CN104970183A - 可溶性大豆蛋白、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可溶性大豆蛋白、其制备方法及应用。本发明具体涉及一种可溶性大豆蛋白材料，以所述大豆蛋白材料重量计，其中至少75重量%的蛋白组分的分子量为20～80kDa，灰分含量低于8重量%，植酸含量为0.5～5.0重量%。所述大豆蛋白材料通过在pH5.0～8.5条件下用中性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备。本发明的大豆蛋白材料在各pH条件下均具有优异的溶解性，且灰分含量低、易生产、耐储存，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域。

Description

可溶性大豆蛋白、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于食品工业领域，也可涉及制药、化妆品等多个领域。具体而言，本发明涉及可溶性大豆蛋白、其制备方法、及其应用。

背景技术

大豆蛋白质是一种极佳的食用蛋白质源和工业原料。由于具有乳化、胶凝等功能特性，大豆蛋白已广泛用作食品的原材料，或在肉制品、渔产品、配菜、面食、糖果、饮料等方面用于改善食品质量和性能。此外，大豆蛋白还具有一定的营养及生理功能，能够降低血胆固醇含量，减少患心脏病的风险，由此可用于制药和保健品领域。

但是，大豆蛋白质的溶解性很差，尤其在pH低于4.5的酸性食品中，从而使得大豆蛋白质的应用受到限制。由于酸性食品的pH等于或处于大豆蛋白质等电点附近(约pH5)，所以大豆蛋白质在最常用pH范围(3.0～4.5)内几乎不溶解，而且不呈现其功能特性。

已进行了有关酸性食品中大豆蛋白质的应用的研究。例如，在大豆蛋白中添加稳定剂(诸如果胶，可参见JP54-52754A)和添加乳化剂(诸如HLB值在13或以上的糖脂肪酸酯；可参见JP59-41709B)。但是，这些利用稳定剂或乳化剂的技术都不是为了获得或改善蛋白质本身的溶解状态，而是在配制蛋白质材料时所应用的技术，因此，不能得到外观透明的产品，也几乎不期望蛋白质材料发挥其自身具有的功能特性(诸如乳化和胶凝)。

CN102396643A公开了一种酸溶性大豆蛋白的制备方法，其中采用植酸酶和酸性蛋白酶两步酶解制备酸溶性蛋白。然而，此方法在酸性条件下进行，对设备要求高，制备过程还需pH调节，操作复杂，还引入了盐分，导致产品的灰分较高。

CN1933738B采用选择性膜技术，制备溶解性能更好的新型卡诺拉分离蛋白。但是，此方法未对蛋白质进行特殊处理，只是对原料中某些固有组分进行浓缩提取。

CN103347397A公开了为了减少大豆蛋白质溶液中的涩味，先用钙盐水溶液提取大豆蛋白质来源的材料得到大豆蛋白质水溶液，再用有机酸和/或矿物酸制备酸化并澄清的大豆蛋白质溶液。然而，该方法所得蛋白质中含有一定的杂质，并且由于溶液中含有钙盐(如植酸钙)并在操作中引入了有机酸和/或矿物酸，导致蛋白质含盐量较高，因此需要通过选择性膜技术，例如超滤、渗滤等对蛋白质水溶液进行处理，以降低产品中的杂质和盐分含量。此方法操作复杂，成本过高，在工业上很难实现。并且，现有技术(如可参见梁慧锋等，“植酸钙的提纯及其植酸磷含量的测定”，安徽农业科学，2007，35(22)：6719-6720)中已公开了，植酸钙(盐)能溶解于稀酸。因此，采用CN103347397A的方法对包含溶于稀酸的植酸钙的溶液进行超滤或渗滤，将会去除蛋白质中的植酸，从而使终产品中的植酸和植酸盐含量下降。而具有抗氧化剂和保鲜剂作用的植酸或植酸盐含量降低导致了通过该方法所得蛋白产品的保存期缩短。

在另一研究中(参见孙琳琳等，“大豆蛋白用作啤酒泡沫稳定剂的研究”，食品科学，2007，28(12)：187-192)，采用蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解，然后调整其pH至4.5，离心后再调整上清液pH至7.0，冷冻干燥后得到酶解大豆分离蛋白。该方法将在酶解后将pH调整到4.5虽然改善了离心上清液在pH4.5条件下的溶解性，但该操作造成了蛋白质部分的损失。并且，在该方法的操作过程中需对pH进行调节(即先调pH至4.5，再调pH至7.0)，由此引入了酸和碱，导致了产品中灰分偏高。

因此，本领域中迫切需要开发出一种在各pH下均能溶解，且灰分含量、植酸含量与原料相当的耐储存大豆蛋白及其制备方法。

发明内容

本发明的主要目的就在于提供一种在各pH下均能溶解(溶液澄清透明)，且灰分含量、植酸含量与原料相当的耐储存大豆蛋白。本发明的另一目的是提供制备本发明大豆蛋白的简单有效的方法。本发明的其它目的还在于提供本发明大豆蛋白、及其制备方法在工业(尤其是食品工业)中的应用。

在本发明的第一方面中，提供了一种可溶性大豆蛋白材料，其中，以所述大豆蛋白材料重量计，所述大豆蛋白材料中至少75重量%，优选至少80重量%，优选至少85重量%，或优选至少90重量%的蛋白组分的分子量为20～80kDa，灰分含量低于8重量%，优选低于5重量%，更优选低于4.8重量%，植酸含量为0.5～5.0重量%，优选为1.9～2.4重量%；或以上各特征范围的任意组合。

在本发明的一些实施方式中，所述大豆蛋白材料通过在pH5.0～8.5条件下用中性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备。优选地，以所述大豆蛋白材料重量计，所述大豆蛋白材料中至少75重量%，优选至少80重量%，优选至少85重量%，或优选至少90重量%的蛋白组分的分子量为20～80kDa，灰分含量低于8重量%，优选低于5重量%，更优选低于4.8重量%，植酸含量为0.5～5.0重量%，优选为1.9～2.4重量%；或以上各特征范围的任意组合。

在一些实例中，所述大豆蛋白材料的制备过程不包括pH调节步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述大豆蛋白材料能溶于水或水性溶液，且溶液澄清透明；优选的，所述大豆蛋白材料在各pH条件下，优选pH1～14，更优选pH2～10，更优选pH2.5～10，更优选pH2.5～7均能溶于水或水性溶液，且溶液澄清透明。

在本发明的第二方面中提供了一种制备本发明可溶性大豆蛋白材料的方法，其包括步骤：

(a)在pH5.0～8.5下，用中性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解；

(b)收集酶解上清液中的可溶性大豆蛋白材料，其中步骤(a)和(b)之间不包括调节pH的步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述中性蛋白酶是植物来源、动物来源、微生物来源(如霉菌来源、细菌来源)、合成或修饰的中性蛋白酶，优选来源于：菠萝、木瓜、枯草杆菌、芽孢杆菌、酵母、放线菌、链霉菌、曲霉、铜绿色假单胞菌、单孢菌、变形杆菌、小球菌，更优选菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、COROLASE中性蛋白酶、SUKAPro NE中性蛋白酶、庞博中性蛋白酶、诺维信中性蛋白酶，优选的COROLASE中性蛋白酶为COROLASE7089，优选的SUKAPro NE中性蛋白酶为SUKAPro NE PW100中性蛋白酶，优选的庞博中性蛋白酶为南宁庞博1398中性蛋白酶，优选的诺维信中性蛋白酶为诺维信Neutrase0.8L。

在一些实例中，所述中性蛋白酶是内肽酶。

在一些实例中，所述中性蛋白酶的使用形式是游离酶(如酶溶液)、和/或固定化酶。

在本发明的一些实施方式中，在所述步骤(a)的酶解反应条件为选自下组中的一种或多种：

(i)所述pH条件的范围为：pH5.0～8.5，优选pH5.5～8.0，更优选pH6.0～7.5；

(ii)所述酶解的温度范围为25～70℃，优选35～65℃，更优选45～55℃；

(iii)所述酶解的时间为0.5～24h，优选1～12h，更优选2～8h；

(iv)以大豆分离蛋白的重量为基准计，所述中性蛋白酶的重量百分比范围为0.5～10重量%，优选0.5～3重量%；和

(v)所述中性蛋白酶的酶活大于5万u/g。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤(b)的收集通过选自下组的方式进行：离心、沉淀、层析、电泳、吸附或其组合。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：在步骤(a)之前制备、分离和/或纯化大豆分离蛋白，或配制大豆分离蛋白溶液，优选所述溶液的浓度为1～10g大豆分离蛋白/100mL水；在步骤(a)和(b)之间使中性蛋白酶失活；在步骤(b)之后对所得的可溶性大豆蛋白材料进行分离、纯化、干燥、包装、储存和/或应用(例如干燥后应用)。

在一些实例中，所述方法不包括调节pH的步骤。

在一些实例中，所述方法包括：称取大豆分离蛋白，加入去离子水配置1～10%浓度(w/v%)基料液；在35～65℃的温度、中性pH条件下，加入中性蛋白酶0.5～10%，反应1～8h，反应结束后，离心取上清液，干燥得到所述可溶性大豆蛋白材料。

在本发明的第三方面中，提供了本发明的可溶性大豆蛋白材料、采用本发明方法制得的可溶性大豆蛋白材料在食品、制药、化妆品、保健品、农业生产及加工中的应用。

在本发明的第四方面中，提供了一种组合物，其包含本发明的可溶性大豆蛋白材料或采用本发明的方法制得的可溶性大豆蛋白材料。

在一些实例中，所述组合物是食品、药物、化妆品、保健品、农产品。

在本发明的第五方面中，还提供了一种制备组合物的方法，所述方法包括将有效量的本发明的可溶性大豆蛋白材料、或采用本发明的方法制得的可溶性大豆蛋白材料与所需的其它材料混合以得到组合物。所述其它材料可为载体、赋形剂、底料、食物、药物、活性成分等。

在一些实例中，所述组合物是食品、药品、化妆品、保健品、农产品。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本申请的发明人通过长期而深入的研究，开发出一种在各种pH条件(尤其是酸性及中性pH条件)下均可溶解的大豆蛋白材料及其制备方法，该材料具有灰分含量、植酸含量与原料相当、耐储存等多种优异理化性质，可广泛用于食品、制药、化妆品、保健品等领域，具有优良的应用前景。在此基础上，发明人完成了本发明。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

大豆蛋白材料

如本发明所用，术语“大豆蛋白材料”、“本发明的大豆蛋白”与“可溶性大豆蛋白材料”可互换使用，均是指采用本发明的方法在中性条件下用中性蛋白酶水解大豆分离蛋白制得的材料。

本发明的大豆蛋白材料可在各种pH(包括酸性pH、中性pH、碱性pH，例如pH1～14，更优选pH2～10，更优选pH2.5～7)下溶于水性介质(例如水、水性溶液)中，产生澄清透明的溶液。该性能使得本发明的大豆蛋白材料可广泛应用于各种pH环境中，以发挥其乳化、水合、胶凝、吸油、发泡等性能。

本发明大豆蛋白材料中大部分的蛋白组分的分子量为20～80kDa，例如至少75重量%，至少80重量%，至少81重量%，至少82重量%，至少83重量%，至少84重量%，至少85重量%，至少90重量%或至少95重量%的蛋白组分的分子量为20～80kDa。

本发明大豆蛋白材料中所含的灰分与原料大豆分离蛋白相似，例如不超过总重的8重量%，不超过总重的7重量%，不超过总重的6重量%，不超过总重的5重量%，不超过总重的4.8重量%。术语“灰分”是指材料中矿物质和无机盐或其它混杂物经灼烧氧化后残余的白色物质(例如可参照GB50094-2010进行测定)，其重量即为灰分重量。

本发明大豆蛋白材料中植酸含量与原料大豆分离蛋白相似，例如占总重量的1～3重量%，优选1.5～2.5重量%，更优选1.9～2.3重量%。保留的植酸成分可发挥其抗氧化和保鲜作用，使得本发明的大豆蛋白材料具有延长的保存期，例如在35℃、60%湿度下保存20h以上，如25～35h，26～30h。

大豆蛋白材料的制备

本发明的大豆蛋白材料可通过在pH5.0～8.5下，用中性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解，并收集酶解上清液中的可溶性大豆蛋白材料制备。

如本发明所用，术语“大豆分离蛋白”或“原料”(isolated Soy Protein，ISP；或Soy Protein Isolate，SPI)是指：以低温脱溶或低变性大豆粕为原料生产的一种全价蛋白类食品材料。大豆分离蛋白中蛋白质含量在90%以上，灰分≤8%(以干基计)，氨基酸种类有近20种，并含有人体必需氨基酸，是植物蛋白中为数不多的可替代动物蛋白的品种之一。

用于本发明的大豆分离蛋白可市售获得(例如购自益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司，或以商品名索乐(Solpro)等购得)，也可以低变性豆粕为原料，经碱溶、酸沉、水洗、调配和喷雾干燥等步骤生产(例如可参见文献CN101372501A—“一种大豆蛋白的制备方法”)。

可将大豆分离蛋白溶于水(例如去离子水、蒸馏水、工业用水等)后用于制备本发明的大豆蛋白材料。本领域普通技术人员可根据需要配制不同浓度的大豆分离蛋白溶液或储备液，例如浓度为1～10g/100mL溶剂的溶液。所得大豆分离蛋白溶液的pH为6.0～7.5的中性条件，无需进一步调整pH即可加入中性蛋白酶进行酶解。

如本文所用，术语“中性蛋白酶”是指在中性pH(如pH6.0～7.5)下具有催化蛋白水解功能的酶类。

可用于本发明方法的中性蛋白酶可获自各种来源，例如植物来源、动物来源、微生物来源(如霉菌来源、细菌来源)，可为合成或修饰的中性蛋白酶，优选来源于：菠萝、木瓜、枯草杆菌、芽孢杆菌、酵母、放线菌、链霉菌、曲霉、铜绿色假单胞菌、单孢菌、变形杆菌、小球菌，更优选菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、COROLASE中性蛋白酶、SUKAPro NE中性蛋白酶、庞博中性蛋白酶、诺维信中性蛋白酶，优选的COROLASE中性蛋白酶为COROLASE7089，优选的SUKAPro NE中性蛋白酶为SUKAPro NE PW100中性蛋白酶，优选的庞博中性蛋白酶为南宁庞博1398中性蛋白酶，优选的诺维信中性蛋白酶为诺维信Neutrase0.8L。本发明中所用的中性蛋白酶为内肽酶。可采用游离的酶(如酶液)、固定化酶等常规的酶应用形式。

本发明的酶解反应可在选自下组的酶解反应条件或其任意组合中进行：

(i)所述pH条件的范围为：pH5.0～8.5，优选pH5.5～8.0，更优选pH6.0～7.5；

(ii)所述酶解的温度范围为25～70℃，优选35～65℃，更优选45～55℃；

(iii)所述酶解的时间为0.5～24h，优选1～12h，更优选2～8h；

(iv)所述中性蛋白酶与大豆分离蛋白的比例范围为0.5～10%(w/w%)，优选1～3%(w/w%)；和

(v)所述中性蛋白酶的酶活大于5万u/g。

在酶解步骤之后，可对酶解产物(即大豆蛋白材料)进行分离和收集，例如采用离心、沉淀、层析、电泳、吸附或其组合等方式。

此外，本发明的方法还可包括在酶解步骤之前制备、分离和/或纯化大豆分离蛋白，或配制大豆分离蛋白溶液；在酶解步骤和收集步骤之间使中性蛋白酶失活；在收集步骤之后对所得的可溶性大豆蛋白材料进行分离、纯化、检测、干燥、包装、存储和/或应用。本领域普通技术人员可根据具体需要选择相应的步骤。

本发明的方法无需包括pH调节步骤，降低了所得大豆蛋白材料中的灰分。

本发明方法的一个示例性实施方式如下：称取大豆分离蛋白，加入去离子水配置1～10%(w/v)浓度基料液，35～65℃搅拌10min使温度稳定至反应温度，加入中性蛋白酶0.5～10%(w/w%)，反应1～8h，反应结束后，100℃灭酶10min，离心取上清液，干燥得产品。

本发明大豆蛋白材料和方法的应用

本发明的可溶性大豆蛋白材料及其制备方法可广泛应用于食品、制药、化妆品、保健品、农业生产及加工中。本发明的可溶性大豆蛋白材料及其制备方法可用于制备组合物，例如食品、药物、化妆品、保健品、农产品组合物等。

本发明提供的产品可以根据需要添加至组合物，例如食品、药物、化妆品、保健品、农产品组合物等中，本发明提供的产品灰分含量较低、植酸含量较高因而保存期较长，并且溶解在酸和水中均澄清透明，可以应用到中性或酸性环境中，并且添加以后不会影响终产品的外观和灰分，反而会延长终产品的保存期。

可将有效量的本发明的大豆蛋白材料与其它材料混合以得到组合物，所述其它材料可为载体、赋形剂、底料、食物、药物、活性成分等，本领域普通技术人员可根据需要对其它材料进行选择。

本文中，术语“有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的效果而无过度不良作用(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“有效量”因各种因素而异，如所需添加的食品、药品或保健品种类、加工方法和程度等。

本发明与现有技术相比具有的优点或积极效果

针对大豆蛋白溶解性较差的问题，在现有技术中，主要采用以下方法提高其溶解性：(I)酶解法，先用植酸酶，再用酸性蛋白酶对蛋白进行酶解，采用两步酶解，操作繁琐；(II)加入一种稳定剂或乳化剂，如阴离子多糖类，诸如果胶、丙二醇藻朊酸酯等，或者采用其它物理或化学方法，防止蛋白的聚集和/或沉淀。但是这些技术都不能获得蛋白质本身的溶解状态，只是在配制蛋白质材料时采用的技术，不能得到外观透明的产品，并且蛋白质自身具有的乳化、胶凝等性能也会消失。(III)采用选择性膜技术，但是这种方法一般对原料蛋白不进行特殊处理，仅对其中的某些成分进行浓缩提取，收率有限。

本发明提供的可溶性大豆蛋白及制备方法，其优势在于：

(1)可选用各种来源(例如由动植物提取或者细菌发酵)生产，并且在中性条件具有酶活的蛋白酶，反应期间无需pH调节，操作简单；

(2)产品分子量主要集中在20～80kDa；

(3)产品灰分低于8%，优选低于5%，与原料相当；

(4)产品植酸含量为0.5～5.0重量%，优选在1.9～2.3重量%之间，保存期大于26h，与原料相当；

(5)解决了现有大豆蛋白产品不易溶于中性或酸性溶液的问题，使得本发明的大豆蛋白材料在中性(例如水)条件、酸性条件和碱性条件下均能溶解且溶液澄清透明。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考王颉等的《食品加工工艺学》(中国农业科学技术出版社，2006年)或按照供应商所建议的条件。以下实施例中所有试剂都可来源于市售。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

称取大豆分离蛋白(购自益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度的基料液。55℃搅拌10min使基料液的温度稳定至55℃，按大豆分离蛋白质量加入1398中性蛋白酶(食品级固体制剂，南宁庞博生物工程有限公司，酶活：20万u/g)1%(w/w%)，在55℃温度下反应3h。反应结束后，100℃灭酶10min，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

实施例2

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度基料液，55℃搅拌10min使温度稳定至55℃，按大豆分离蛋白质量加入菠萝蛋白酶(固体精制菠萝蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司，酶活：80万u/g)1%(w/w%)，在55℃温度下反应4h，反应结束后，100℃灭酶10min，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

实施例3

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置5%(w/v%)浓度基料液，50℃搅拌10min使温度稳定至50℃，按大豆分离蛋白质量加入木瓜蛋白酶(固体精制木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司，酶活：80万u/g)1.5%(w/w%)，在50℃温度下反应4h，反应结束后，100℃灭酶10min，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

实施例4

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置3%(w/v%)浓度基料液，55℃搅拌10min使温度稳定至55℃，按大豆分离蛋白质量加入中性蛋白酶COROLASE7089(液态，德国英联酶制剂公司，AB)2%(w/w%)，在55℃温度下反应2h，反应结束后，100℃灭酶10min，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

实施例5

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度基料液，55℃搅拌10min使温度稳定至55℃，按大豆分离蛋白质量加入SUKAPro NE PW100中性蛋白酶(固体制剂，苏柯汉生物技术有限公司，酶活：10万u/g)2%(w/w%)，在55℃温度下反应3.5h，反应结束后，100℃灭酶10min，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

实施例6

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置6%浓度基料液，55℃搅拌10min使温度稳定至55℃，按大豆分离蛋白质量加入中性蛋白酶(Neutrase0.8L，液态，诺维信公司，酶活：8万u/g)1%(w/w%)，在55℃温度下反应2.5h，反应结束后，100℃灭酶10min，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

实施例7

称取大豆分离蛋白(青岛元润化工有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度的基料液。55℃搅拌10min使基料液的温度稳定至55℃，按大豆分离蛋白质量加入1398中性蛋白酶(食品级固体制剂，南宁庞博生物工程有限公司，酶活：20万u/g)1%(w/w%)，在55℃温度下反应3h。反应结束后，100℃灭酶10min，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

实施例8

称取大豆分离蛋白(青岛元润化工有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度基料液，55℃搅拌10min使温度稳定至55℃，按大豆分离蛋白质量加入菠萝蛋白酶(固体精制菠萝蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司，酶活：80万u/g)1%(w/w%)，在55℃温度下反应4h，反应结束后，100℃灭酶10min，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

比较例1

参照孙琳琳等的文献(“大豆蛋白用作啤酒泡沫稳定剂的研究”，食品科学，2007，28(12)：187-192)如下制备大豆蛋白材料：

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度基料液，55℃搅拌10min使温度稳定至55℃，按大豆分离蛋白质量加入1398中性蛋白酶(食品级固体制剂，南宁庞博生物工程有限公司，酶活：20万u/g)1%(w/w%)，在55℃温度下反应3h，100℃灭酶10min，冷却后调pH至4.5，4℃放置2h，在3000g下离心30min后，上清液调pH至7.0，喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

比较例2

参照陈靓等的文献(“大豆分离蛋白酶解产物功能特性的研究”加工技术，2011，(3)：22-28)如下制备大豆蛋白材料：

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度基料液，55℃搅拌10min使温度稳定至55℃，调节pH至8.0，按大豆分离蛋白质量加入碱性蛋白酶(液态，诺维信公司，酶活10万u/g)1%(w/w%)，在55℃温度下反应3h，100℃灭酶10min，结束后，立刻调pH至7.0，在3000g下离心30min，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

比较例3

参照CN102396643A(一种酸溶性大豆蛋白的制备方法，为与实施例对比，采用酸性蛋白酶单酶酶解)中所述方法如下制备大豆蛋白材料：

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度基料液，50℃搅拌10min使温度稳定至50℃，调节pH至3.5，按大豆分离蛋白质量加入酸性蛋白酶SUKAPro AC(固体制剂，苏柯汉生物技术有限公司，酶活：10万u/g)2%(w/w%)，在50℃温度下反应3.5h，100℃灭酶10min，结束后，立刻在3000g下离心30min，上清液调pH至7.0，上清液喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

比较例4

参照陈霞等的文献(酸解猪皮胶原蛋白制备抗氧化产物的研究，食品科技，2007，(8)，261-264)如下制备大豆蛋白材料：

称取大豆分离蛋白(益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)，加入去离子水配置4%(w/v%)浓度基料液，60℃搅拌10min使温度稳定至60℃，用1.5%(w/v%)的盐酸调节pH至2.0，在60℃温度下搅拌5h，90℃热处理2min，采用膜超滤截留6～80kDa组分，喷雾干燥(采用瑞士BUCHI B-290喷雾干燥仪，条件为：进口温度160℃，出口温度95℃，泵速325mL/h，空气流量16.8m³/h)得产品。

测试例1.样品的电泳分析

依据《SDS-PAGE操作标准》(王红勋，药物部，2010.06.28)，分别取实施例1～8及比较例1～4干燥样品0.2g，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在80℃水浴锅中煮5min后，取10μL样品上样，进行电泳分析，结果见表1。

表1.实施例1～8及比较例1～4样品电泳分析结果

亚基分子量	<6kDa	6～20kDa	20～80kDa
				实施例1	少量	少量	部分
实施例2	少量	少量	部分
				实施例3	少量	少量	部分
实施例4	少量	少量	部分
				实施例5	少量	少量	部分
实施例6	少量	少量	部分
				实施例7	少量	少量	部分
实施例8	少量	少量	部分
				比较例1	少量	少量	部分
比较例2	部分	少量	少量
				比较例3	少量	部分	少量
比较例4	少量	大部分	少量

表中：“少量”：<30%；“部分”：30～60%；“大部分”：>60%

由表1可知，比较例2～4样品中含有较少20kDa以上亚基，而实施例1～8和比较例1样品中主要部分为20～80kDa亚基。

测试例2.样品的气相分配色谱(GPC)分析

为测定蛋白分子量，采用以下GPC检测方法，对实施例1～8和比较例1～4样品进行分子量分析，分析条件如下所述：

色谱柱：TSKgelG2000SWXL300mm*7.8mm(内径)

流动相：乙腈/水/三氯乙酸=20/80/0.1

样品浓度：1.0g/L

检测波长：220nm

流速：1.0ml/min

检测时间：30min

进样体积：20μL

柱温：室温

GPC分析结果见表2。

表2.实施例1～8及比较例1～4样品GPC分析结果

由表2可知，比较例2主要为小于6kDa组分，比较例3和比较例4主要为6～20kDa组分。实施例1～8和比较例1样品中主要为20～80kDa组分，然而比较例1在后处理过程中，调节pH为4.5，并在4℃下放置2h，致使其中的部分大分子沉淀，因此比较例1样品中20～80kDa组分含量明显低于实施例1～8。

测试例3.样品的溶解度分析

采用以下方法测定实施例1～8及比较例1～4样品的溶解度：

准确称取0.5g样品于烧杯中，然后加入少量去离子水，将所得混合物搅拌至形成均匀糊状物，然后再加入去离子水，使体积达到约45mL。接着用磁力搅拌器慢慢搅拌烧杯中的内容物60min。在蛋白质分散后立即测定pH，并用NaOH或HCl将pH调至适当水平(pH2.5、3.5、4.5、5.5)，同时制备自然pH下的样品。

对于进行过pH调节的样品，在60min搅拌过程中测量和校正pH两次。搅拌60min后，用去离子水定容至50mL的总体积、得1%w/v的蛋白质分散液。保留蛋白质分散液的等份试样，通过凯氏定氮法分析蛋白质浓度。另一部分样品在4000rpm下离心30min，取上清液，同样通过凯氏定氮法分析蛋白质浓度。其中，采用下式计算蛋白质的溶解度%：

表3.实施例1～8及比较例1～4样品溶解度测定结果

由表3溶解度测定结果可知，实施例1～8和比较例1～4样品均具有较高的溶解度，尤其是实施例1、6及比较例1、2和4，在各种pH下均能完全溶解。

测试例4.样品水溶液的透光率分析

采用以下方法测定样品水溶液的透光率：

取适量去离子水，用NaOH或HCl将pH调至适当水平(pH2.5、3.5、4.5、5.5)，同时制备自然pH下的样品(即采用未调pH的去离子水制备)。然后加入蛋白样品配成1%w/v的蛋白质溶液。采用610nm波长，以未加蛋白样品时的溶液作为参比，测定蛋白溶液的透光率(T)。

表4.实施例1～8及比较例1～4样品透光率的测定结果

由表4结果可知，实施例1和比较例1、2和4样品在不同的pH条件下，透光率均为100%，溶液完全澄清透明。

测试例5.样品及原料的灰分测定

依据GB50094-2010(食品安全国家标准，食品中灰分的测定)，对原料(即大豆分离蛋白)、实施例1～8及比较例1～4样品的灰分进行测定，结果如下：

表5.原料、实施例1～8及比较例1～4样品灰分的测定结果

表中：*大豆分离蛋白1，益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司产品，用于实施例1～6和比较例1～4中；**大豆分离蛋白2，青岛元润化工有限公司产品，用于实施例7～8中

由表5灰分测定结果可知，比较例1～3样品的灰分很高，因为在反应和后处理过程中，引入很多的酸和/或碱，导致灰分过高。而实施例1～8样品在制备和后处理过程中，没有引入任何酸或碱；比较例4虽然在制备过程中引入了盐和酸，但是经过超滤后，只截留所需的蛋白组分，除去了其中的盐分，因此实施例1～8和比较例4灰分均低于5%，与原料相当。

测试例6.样品及原料的植酸含量分析

样品和原料中的植酸含量，采用反相高效液相色谱法测定，测试条件如下：

分析柱：Zorbox C₈色谱柱，6μm，250cm×4.6mm；

流动相：0.025mol/L磷酸二氢钾水溶液，流速为0.5mL/min；

柱温：55℃

紫外检测波长：254nm；

植酸标准溶液浓度为：10g/L

植酸提取液：5%三氯乙酸

植酸含量测试的结果如下：

表6.原料、实施例1～8及比较例1～4样品的植酸含量/%

表中：*大豆分离蛋白1，益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司产品，用于实施例1～6和比较例1～4中；**大豆分离蛋白2，青岛元润化工有限公司产品，用于实施例7～8中

由表6可知，实施例1～8和比较例1～3的植酸含量均在1.9～2.4%之间，与原料(2.1或2.3%)相当；而比较例4，由于在制备过程中，蛋白中的植酸盐先被盐酸酸解，再被超滤去除，致使比较例4样品的植酸含量降为0.7%。

测试例7.样品保存期分析

如下测定样品的保存期：将实施例1～8及比较例1～4样品配成10%(w/v%)的水溶液，放于恒温(35℃)恒湿(60%)培养箱中，感官评价样品开始发馊的时间/h。感官评价由感官评价小组完成(由25位做过感官评价和训练的有经验人员组成)，并由半数以上人员认定的发馊时间为准。

表7.原料、实施例1～8及比较例1～4样品的发馊时间/h

表中：*大豆分离蛋白1，益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司产品，用于实施例1～6和比较例1～4中；**大豆分离蛋白2，青岛元润化工有限公司产品，用于实施例7～8中

由表7可知，实施例1～8和比较例1～3的发馊时间均在26～30h之间，与原料(28或29h)相当；而比较例4，由于在制备过程中，蛋白质中具有抗氧化和保鲜作用的植酸盐先被盐酸酸解，再被超滤去除，而含量降低(见表6)，由此导致其保存期明显下降，仅为17h。

测试例总结

综上所述，比较例1样品虽然有很好的溶解性和透光性，但是由于在后处理过程中调节pH至4.5并在4℃条件下放置2h，使得其中的部分大分子组分沉淀，导致样品中20～80kDa组分含量下降；并且，比较例1在后处理过程中，先调节pH至4.5，再调至7.0，引入了酸碱，导致产品的灰分升高为9.34%。

比较例2～4样品虽然在不同的pH条件下均有很好的溶解性和透光性，但是比较例2～4样品主要为20kDa以下组分；并且，比较例2和比较例3由于在反应和后处理过程中引入了酸和/或碱，导致产品的灰分过高；此外，比较例4由于在制备过程中植酸盐含量降低，导致样品的保存期与原料相比明显下降。

与比较例相反的是，采用本发明方法在实施例1～8中制备的蛋白质产品，分子量主要集中在20～80kDa，灰分含量均低于5%，植酸含量均在1.9～2.4%之间，保存期均大于26h，并且产品具有很好的溶解性和透光性，尤其是采用实施例1方法制备的产品，在各pH下均能溶解，且溶液澄清透明。

上述优点使得本发明的产品应用到食品、保健品、药品等以后具有较低的灰分、较长的保存期和较好的外观。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种可溶性大豆蛋白材料，其特征在于，以所述大豆蛋白材料重量计，所述大豆蛋白材料中至少75重量%，优选至少80重量%的蛋白组分的分子量为20～80kDa，灰分含量低于8重量%，优选低于5重量%，更优选低于4.8重量%，植酸含量为0.5～5.0重量%，优选为1.9～2.4重量%。

2.一种可溶性大豆蛋白材料，其特征在于，所述大豆蛋白材料通过在pH5.0～8.5条件下用中性蛋白酶水解大豆分离蛋白制得；优选的，以所述大豆蛋白材料重量计，所述大豆蛋白材料中至少75重量%，优选至少80重量%的蛋白组分的分子量为20～80kDa，灰分含量低于8重量%，优选低于5重量%，更优选低于4.8重量%，植酸含量为0.5～5.0重量%，优选为1.9～2.4重量%。

3.如权利要求1或2所述的可溶性大豆蛋白材料，其特征在于，所述大豆蛋白材料能溶于水或水性溶液，且溶液澄清透明，优选的，所述水或水性溶液的pH为1～14，优选pH2～12，更优选pH2.5～10。

4.一种制备可溶性大豆蛋白材料的方法，其包括步骤：

(a)在pH5.0～8.5下，用中性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解；

(b)收集酶解上清液中的可溶性大豆蛋白材料，其中步骤(a)和(b)之间不包括调节pH的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶是植物来源、动物来源、微生物来源、合成或修饰的中性蛋白酶，优选的，所述微生物来源为霉菌来源或细菌来源；所述中性蛋白酶优选来源于：菠萝、木瓜、枯草杆菌、芽孢杆菌、酵母、放线菌、链霉菌、曲霉、铜绿色假单胞菌、单孢菌、变形杆菌、小球菌，更优选菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、COROLASE中性蛋白酶、SUKAPro NE中性蛋白酶、庞博中性蛋白酶、诺维信中性蛋白酶，优选的COROLASE中性蛋白酶为COROLASE7089，优选的SUKAPro NE中性蛋白酶为SUKAPro NE PW100中性蛋白酶，优选的庞博中性蛋白酶为南宁庞博1398中性蛋白酶，优选的诺维信中性蛋白酶为诺维信Neutrase0.8L。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)的酶解反应条件为选自下组中的一种或多种：

(i)所述pH条件的范围为：pH5.0～8.5，优选pH5.5～8.0，更优选pH6.0～7.5；

(ii)所述酶解的温度范围为25～70℃，优选35～65℃，更优选45～55℃；

(iii)所述酶解的时间为0.5～24h，优选1～12h，更优选2～8h；

(iv)以大豆分离蛋白的重量为基准计，所述中性蛋白酶的重量百分比范围为0.5～10重量%，优选0.5～3重量%；和

(v)所述中性蛋白酶的酶活大于5万u/g。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的收集通过选自下组的方式进行：离心、沉淀、层析、电泳、吸附或其组合。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：在步骤(a)之前制备、分离和/或纯化大豆分离蛋白，或配制大豆分离蛋白溶液，优选所述溶液的浓度为1～10g大豆分离蛋白/100mL水或水性溶液；在步骤(a)和(b)之间使中性蛋白酶失活；在步骤(b)之后对所得的可溶性大豆蛋白材料进行分离、纯化、干燥、包装、储存和/或应用。

9.如权利要求1～3中任一项所述的可溶性大豆蛋白材料、或采用如权利要求4～8中任一项所述的方法制得的可溶性大豆蛋白材料在食品、制药、化妆品、保健品、农业生产及加工中的应用。

10.一种组合物，其包含如权利要求1～3中任一项所述的可溶性大豆蛋白材料、采用如权利要求4～8中任一项所述的方法制得的可溶性大豆蛋白材料；优选，所述组合物为食品、药品、化妆品、保健品或农产品。