CN104971061B - 一种利福霉素‑硝基咪唑偶联分子的用途 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种利福霉素‑硝基咪唑偶联分子的新用途，属于医药化学领域。本发明的利福霉素‑硝基咪唑偶联分子在治疗难辨梭状芽孢杆菌、幽门螺杆菌等感染相关性疾病方面对耐药菌株表现出高活性，除了对利福霉素单耐药菌和甲硝唑单耐药菌均有抗菌活性，对利福霉素和甲硝唑双耐药菌具有抗菌作用，其活性优于利福平和甲硝唑的1:1摩尔比组合。

Description

一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的用途

技术领域

本发明属于医药化学领域，尤其涉及一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的新用途。

背景技术

在美国专利US 7,678,791 B2中公开了处于研发阶段的抗菌化合物4-脱氧-3,4-[2-螺环-[2-(2-甲基-5-硝基-咪唑-1-基)乙基]-哌啶-4-基]]-(1氢)-咪唑并-(2,5-二氢)利福霉素S即利福霉素-硝基咪唑偶联分子，其对利福霉素单耐药菌株和甲硝唑单耐药菌株均有抗菌活性，表明其双靶标特性。然而，从其构效关系和理论推测，其对利福霉素和甲硝唑双耐药菌株的活性应该与利福霉素(利福平)和甲硝唑的1:1摩尔比混合物相当，没有或只有微弱抗菌活性。

利福霉素抗生素是由地中海链丝菌产生的一类抗生素，它具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。

甲硝唑对大多数厌氧菌具有强大的抗菌作用，但对需氧菌和兼性厌氧菌无作用，抗菌谱包括梭形杆菌、产气梭状芽孢杆菌等，主要用于治疗或预防厌氧菌引起的局部感染。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种微氧革兰氏阴性菌，是消化性溃疡发生和复发的主要原因，据报道Hp根除后溃疡病的年复发率为6.54％，Hp阳性的溃疡病年复发率高达23.33％，因此根除Hp对防治溃疡复发极为重要。但近年来随着抗生素在Hp感染治疗中的广泛应用，Hp的耐药问题日益 严重，迫切需要对耐药幽门螺杆菌有效的新药。

难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile,CD)是一种厌氧的革兰染色阳性芽孢杆菌，广泛分布于自然环境及动物和人的粪便中，难辨梭状芽孢杆菌可产生毒素A和毒素B，侵入肠黏膜后引起细胞病变，导致一系列感染相关临床表现。繁殖体如暴露于空气中会很快死亡，但芽孢抵抗力较强，耐干燥、耐热并能抵抗多种消毒剂，可在医院环境及医务人员手上至少存活6个月。难辨梭状芽孢杆菌今年有爆发性流行的趋势，迫切需要对难辨梭状芽孢杆菌感染有效的，特别是可以克服耐药性的新药。

近年来耐药结核迅速发展，特别是耐多药(MDR-TB)和广谱耐药结核(XDR-TB)的出现，对结核病(TB)的治疗提出严重挑战，迫切需要可以治疗耐药结核的抗菌新药。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的新用途。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的新用途，所述利福霉素-硝基咪唑偶联分子的结构如式Ⅰ，其中，所述利福霉素-硝基咪唑偶联分子在制备抗耐药菌的药物中的应用；

根据上述的一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的新用途，其中，所述抗耐药菌包括抗利福霉素单耐药菌、抗甲硝唑单耐药菌或抗利福霉素和甲硝唑双耐药菌。

根据上述的一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的新用途，其中，所述抗耐药菌为抗利福霉素单耐药的难辨梭状芽孢杆菌、抗甲硝唑单耐药的难辨梭状芽孢杆菌或抗利福霉素和甲硝唑双耐药的难辨梭状芽孢杆菌。

根据上述的一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的新用途，其中，所述抗耐药菌为抗利福霉素单耐药的幽门螺杆菌、抗甲硝唑单耐药的幽门螺杆菌或抗利福霉素和甲硝唑双耐药的幽门螺杆菌。

本发明的突出效果为：本发明的一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子在治疗耐药感染制备抗利福霉素和甲硝唑双耐药菌的药物中的新用途，不仅对利福霉素单耐药菌株和甲硝唑单耐药菌株均有抗菌活性，而且对利福霉素和甲硝唑双耐药菌株具有强抗菌作用。所述利福霉素-硝基咪唑偶联分子对革兰氏阳性厌氧产毒型病原体难辨梭状芽孢杆菌的抗菌活性较单独使用利福平、甲硝唑或将利福平与甲硝唑1:1摩尔比联合起来用药的抗菌活性强；同时对微氧革兰氏阴性胃 肠道病原菌-幽门螺杆菌抗菌活性较单独使用利福平、甲硝唑或将利福平与甲硝唑1:1摩尔比联合起来用药的抗菌活性强。利福霉素-硝基咪唑偶联分子对革兰氏阳性厌氧产毒型病原体难辨梭状芽孢杆菌的抗菌活性和对微氧革兰氏阴性胃肠道病原菌-幽门螺杆菌抗菌活性主要来自于偶联分子中的利福霉素药效团，但分子中的甲硝唑药效团也能贡献次要的抗菌活性。

以下便结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子对幽门螺杆菌的抗菌活性

1.1材料与方法

1.1.1菌株的选择

ATCC#700392(CB1531)为野生型株，从美国菌种保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚)购买。CB1573、CB1609、CB1610、CB1612、CB1613、CB1614、CB1771、CB1893、CB1894、CB1900、CB1901、CB1902、CB1903、CB1993是从CB1531获取的等基因突变菌株，携带有特定的耐药基因，上述菌株由丹诺医药提供。菌株描述详见表1。

表1在不含药物的TSAII培养基上接种来源于甘油贮备液的下列菌株

1.1.2培养基的配置

按照临床实验室标准协会指南(Clinical Laboratory Standards Instituteguideline,CLSI)M7-A7(稀释法测定需氧菌对抗菌药物敏感性试验方法，批准的标准)配制。采用阳离子调节并含5％(v/v)陈化绵羊血清的Mueller Hinton琼脂(MHII)进行受试物的稀释。幽门螺杆菌的常规培养则采用含5％(v/v)绵羊血清的胰酷胨大豆琼脂(TSAII)。

1.1.3受试药物的配置

利福霉素-硝基咪唑偶联分子(Lot#DJ-001-042-1)，利福平(Sigma,Cat#R-3501)，甲硝唑(Sigma,Cat#M-3761)和克拉霉素(Sigma,Cat#C-9742)同时测 定。

抗菌药物贮备液采用固体粉末配制，并立即储存于-20℃冰箱，最长可供一个月使用。为保证琼脂稀释法测定MIC试验的重现性，采用CLSI的QC参比药物克拉霉素同时进行测定，以便与CLSI发布并更新的可接受质量控制范围进行比较。

克拉霉素、利福霉素-硝基咪唑偶联分子、甲硝唑和利福平溶解于100％的DMSO中。克拉霉素和甲硝唑在6.4mg/mL浓度时均为无色透明溶液，利福平6.4mg/mL浓度下呈橙红色，利福霉素-硝基咪唑偶联分子在6.4mg/mL浓度下呈红至深紫红色，摩尔比1:1的利福平和甲硝唑混合物采用16.4mg利福平(分子量822)加3.4mg甲硝唑(分子量171)混悬于2mLDMSO中配制而成，混合物溶液呈橙红色。所有受试物在指定溶媒中均易溶，简单混合即得。

1.1.4琼脂制备

在单个一次性无菌试管中加入9.9mL熔化的琼脂(在水浴中冷却至55℃)和0.1份事先已经稀释(100倍)的抗菌药物贮存液，混合，立即注入适宜大小的无菌培养皿(60mm×15mm,Cat#08-772B)。以上装置有助于混合均匀，并能防止因冷却引起的部分琼脂凝固。测试平板琼脂稀释方案参见表2，该方案即简便，又可以获得重现性高的结果。其中，每种药物的实际稀释范围为：利福平＝0.03-32mg/L；甲硝唑＝0.03-32mg/L；利福平+甲硝唑(1:1M)＝0.03-32mg/L；克拉霉素＝0.008-0.25mg/L；利福霉素-硝基咪唑偶联分子＝0.002-32mg/L。

表2测试平板琼脂稀释方案

1.1.5培养皿准备

本试验采用6cm培养皿进行，在培养皿中加入10mL琼脂培养基和抗菌药物。受试抗菌药物采用前述方法分析稀释至适当的浓度，得到一系列100倍浓度的并用于2倍稀释法的中间浓度储备液，每种中间浓度储备液吸取0.1mL加至10mL熔化的琼脂中(见上文)，倒置混匀，并立即倾注于无菌培养皿中。按此方法，相当于将抗菌药物按1:100进行稀释，稀释液的最终浓度为1％。同时制备2个不含抗菌药物的对照培养皿，用于生长对照。培养皿在室温下自然干燥至表面无液体残留，在当天使用，或者在4℃避光保存至使用。以上菌株在适合于螺旋杆菌的微氧环境中，35-37℃孵育5天。

1.1.6接种：

试验用培养皿为市售。采用上文方法(TSA+5％绵羊血)中培养120小时(5天)的菌落制备5mL肉汤接种物，该浓度接种物在O.D.₆₀₀吸光度为0.013(相当于含8×10⁶CFU/mL)。每个接种物用0.2mL移液管混合15次，采用经校准的移液管(多通道或单通道)，吸取0.002ml已调节细胞量的(8×10⁶CFU/mL)细胞悬液加至琼脂培养皿表面，最终接种量相当于约2×10⁴ CFU/点。首先接种第一个不含抗菌药物的对照培养皿，然后从含最低浓度抗菌药物的培养皿开始接种剩余的培养皿。在接种不同的药物组时更换移液吸头。最后接种第二个不含抗菌药物的对照培养皿，从而保证试验过程中未发生污染或明显的药物残留。

孵育:在适合于螺杆菌的微氧环境中，35-37℃孵育5天。

数据注释:MIC值为抑制细菌可见生长的最低连续稀释抗菌药物浓度，不考虑接种物残留的混浊或单个菌落。参比药物(如克拉霉素)的结果在可接受范围(QC＝0.015-0.12)并且待测化合物(利福平、甲硝唑和利福霉素-硝基咪唑偶联分子)的MIC值在2次二倍法稀释范围内则认为本试验结果可靠。

采用微氧菌琼脂法测定利福霉素-硝基咪唑偶联分子和对照药物利福平、甲硝唑以及标准治疗药物克拉霉素对一组带有甲硝唑、利福平或氟喹诺酮类耐药的等基因幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的最低抑菌浓度(MIC)。MIC测定采用含5％陈化绵羊血清的阳离子调节Mueller Hinton琼脂，制备方法参照临床试验室标准学会指南(ClinicalLaboratory Standards Institute guideline)M11-A6部分。所有试验均在适合螺杆菌属生长的35-37℃微需氧环境下培养5天。实验结果见表3。

表3琼脂法测定利福霉素-硝基咪唑偶联分子、克拉霉素、甲硝唑和利福平对携带利福霉素、硝基咪唑及氟喹诺酮耐药突变的等基因幽门螺杆菌株的MIC值

注：RIF+MET(1:1M)表示摩尔比1:1的利福平和甲硝唑混合物。

结果显示，利福霉素-硝基咪唑偶联分子对幽门螺杆菌标准株(ATCC#700392，CB1531)的MIC为≤0.002mg/L，活性明显强于利福平(0.5mg/L)和甲硝唑(2mg/L)。对于具有rpoB突变的利福霉素耐药菌株，利福霉素-硝基咪唑偶联分子的MIC值增加8-250倍，而利福平MIC值增加≥64倍；对于具有rdxA(rdxAR16S)突变的甲硝唑耐药菌株，甲硝唑的MIC值增加至32mg/L(相当活性下降16倍)，而利福霉素-硝基咪唑偶联分子的抑菌活性未见明显降低。因此，单耐药的幽门螺杆菌抑菌活性结果表明，利福霉素-硝基咪唑偶联分子均优于其分子结构中的两个母体抗生素。

利福霉素-硝基咪唑偶联分子对具有高度利福霉素耐药突变(如rpoBL525I,D530N)合并甲硝唑耐药突变(rdxAR16S)或者rdxAE75stop无义突变的幽门螺杆菌抑菌活性，与其对仅有rpoBL525I,D530N单突变的幽门螺杆菌(CB1614)活性相比下降4倍。该结果表明，利福霉素-硝基咪唑偶联分子对于革兰氏阴性微氧胃肠道病原菌-幽门螺杆菌的活性主要来自于分子中的利福霉素药效团，同时其分子中的甲硝唑药效团也贡献部分抗菌活性。进一步的研究表明，利福霉素-硝基咪唑偶联分子与利福平：甲硝唑(1：1M)混合物相比，对野生型菌株活性高出250倍，对具有利福霉素单耐药菌株的活性高16-533倍，对具有甲硝唑单耐药菌株活性高125倍，对利福霉素和甲硝唑双耐药菌株活性高≥64倍。利福霉素-硝基咪唑偶联分子的抗菌活性不受当前普遍存在的喹诺酮耐药突变的影响。

本试验结果提示利福霉素-硝基咪唑偶联分子对于微氧革兰氏阴性胃肠道病原菌-幽门螺杆菌的活性主要来自于偶联分子中的利福霉素药效团，同时其分子中的甲硝唑药效团也提供次要的抗菌活性。

实施例2一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子对革兰氏阳性厌氧产毒型病原体难辨梭状芽孢杆菌的抗菌活性

2.1材料与方法

2.1.1菌株的选择

ATCC#BAA-1382(CB1921)为产毒型难辨梭状芽孢杆菌，从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，马纳萨斯,维吉尼亚)购买。CB1934、CB1939、CB1940、CB1941、CB1942为从CB1921获取的携带有特定耐药突变的等基因菌株。本试验菌株均由丹诺医药提供。菌株描述详见表4。表4在不含药物的补充型布氏琼脂培养基上接种来源于甘油贮备液的下列菌株

^＊注：CB1939等基因耐药菌株未经测序证实，但CB1942是CB1939的直系后代，说明至少存在

gyrA(D71Y)或(T82A)中的一种突变。

2.1.2培养基的配置

按照临床实验室标准协会指南M7-A7(稀释法测定需氧菌对抗菌药物敏感性试验方法，批准的标准)配制。难辨梭状芽孢杆菌采用补充的布氏琼脂(布氏肉汤基础，琼脂，10mg/L维生素K1，5mg/L血红素，5％(w/v)湖羊血清)。

2.1.3受试药物贮存与稀释

利福霉素-硝基咪唑偶联分子(lot#DJ-001-042-1)，利福平(Sigma，Cat#R-3501)，甲硝唑(Sigma，Cat#M-3761)和万古霉素(Sigma，Cat#861987)同时测定。

抗菌药物贮备液采用固体粉末配制，并立即储存于-20℃冰箱，最长可供一个月使用。为保证琼脂稀释法测定MIC试验的重现性，采用CSLI的QC参比药物万古霉素同时进行测定，以便与CLSI发布并更新的可接受质量控制范围进行比较。

万古霉素溶于10mg/mL无菌水中，并用0.2μm注射过滤器滤过。利福霉素-硝基咪唑偶联分子、甲硝唑和利福平溶解于100％的DMSO中。万古霉素和甲硝唑在6.4mg/mL浓度时均为无色透明溶液，利福平6.4mg/mL浓度下呈橙 红色，利福霉素-硝基咪唑偶联分子在6.4mg/mL浓度下呈红至深紫红色，摩尔比1:1的利福平和甲硝唑混合物采用16.4mg利福平(分子量822)加3.4mg甲硝唑(分子量171)混悬于2mL DMSO中配制而成，混合物溶液呈橙红色。所有受试物在指定溶媒中均易溶，简单混合即得。

2.1.4琼脂制备(具体参见1.1.4及表2)

每种药物的实际稀释范围为：利福平＝0.03-32mg/L；甲硝唑＝0.03-32mg/L；利福平+甲硝唑(1:1M)＝0.03-32mg/L；万古霉素＝0.25-8mg/L；利福霉素-硝基咪唑偶联分子＝0.002-32mg/L。

2.1.5培养皿准备(详细步骤参见1.1.5)

2.1.6接种：

试验用培养皿首先进行编号。采用上文方法中无氧条件下培养72小时(3天)的菌落制备5mL MHII肉汤接种物，该浓度接种物在O.D.₆₀₀吸光度为0.013(相当于含1×10⁷CFU/mL)。每个接种物用0.2mL移液管混合≥5次，采用经校准的移液管(多通道或单通道)，吸取0.002ml已调节细胞量的(10⁷CFU/mL)细胞悬液加至琼脂培养皿表面，最终接种量相当于约2×10⁴CFU/点。首先接种第一个不含抗菌药物的对照培养皿，然后从含最低浓度抗菌药物的培养皿开始接种剩余的培养皿。在接种不同的药物组时更换移液吸头。最后接种第二个不含抗菌药物的对照培养皿，从而保证试验过程中未发生污染或明显的药物残留。

孵育：在含有亚甲蓝指示剂的由气体发生器形成的无氧密封仓环境中，35-37℃孵育3天。

数据注释:MIC值为抑制细菌可见生长的最低连续稀释抗菌药物浓度，不考虑接种物残留的混浊或单个菌落。参比药物(如万古霉素)的结果在可接受 范围(QC＝0.5-4mg/L)并且待测化合物(如万古霉素和利福霉素-硝基咪唑偶联分子)的MIC值在2次二倍法稀释范围内则认为本试验结果可靠。实验结果见表5。

表5琼脂法测定利福霉素-硝基咪唑偶联分子、利福平、甲硝唑和万古霉素对携带利福霉素或氟喹诺酮耐药突变的等基因难辨梭状芽孢杆菌株的MIC值

实验结果表明，万古霉素对照组的结果与预期一致，MIC为1-4mg/L，该值≤2个二倍法稀释范围符合CLSI QC的可接受范围，说明本次试验测定的MIC值可靠。

利福霉素-硝基咪唑偶联分子对难辨梭状芽孢杆菌(BAA1392,CB1921)有很强的抑菌作用，MIC≤0.002mg/L，其活性与利福平相近(MIC≤0.03mg/L)，强于甲硝唑(MIC＝0.25mg/L)和万古霉素(MIC＝1或4mg/L)。

对于携带rpoB(Q489K)突变的利福霉素耐药菌株(CB1934、CB1940、CB1942)，利福霉素-硝基咪唑偶联分子的抑菌活性受到影响(MIC值增加≥30-250倍)，但仍保持很高的活性(如MIC＝0.06or 0.5mg/L)，且大大优于 利福平，利福平在最高浓度下也无法观察到任何体外抑菌活性(32mg/L，MIC增加≥1066倍)。相对于CB1934(携带rpoB(Q489K)突变的利福霉素单耐药菌株)和CB1940(携带rpoB(Q489K)突变的利福霉素耐药及另一种不同突变机理的喹诺酮耐药菌株)，CB1942(携带利福霉素和喹诺酮高度耐药突变rpoB(Q489K)和gyrA(D71Y,T82A))对利福霉素-硝基咪唑偶联分子更敏感。这种对多耐药菌株抗菌活性增强的机制尚明不确，但在进行的两次试验中数据具有很好的重复性。CB1939、CB1940和CB1942等菌株中存在喹诺酮耐药突变，但利福霉素-硝基咪唑偶联分子的活性不受喹诺酮耐药影响，这与利福霉素-硝基咪唑偶联分子的作用机理(双靶标)完全一致。反复进行的利福霉素-硝基咪唑偶联分子和万古霉素抑菌试验表明该试验的MIC值重现性非常好。

表6琼脂法测定利福平+甲硝唑混合物(1:1摩尔比)和万古霉素对携带利福霉素或氟喹诺酮耐药突变的等基因难辨梭状芽孢杆菌株的MIC值

注：RIF+MET(1:1M)表示利福平+甲硝唑混合物(1:1摩尔比)

总之，无论对携带野生型ropB的等基因菌株(如CB1921、CB1939或 CB1941)还是对携带利福霉素耐药突变(rpoBQ489K)的等基因菌株(如CB1934、CB1940或CB1942)，利福霉素-硝基咪唑偶联分子的抗菌活性均等于或4倍强于利福平和甲硝唑混合物(1:1摩尔比)见表6。

本试验的结果表明，利福霉素-硝基咪唑偶联分子对革兰氏阳性厌氧产毒型病原体难辨梭状芽孢杆菌的抗菌活性主要来自于偶联分子中的利福霉素药效团，但分子中的甲硝唑药效团也能贡献次要的抗菌活性。

综上所述，一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子对革兰氏阳性厌氧产毒型病原体难辨梭状芽孢杆菌的抗菌活性较单独使用利福平、甲硝唑或将利福平与甲硝唑联合起来用药的抗菌活性强；同时对微氧革兰氏阴性胃肠道病原菌-幽门螺杆菌抗菌活性较单独使用利福平、甲硝唑或将利福平与甲硝唑联合起来用药的抗菌活性强。所述利福霉素-硝基咪唑偶联分子对革兰氏阳性厌氧产毒型病原体难辨梭状芽孢杆菌的抗菌活性和对微氧革兰氏阴性胃肠道病原菌-幽门螺杆菌抗菌活性主要来自于偶联分子中的利福霉素药效团，但分子中的甲硝唑药效团也能贡献次要的抗菌活性。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的用途，所述利福霉素-硝基咪唑偶联分子的结构如式Ⅰ，其特征在于，所述利福霉素-硝基咪唑偶联分子在制备抗幽门螺杆菌耐药菌和抗难辨梭状芽孢杆菌耐药菌的药物中的应用；

2.根据权利要求1所述的一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的用途，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌耐药菌和抗难辨梭状芽孢杆菌耐药菌包括抗利福霉素单耐药菌、抗甲硝唑单耐药菌或抗利福霉素和甲硝唑双耐药菌。

3.根据权利要求2所述的一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的用途，其特征在于，所述抗难辨梭状芽孢杆菌耐药菌为抗利福霉素单耐药的难辨梭状芽孢杆菌、抗甲硝唑单耐药的难辨梭状芽孢杆菌或抗利福霉素和甲硝唑双耐药的难辨梭状芽孢杆菌。

4.根据权利要求2所述的一种利福霉素-硝基咪唑偶联分子的用途，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌耐药菌为抗甲硝唑单耐药的幽门螺杆菌或抗利福霉素和甲硝唑双耐药的幽门螺杆菌。