稀释至150L,在加入50L菌液。将微孔板放置于37℃的恒温培养箱中培养3个小时,通过10倍稀释法在96微孔板中将细菌稀释,之后在Müeller-Hinton(MH)琼脂板中培养12h,控制参比样(PC)的菌株数目在80~120之间。
实施例5
将金黄色葡萄球菌菌株接种在新鲜的大豆蛋白冻(TSB,2.5mL)中,之后在37℃的恒温培养箱中培养18h。从中取40L培养液,稀释到4mLTSB中,再在37℃的恒温培养箱中培养约1~2h至OD600值在0.5~0.7之间。离心使菌株沉降,转速为10000rpm,离心5min,除去上清液,之后利用2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸盐(HEPES)缓冲液(10mM HEPES,150mMNaCl,pH 7.4)洗涤剩余的菌株两次。得到的菌液放入96微孔板中进行杀菌实验,利用二倍稀释的方法,将三臂星形聚多肽的HEPES缓冲液加入96微孔板中。配方为将三臂星形聚多肽的HEPES缓冲液20L利用HEPES稀释至150L,在加入50L菌液。将微孔板放置于37℃的恒温培养箱中培养3个小时,通过10倍稀释法在96微孔板中将细菌稀释,之后在Müeller-Hinton(MH)琼脂板中培养12h,控制参比样(PC)的菌株数目在80~120之间。
实施例6
将细菌株接种在新鲜的大豆蛋白冻中,之后在37℃的恒温培养箱中培养18h。从中取一份培养液,稀释到10倍的TSB中,再在37℃的恒温培养箱中培养约1~2h至OD600值在0.5~0.7之间。离心使菌株沉降,转速为5000rpm,离心5min,除去上清液,之后利用2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸盐(HEPES)缓冲液(10mM HEPES,150mM氯化钠溶液,pH 7.4)洗涤剩余的菌株两次。得到的菌液放入96微孔板中进行杀菌实验,利用二倍稀释的方法,将三臂星形聚多肽的HEPES缓冲液加入96微孔板中。配方为三臂星形聚多肽的HEPES缓冲液一份利用HEPES稀释7倍,再加入2.5份菌液中。将微孔板放置于37℃的恒温培养箱中培养3个小时,通过10倍稀释法在96微孔板中将细菌稀释,之后在米勒-辛顿(Müeller-Hinton,MH)琼脂板中培养12h,控制参比样(PC)的菌株数目在80~120之间。对结果进行计数和处理。
由图4可知,细菌杀菌实验,在产物浓度大于4μg/ml时,对普通野生大肠杆菌杀灭为99.99%,对抗药性大肠杆菌杀灭为99%。
由图5可知,最低抑菌浓度测量,显示MIC(最低抑菌浓度)为0.02%-0.05%。
由图6可知,细菌杀菌实验,在产物浓度大于8μg/ml时,对普通和耐药性金黄色葡萄球菌的杀菌率达到99.9%以上;
由图7可知,本发明提供的三臂星形聚多肽的最低抑菌浓度测量实验;最低抑菌浓度测量,显示金黄色葡萄球菌的MIC(最低抑菌浓度)为0.04%-0.2%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种三臂星型聚多肽,其特征在于,其结构如式Ⅱ所示
其中,n=50~200。
2.根据权利要求1所述的三臂星型聚多肽的制备方法,其特征在于,以三功能度的NCA为引发剂,取苄基氨基甲酸酯保护的N-羧基-α-赖氨酸酐与DMSO发生聚合反应,获得中间产物,通过钯碳催化加氢脱掉苄基氨基甲酸酯的保护,即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,三功能度NCA引发剂、苄基氨基甲酸酯保护的N-羧基-α-赖氨酸酐与DMSO的物质的量比为1:(50~200):(50~200)。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述聚合反应在氮气环境下发生。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述聚合反应的时间为60h~70h。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述中间产物与氢气的物质的量的比为1:3000。
7.根据权利要求2至6任一项所述的制备方法制得的三臂星型聚多肽。
8.根据权利要求7所述的三臂星型聚多肽在制备抗菌剂中的应用;
所述抗菌剂用于抑制细菌;
所述抗菌剂用于抑制革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌;
所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌;
所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。
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