CN104968669A - 氘化核糖核苷、n-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的合成 - Google Patents

氘化核糖核苷、n-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的合成 Download PDF

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Abstract

本发明涉及以下的合成：能够展现出生物化学上有用且生物学上有价值的特性、因此具有潜在治疗用途的高纯度氘化糖、氘化亚磷酰胺、氘化核碱基、氘化核苷、氘化寡核苷酸、以及限定序列的氘化RNA。

Description

氘化核糖核苷、N-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的合成
发明领域
本发明涉及寡核苷酸以及寡核苷酸合成，并且更具体来说，涉及修饰的RNA、亚磷酰胺和RNA寡核苷酸，以及用于合成RNA的方法，所述RNA含有供合成修饰的寡核苷酸用的部分或完全饱和的氘化糖和/或核碱基以及氘化亚磷酰胺。
发明背景
本发明涉及以下的合成：能够展现出生物化学上有用且生物学上有价值的特性、因此具有潜在治疗用途的高纯度氘化糖、氘化核碱基、氘化核苷，以及限定序列的氘化RNA。过去数十年中，已经开发出许多RNA和DNA序列，其用于治疗剂、诊断剂、药物设计、细胞内环境中RNA序列的选择性抑制，以及阻断细胞内存在的不同类型的RNA的功能。一种方法是使用反义技术。反义寡核苷酸可用于在哺乳动物细胞中特异性地抑制不当基因表达。反义寡核苷酸可用于杂交并且通过活化RNA酶H而抑制RNA、典型地信使RNA的功能。首先，寡核苷酸通过活化RNA酶H影响靶RNA的水平，所述RNA酶H裂解DNA/RNA杂合体的RNA链。因此，已提议反义寡核苷酸用于治疗疾病。尽管所述技术有潜力成为用于所有疾病的强大工具，但包括分子稳定性在内的数个问题阻碍了所述技术成为主要疾病对抗疗法。
另一方法聚焦于使用基于核酸的分子使基因表达在mRNA水平沉默。RNA干扰(RNAi)提供选择性基因抑制的更大潜力，并且提供控制和管理各种生物化学以及药理学过程的更大希望。早期研究说明秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的RNA干扰是由21和22个核苷酸的RNA介导，参见Fire等，Nature，391，806-811，1998。这由说明以下的研究进一步证实：通过小的双链RNA特异性抑制基因表达的一般现象是由21和22个核苷酸的RNA介导(Genes Dev.，15，188-200，2001)。同时进行的研究证实通过小的双链(dS)RNA对特异性基因表达所致的所述现象在无脊椎动物和脊椎动物中是相似的。各种研究已说明RNAi可用作选择性和特异性基因抑制和调控的强大工具，参见Nishikura,K.，Cell，107，415-418，2001；Nykanen等，Cell，107，309-321，2001；Tuschl,T.,Nat.Biotechnol.,20,446-448,2002；Mittal,V.,Nature Rev.,5,355-365,2004；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99,6047-6052,2002；Donze,O.&Picard,D.,Nucl.Acids.Res.,30,e46,2002；Sui,G等，Natl.Acad.Sci.USA，99，5515-5520，2002；Paddison,等，Genes Dev.，16，948-959，2002。
除了使用天然双链(ds)RNA序列，化学修饰的RNA已示出在用于siRNA活性的序列中使用2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿糖核酸(FANA)而在哺乳动物细胞中引起类似的或增高的RNA干扰，参见Dowler等，Nucl.Acids Res.，34，1669-1675，2006。已寻求改进SiRNA特性的各种其他修饰，包括改变骨架化学、2’-糖修饰、核碱基修饰，参见Nawrot,B等，Med.Chem.，6,913-925，2006以及Manoharan，M.Curr.Opin.Chem.Biol.，8，570-579，2004的综述。尽管已容许SiRNA的修饰，但数个研究指示毒性增大且功效降低，参见Harborth,等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，13，83-105，2003。Chiu等证明尽管2’-O-甲基修饰维持A形式的RNA样螺旋，但确实保留了SiRNA活性，或在一些情况下，降低了SiRNA活性，这取决于序列内所述修饰的数量，参见RNA，9，1034-1048，2003。还已示出可在有义链中对序列进行广泛2’-O甲基修饰，而不损失SiRNA活性，参见Kraynack,B.A.,Baker,B.F.，RNA，12，163-176，2006。已将赋予高结合亲和力的双环锁定核酸(LNA)引入SiRNA序列，尤其是在避免SiRNA序列的中心区的情况下，参见Braash等，Biochemistry，42，7967-7995，2003。类似地，已示出含有刚性构象的阿卓糖醇糖修饰的寡核苷酸(ANA)以一种序列特异性方式与RNA形成可降解的双链体。另外，ANA已示出保留A(RNA类型)构象。Fisher,M.等，Nucl.Acids Res.，35，1064-1074，2007证明与未修饰的对照相比，靶向MDR1基因的ANA修饰的siRNA展现出改善的功效、在修饰接近有义或反义链的3’端时尤其有效。
数个研究已指示siRNA通过各种递送系统吸收的潜力。所述递送系统然后可在治疗剂的开发中利用。胆固醇缀合的siRNA可实现递送到细胞中并且使基因表达沉默。另外，脂质缀合的siRNA、胆汁酸以及长链脂肪酸可介导siRNA吸收到细胞中并且体内使基因表达沉默。siRNA缀合物在组织中的有效且选择性吸收取决于与脂蛋白颗粒的最大缔合性、脂蛋白/受体相互作用以及跨膜蛋白介导的吸收。高密度脂蛋白将siRNA的递送导向到肝脏、肠管、肾脏以及含有甾类的器官中。此外，LDL将siRNA主要导向到肝脏中。研究指示LDL受体涉及在siRNA的递送中。因此，已提议siRNA可经设计具有化学修饰以便保护免于核酸酶降解、消除炎症、降低脱靶基因沉默，并且从而提高对靶基因的有效性。脂质和允许增高的细胞吸收的其他亲脂性分子的递送媒介物或缀合物对于治疗开发是必需的。所述siRNA目前正开发用于人类靶标验证，并干扰疾病途径且开发新的领域用于药物开发。
siRNA的有义链的3’端可被修饰，并且在此端附接配体是最合适的，参见例如Ya-Lin Chiu和Tariq Rana，RNA，9，1034-1048，2003；M.Manoharan，Curr.Opin.Chem.Biol，6，570-579，2004；Nawrot,B.和Sipa,K.，Curr.Top.Med.Chem.，6，913-925，2006；Scaringe,S.等，Biotechnol.，22，326-30，2004。亲脂性或疏水性基团的引入和siRNA递送的增高以及靶标的最优化已通过生物缀合解决并实现。通常，附接在有义链的3’端进行，但可在反义链的3’端进行。核酸酶抗性siRNA的设计曾为尝试开发有效治疗剂的深入研究和开发的主题。因此，碱基修饰如2-硫代尿苷、假尿苷以及二氢尿苷已说明了对RNA分子的构象和相关联的生物活性的作用，参见Sipa等，RNA，13，1301-1316，2007。Layzer等，RNA，10，766-771，2004说明2’-修饰的RNA、尤其是2’-氟对核酸酶具有极大的抗性并且体内具有生物活性。Dande等，Med.Chem.，49，1624-1634，2006使用4’-硫代修饰的糖核苷组合2’-O烷基修饰来改进siRNA特性和RNAi增大。Li等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，329，1026-1030，2005和Hall等，Nucl.Acids Res.，32，5991-6000，2004说明用siRNA的硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯体内置换核苷酸间磷酸酯。
除了核苷的体内稳定性和适当修饰，siRNA分子、RNA分子、适体以及合成DNA分子的生物缀合要求细胞膜渗透性的关键特征。不充分的跨膜细胞吸收限制siRNA、其他单链RNA或甚至各种DNA分子的实用性。因此，已经示出附接在siRNA的3’端的胆固醇改善体内细胞运输和基因的治疗性沉默，参见Soutschek等，Nature，432，173-0178，2004。除了胆固醇，已开发了各种缀合，包括天然和合成蛋白转导结构域(PTD)，还称为细胞渗透肽(CPP)或膜永久肽(MPP)。PTD为能够与质膜相互作用的短的氨基酸序列。MPP-siRNA缀合物的吸收迅速发生。所述肽可优选地缀合至链的3’端。PEG(聚乙二醇-寡核苷酸)缀合物已用于各种缀合复合物，并且在靶细胞中吸收后具有显著的基因沉默作用，参见Oishi等,.Am.Chem.Soc.，127，1624-1625，2005。适体已用于siRNA的位点特异性递送。考虑到适体对其靶标具有高亲和力，siRNA的缀合物充当优良的递送系统并且使得有效抑制靶基因表达，参见Chu等，Nucl.Acids Res.，34(10)，e73，2006。这些分子可缀合在siRNA或其他生物活性寡核苷酸的3’端。在3’端的各种脂质缀合可附接至通过本发明描述的方法合成的寡核苷酸并且可用于寡核苷酸的有效内化。亲脂性部分由羟基官能组成，以合成亚磷酰胺。类似地，亲脂性部分可在末端处具有羧酸官能。后者可偶联至具有间隔子的3’-氨基，这通过使用DCC(二环己基碳二亚胺)或类似的偶联剂最后添加反向合成的寡核苷酸的氨基连接体如C-6氨基连接体亚酰胺至羧酸部分合成，参见Paula等，RNA，13，431-456，2007。
微小RNA(miRNA)为一大类非编码RNA，其已示出在基因调控中起作用，参见Bartel，D.P.Cell，116，281-297；He等Nat.Rev.Genet，5:522-531，2004；Lagos-Quintana等，Science，204:853-858，2001。据估计在整个人基因组中散布有至少1000种miRNA。许多这些miRNA已示出下调大量靶mRNA，参见Lim等，Nature，433:769-773，2005。miRNA的不同组合可涉及在哺乳动物细胞中靶基因的调控中。siRNA已经示出充当miRNA，参见Krek等，Nat.Genet.，37:495-500，2005；Doench等，Genes Dev.，17:438-442，2003。微小RNA具有极大潜力在基因调控中作为治疗剂，Hammond,S.M.，Trends Mol.Med.12:99-101，2006。当前大量努力正致力于了解miRNA途径、其在发育和疾病中的作用以及其在癌症中的作用。另外，正开发miRNA靶标用于治疗和诊断开发。鉴别出大量miRNA，并且通过微测定、PCR和信息学确定其作用。设计来靶向miRNA的RNA的合成还要求RNA合成和类似的修饰，如对于SiRNA所要求的，以稳定RNA和生物缀合，从而产生较好的细胞吸收。本发明将极大地加速这一研究和开发的步伐。
治疗等级的RNA、反义RNA或siRNA的合成要求寡核苷酸的3’端的修饰或标记。在siRNA情况下，通常为有义链的3’端。使用3’至5’合成法，要求亲脂性、长链配体或发色团的3’端修饰的RNA的合成具有挑战性，并且要求对应的固体载体。所述合成通常导致低的偶联效率和总体上较低的最终寡核苷酸纯度，这是因为大量截短序列含有所需的疏水性修饰。本发明的作者通过开发反向RNA单体亚磷酰胺用于在5’至3’方向上进行RNA合成解决了这一问题。这一方法产生极清洁的寡核苷酸合成，因此允许在3’端清洁且有效地引入各种修饰。
为增大稳定性，已合成含有脂质的寡核苷酸。附接脂质提供RNA的有效递送和寡核苷酸的细胞浓度的增大。疏水性分子如胆固醇可结合LDL颗粒和脂蛋白以便活化涉及这些蛋白质的递送过程，从而运送寡核苷酸。脂质化的核酸还可降低寡核苷酸的亲水性。还示出脂质性核酸改善寡核苷酸的功效，参见Shea等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6553，1989；Oberhauser,B.和Wagner,E.，Nucleic Acids Res.，20，533，1992；Saison,-Behmoaras等.The EMBOJournal，10，1111，1991；Reed等，Bioconjugate Chem.，2，217，1991；Polushin等，Nucleosides&Nucleotides，12，853，1993；Marasco等，Tetrahedron Lett.，35，3029，1994。将一系列疏水性基团如金刚烷、二十碳烯酸、胆固醇以及二(十六烷基)二醇在3’端附接至寡脱氧核苷酸序列并且杂交至互补的RNA序列。发现Tm未受影响，这指示所述基团不干扰寡杂交特性，参见Manoharan等，Tetrahedron Lett.，36，1995；Manoharan等，Tetrahedron Lett.，36，3651-3654，1995；Gerlt，J.A.Nucleases，第二版，Linn,S.M.,Lloyd,R.S.,Roberts,R.J.,编.Cold Spring Harbor Laboratory Press，第10页，1993。
为有效递送合成的RNA分子，PEG附接至各种寡核苷酸已示出有利特性。PEG-寡聚物已通过防止快速消化而示出酶促稳定性。热熔融行为不受影响，从而保留双链结构(formation)的特性。Srivastava等，Nucleic Acids SymposiumSeries，2008，52，103-104最近开发了一种反向RNA合成方法，用于将亲脂性且大的分子清洁不接至合成的RNA。
现有技术说明
已针对许多核苷和寡核苷酸进行氘标记研究与NMR分析。DNA和RNA的结构和动力学对于了解其生物学功能是重要的。这通过多种物理化学技术来调研。在这些技术中，核磁共振(NMR)光谱法已广泛用作强大工具，因为其提供暗示局部结构变异的构象信息和一定生物学条件下的动力学。这已使用强大计算机和高共振能仪器而改进。随着磁场增大，较高灵敏度降低获得优质光谱所需的寡聚物的量，并且增大共振信号的分散，从而降低由于第二级J耦合至第一级引起的共振重叠所致的光谱复杂性。进行描述将氘并入脱氧核苷、核糖核苷以及修饰的核苷的特定位置的大多数研究，以尝试通过质子核磁共振(NMR)确定寡核苷的结构以及构象细节。寡核苷酸的质子NMR光谱通常相当复杂并且不揭示出构象与结构信息。由于寡核苷酸具有显著重叠NMR共振，氘化寡核苷酸的结构确定已用于生物功能性DNA或RNA分子的NMR结构确定。为克服与共振相关的问题，研究人员开发了非均一氘标记技术，参见Foldesi等，J.Tetrahedron，1992，48，9033；Foldesi等，J.,Biochem.Biophys.Methods，1993，26。氘标记的寡核苷酸简化了NMR光谱，从而允许按明确的方式从大分子的小结构域确定J耦合与NOE体积，参见Glemarec等，J.Nucleic Acids Res.，1996，24，2002和Ludwig，J.Acta Biochem.Biophys Acad Sci.，1981，16，131。
类似地，大量寡DNA和RNA的位点特异性氘化已用于通过“NMR窗口”概念研究NMR结构，在所述窗口中仅寡核苷酸的小节段是NMR可见的。使用这种方法来解决以下各物的NMR结构：21聚体RNA发卡环，参见Nucleic AcidsResearch1996 24:1187和Nucleosides and Nucleotides 1997，5&6，743；和31聚体茎-内环-茎-内环-茎-发卡环RNA。非对映特异性C-2’(寡DNA中氘标记的核苷区段(Journal Tetrahedron，1995，51，10065))成功用在NMR解释，降低的自旋扩散收集以及3JH1'、H2”以及3JH1'、H2”耦合常数的提取中。
Huang等，Acids Research，1997，25，4758-4763示出在寡核苷酸的二维(2D)NOESY光谱中，如果嘌呤的H-8和嘧啶的H-6被氘置换，那么使核碱基与糖质子相关联的整个交叉峰消失。类似地，研究人员关注通过2H NMR研究蛋白质与DNA相互作用动力学的作用。固态2D NMR提供关于寡核苷酸中各种官能团的移动的有价值信息。Chirukul和其共同工作者示出特异性氘化在确定所述结构特征中起着极其重要的作用，参见Nucleosides，Nucleotides and Nucleicacids，2001，20，1903-1913。
代替氢，用氘取代的酶识别或酶促结合未受到不利影响。特定序列的酶识别是寡核苷酸关于其特异性作用的生物化学相互作用的第一步，并且氘标记不会改变位点识别的生物化学过程。类似地，已知双链的杂交不受氘标记影响，这是由于氘和氢原子半径对于识别模式的任何破坏都是极其接近的。
预期代替氢氘在寡核苷酸的糖部分中的多个共价标记(碳-氢键成为碳-氘键)减缓寡核苷酸的消化速率，寡核苷酸的消化在细胞环境中用外切酶和内切酶快速发生。寡核苷酸的快速消化由寡核苷酸的较短半衰期和从身体的清除得以证明。与DNA分子相比，这在RNA分子方面是更为显著的。预期治疗性寡核苷酸的缓慢消化为治疗候选物增添了额外的优点，而同时其他物理或化学特性不受影响。期望氘化核糖寡核苷酸的各种生物化学作用，预期氘化寡聚物减缓寡核苷酸消化成较小的片段，并且不具有关于氢键合、RNA酶H校正活性或通过RISC复合物识别的作用。细胞内水解或氘交换可导致氧化氘(D2O)的释出。
已常规地进行氘交换的酶促法用于氘标记。然而，交换法不完全，这是由于酶促反应中存在平衡。期望氘标记的寡核苷酸将在细胞环境中用氢类似地交换氘，从而导致氧化氘在细胞环境中释放。由于氧化氘已知为一种营养剂，因此本发明的寡核苷酸可提供营养价值。
已相当广泛地进行使用氘交换用于核苷和寡核苷酸的光谱分配。核碱基残基的氘化已描述在质子在C8-嘌呤和C5-胞嘧啶处用氘代亚硫酸氢铵在pH 7.8下在脱氧寡聚物中进行交换中，所述交换导致90-95原子％的2H并入。Brush等，Biochemistry 1988，27，115；Brush等.Am.Chem.Soc.1998，110，4405描述了在胸苷的C5-甲基处在2H2O中进行的铂催化的交换。
已经开发了多种多样的酶促和化学方法来用于在糖与核苷水平二者上并入氘，从而提供高水平的氘并入(D/H比)。氘交换的酶促法通过具有低并入水平并且提供显著水平的杂散共振。酶促并入具有另外的复杂性，这是由于分离氘化单核苷酸区段所要求的繁琐的分离技术。Schmidt等，Ann.Chem.1974，1856；Schmidt等，Chem.Ber.，1968,101，590描述了5',5”-2H2-腺苷的合成，其是由2',3'-O-异亚丙基腺苷-5'-甲酸或甲基-2,3-异亚丙基-β-D-核糖呋喃醛糖酸(furanosiduronic acid)制备，Dupre,M.和Gaudemer,A.，TetrahedronLett.1978，2783。Kintanar等，Am.Chem.Soc.1998，110，6367报道了可使用硼氘化钠或氘化铝锂(98原子％的2H并入)，通过还原适当的5'-醛，获得5'-氘代腺苷与5'(R/S)-氘化胸苷的非对映异构体混合物。Berger等，Nucleoside&Nucleotides 1987，6，395描述了通过在2H2O/吡啶混合物(1:1)中加热醛、接着用NaBD4还原醛将2'脱氧鸟苷的5'-醛衍生物转化成5'或4'-氘代-2'-脱氧鸟苷。
Ajmera等，Labelled Compd.1986，23，963描述了获得4'-氘标记的尿苷和胸苷(98原子％的2H)的程序。Sinhababu等，J.Am.Chem.Soc.1985，107，7628)证明了在糖合成过程中，在使用硼氘化钠立体选择性还原1,2:5,6-二-O-异亚丙基-B-D-己呋喃糖-3-酮水合物成为1,2:5,6-二-O-异亚丙基-3-氘代-B-D-己呋喃核糖并且随后进一步进行核苷合成时，氘并入在腺苷的C3'(97原子％2H)处。Robins等，Org.Chem.1990，55，410报道了在通过硼氘化钠在乙酸中还原2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)3-酮核苷时，以实际上完全的立体选择性在腺苷的C3’处大于95原子％的2H并入的合成。David,S.和Eustache,J.,Carbohyd.Res.1971，16，46以及David,S.和Eustache，J.,Carbohyd.Res.1971，20，319描述了2’-脱氧-2’(S)-氘代-尿苷和胞苷的合成。所述合成通过使用1-甲基-2-脱氧-2’-(S)-氘代呋喃核糖苷进行。
Radatus,等，J.Am.Chem.Soc.1971，93，3086描述了用于合成2’-单氘化(R或S)-2’-脱氧胞苷的化学程序。这些结构是由在用氘化铝锂立体特异性还原2,3-脱氢-己吡喃糖并且氧化所得烯糖获得的选择性2-单氘化-2-脱氧-D-核糖合成的。Wong等J.Am.Chem.Soc.1978，100，3548报道了通过涉及形成的反应序列和LiAlD4还原烯酮二硫缩醛衍生物，由D-阿拉伯糖获得-脱氧-1-氘代-D-赤型-戊糖、2-脱氧-2(S)-氘代-D-赤型-戊糖以及2-脱氧-1,2(S)-二氘代-D-赤型-戊糖。
Pathak等.J.，Tetrahedron 1986，42，5427报道了通过用LiAlD4还原性打开适当甲基2,3-无水-β-D-呋喃核糖苷或β-D-呋喃木糖苷，立体特异性合成所有八种2’或2”-氘代-2’-脱氧核苷。Wu等.J.Tetrahedron 1987，43，2355描述了对于脱氧与核糖核苷二者所有2’,2”-二氘代-2’-脱氧核苷的合成，其是由糖的C2’的氧化开始并且随后NaBD4或LiAlD4用还原，接着用氘化三丁基锡脱氧。Roy等.J.Am.Chem.Soc.1986，108，1675报道了2’,2”-二氘代-2’-脱氧鸟苷和胸苷可由2-脱氧核糖5-磷酸使用2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶在2H2O中制备，从而取得大约90原子％的氘化。
因此，显然糖残基的各位置可选择性地进行标记。许多这些氘化核苷已用于关于核苷和寡核苷酸的内部运动的固态2H-NMR研究，参见Hiyama等J.Am.Chem.Soc.1989，111，8609；Alam,T和Drobny,G.P.，Biochemistry，1990，29，3421；Alam等,.Biochemistry，1990，29，9610；Huang等，J.Am.Chem.Soc.1990，112，9059；Drobny,G.P.等，Biochemistry，1991，30，9229。在固态2H-NMR光谱法的温度依赖性线形分析中，2’对比2”标记的立体选择性或氘化的水平不起显著作用。使用特异性地氘标记的核苷酸用于在溶液研究中简化1D和2D 1H-NMR光谱对于结构信息并不是十分有用。然而，在1D NMR研究中氘化的最广泛使用是由Danyluk等进行的。这些工作人员以一种冗长的方式从在2H2O中生长的蓝绿藻的RNA消化物分离预氘化的2H标记的单核苷酸(约90原子％的2H并入)。这些预氘化的核苷区段然后用于获得多种多样的部分氘化的二聚体和三聚体，以用于在1D 1H-NMR光谱中(200-300MHz)共振分配目的。进行4’,5’,5”-2H3-腺苷的合成，并且将其偶联至适当阻断的腺苷3-亚磷酸，以得到ApA*(pA*4’,5’,5”-2H3-pA)。此二聚体允许磷与H-3'之间的差异的明确测量(Kondo等，Am.Cem.Soc.1972，94，5121；Kondo，Labeled Compd.1973，9，497；Ezra等，Biochemistry，1975，53，213；Kondo和Danylik.，Biochemistry，1976，15，3627；Lee等，Biochemistry，1976，15，3627；Ezra等，Biochemistry，1977，16，1977。类似地，可进行4’,5’,5”-2H3-鸟苷的合成以合成富含鸟苷的寡核苷酸。
开发立体特异性氘化的可用替代方法以合成聚氘化糖。此方法在2H2O中使用阮内镍催化剂采用氢与氘在携带羟基的碳处的交换(即，携带羟基的碳的亚甲基和次甲基质子)。详细研究揭示了结构依赖性交换率差异、高水平的差向异构作用、显著较低程度的脱氧以及氘化水平重现的难题(Balza等，Res.，1982，107,270；Angyal等.Carbohydr.Res.1986，157，83；Koch等.Res.1978，59，341；Wu等.J.Org.Chem.1983，48，1750；以及Angyal等Res.1986，157，83)。
各种技术可用于合成完全氘化的脱氧和核糖核苷。因此，在一种方法中，通过氘化阮内镍-2H2O与糖的交换反应，制备在2、3’以及4’位置特异性标记的许多氘化核苷。所述程序由以下组成：通过阮内镍-2H2O交换反应在甲基β-D-吡喃阿糖苷的2、3以及4位进行氘化，接着通过氘化三丁基锡还原性消除2-羟基，以得到甲基β-D-2,2’,3,4-2H4-2-脱氧吡喃核糖苷，将其转化成甲基β-D-2,2’,3,4-2H4-2-脱氧呋喃核糖苷并且糖基化以得到各种2,2',3,4-2H4-核苷(对于H3’&H4’，>97原子％的2H并入；对于H2和H2’，约94原子％的2H并入)(Pathak,T.,Chattopadhyaya,J.Tetrahedron 1987,43,4227；Koch,H.J.,Stuart,R.S.,Carbohydr.Res.1977,59.C 1；Balza,F.,Cyr,N.,Hamer,G.K.,Perlin,A.S.,Koch,H.J.,Stuart,R.S.,Carbohydr.Res.1977,59,C7；Koch,H.J.,Stuart,R.S.,Carbohydr.Res.1978,64,127；Koch,H.J.,Stuart,R.S.,Carbohydr.Res.1978,59,341；Balza,F.,Perlin,A.S.Carbohydr.Res.,1982,107,270；Angyal,S.J.,Odier,L.Carbohydr.Res.,1983,123,13.；Wu,G.D.,Serianni,A.S.,Barker,R.J.,Org.Chem.1983,48,1750；Angyal,S.J.,Stevens,J.D.,Odier,L.Carbohydr.Res.1986,157,83；Kline,P.C.,Serianni,A.S.Magn.Reson.Chem.,1988,26,120；Kline,P.C.,Serianni,A.S.Magn.Reson.Chem.,1990,28,324；Robins,M.J.,Wilson,J.S.,Hansske,F.,J.Am.Chem.Soc.1983,105,4059。
甲基β-D-赤型呋喃糖苷在用氘化阮内镍处理时产生甲基β-D-2,3,4(S)-2H3-赤型呋喃糖苷(约75原子％的2H并入在C2和C4(S)位置，并且100原子％的2H并入在C3)(Kline,P.C.；Serianni,A.S.Magn.Reson.Chem.,1988,26,120)。将这种糖转化成D-3,4,5(S)-2H3-核糖。这些核苷随后还原成对应的3’,4’,5’(S)-2H3-2’～脱氧核苷(Koch,H.J.；Stuart,R.S.Carbohydr.Res.1978,64,127；Kline,P.C.,Serianni,A.S.,Magn.Reson.Chem.,1990,28,324)。类似于化合物3’,4’,5’(S)-2H3-核糖核苷，1’,2’,3’,4’,5’,5”(S)-2H6-核糖核苷可由完全氘化且适当保护的核糖起始合成。
发明概述
基于寡核苷酸的治疗剂是合理药物设计方法的有力组成部分，并且许多寡核苷酸当前已上市或处于各种临床试验阶段。过去已在脱氧糖以及嘌呤和嘧啶碱基的特定位置合成氘修饰的核苷。已合成基于磷酸三脂技术或亚磷酰胺的氘化DNA合成子，并且将其用于合成限定序列的寡核苷酸。这些研究仅是针对DNA和RNA的构象研究、确定酶辅助的催化反应的活性位点的目的。然而，尚未针对在人体内的治疗性应用或作为生物或生物化学试剂可引出的作用来研究氘化寡核苷酸。
本发明描述了氘标记的亚磷酰胺、具有固体载体封端(cap)的核糖单元、寡核苷酸、一种用于合成氘标记的核苷和寡核苷酸的方法、以及用于合成在每个位置所含有的氘在0.1％至98％范围的氘化核苷和寡核苷酸的方法。已知百分比的氘并入核苷后，所述核苷可在后续步骤中进一步修饰，直到发生供固相寡核苷酸合成用的亚磷酰胺或固体载体结合的核苷的合成。在另外的步骤中将维持0.1至98％的氘比率。过去据我们所知未曾提出或未进行所述特定且受控的氘化。所形成的氘化核糖寡核苷酸提供具有增高的稳定性的RNA序列。
并不预期对寡核苷酸进行氘标记会呈现毒性作用。在糖、嘌呤、嘧啶碱基的所选择位置的选择性氘修饰的寡核苷酸，或糖位置以及核碱基的完全氘化将促进寡核苷酸的生物特性的改进。预期在核糖的糖部分的各种位置特异性氘化的寡核苷增大酶促稳定性并且实质上增大治疗性寡核苷酸的稳定性。已知氘取代不影响酶识别或酶促结合。已利用位点特异性原子转移来用于特异性氘标记的十二聚体的裂解的结构信息，参见Voss,等，J.Am.Chem.Soc.，1990，112，9669-9670。特定序列的酶识别是寡核苷酸关于其特异性作用的生物化学相互作用的第一步，并且氘标记不会改变位点识别的生物化学过程。类似地，双链的杂交不受氘标记影响。
期望氘标记的寡核苷酸将不影响通过沃森-克里克碱基配对机制(WatsonCrick base pairing mechanism)，胡格斯腾(Hoogsten)或其适用于DNA/DNA杂交、DNA/RNA杂交、RNA/RNA杂交的其他杂交机制与互补链的氢键合。预期在基于反义的寡聚物治疗性方法中所涉及的氘化DNA与互补RNA之间的RNA酶H裂解不受共价附接至糖骨架或核碱基的氘的存在影响。因此，氘标记的寡核苷酸将在反义治疗作用模式中起作用。另外，应有可能开发氘化siRNA用于治疗应用。基于呈现用于合成核糖核苷和寡核苷酸(寡核苷酸链的核苷中具有一个或多个氘)各种流程，期望可实现设计具有选择性或完全氘化的RNA序列的适体。将在糖和核碱基中、在稳定且总体上不可交换的位置处如在碳氢键(C-H)处进行合成和在核苷中进行氘标记的化学方法。然而，在细胞中在略碱性pH下有望存在缓慢的氘与氢交换。由于通过体内交换机制(C-D→C-H)氘的缓慢释放，所述氘标记的寡核苷酸将提供营养上有益作用的优点。因此，氘标记的寡核苷酸可具有取代在核苷的各种不可电离位置且在寡核苷酸中具有天然氢原子的治疗性寡核苷酸的巨大潜力。为确定寡核苷酸的核苷中特定氘化水平的作用，将进行特定共价碳氢键的极低水平的氘化如0.1％一直到98％氘化，并且将研究所述寡核苷酸的生物化学和生物学效应以及作用。所述系统性生物研究将提供对药物和治疗剂开发的更好指导。据我们所知未曾提出或未进行所述研究。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指多个核苷酸按由天然或修饰的杂环碱基部分所限定的特定序列接合在一起。代表性杂环碱基部分包括但不限于核碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶以及其他非天然存在的和天然的核碱基如黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤、氧杂、氨基、巯基、硫烷基、硫烷基、羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤。如本文所述的修饰的核碱基定义了合成的核碱基或已从天然存在状态改变的核碱基，如氘化腺嘌呤、氘化胞嘧啶、氘化鸟嘌呤、以及氘化尿嘧啶。
因此，本发明的主要目的是传授氘化核苷、亚磷酰胺以及寡核苷酸，一种合成完全氘化的亚磷酰胺和寡核苷酸的方法，以及一种合成在各种位置含有0.1％-98％氘的氘化亚磷酰胺以及寡核苷酸的方法。
本发明的另一目标是传授一种制备在核苷的各种位置具有共价标记的氘的衍生化的核糖核苷和亚磷酰胺的方法，以及由其制备的产品。
本发明的另一目标是传授在核苷的各种位置具有共价标记的氘的核糖核苷和亚磷酰胺。
本发明的另一目标是传授制备具有天然磷酸二酯骨架的氘标记的寡核糖核苷酸的方法，以及由其制备的产品。
本发明的另一目标是传授具有天然磷酸二酯骨架的氘标记的寡核糖核苷酸。
本发明的另一目标是传授制备具有硫代磷酸酯骨架的氘标记的寡核糖核苷酸的方法，以及由其制备的产品。
本发明的另一目标是传授具有变异的骨架的氘标记的寡核糖核苷酸。
本发明的另一目标是传授具有硫代磷酸酯骨架的氘标记的寡核糖核苷酸。
本发明的另一目标是传授具有增高稳定性的氘化骨架的寡核苷酸。
本发明的另一目标是传授可用于治疗性治疗的氘化寡核苷酸。
本发明的另一目标是传授可用于治疗性治疗的氘化RNA反义寡核苷酸。
从以下说明结合其中通过说明和举例方式所列的任何附图、本发明的某些实施方案，本发明的其他目标和优势将变得显而易见。本文中所含的任何图式构成本说明书的一部分，并且包括本发明的示例性实施方案且说明其各种目标和特征。
附图简述
图1A为作为氘化腺嘌呤示出的修饰的核碱基的化学结构；
图1B为作为氘化鸟嘌呤示出的修饰的核碱基的化学结构；
图1C为作为氘化胞嘧啶示出的修饰的核碱基的化学结构；
图1D为作为氘化尿嘧啶示出的修饰的核碱基的化学结构；
图2示出流程1：合成1-O-乙酸-α/β2,3,5-O-三苯甲酰基-l-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷；
图3示出流程2：5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘3’-氰基乙基n,n-二异丙基亚磷酰胺-β-D呋喃核糖基-尿苷；
图4示出流程3：合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基Icaa-CPG-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基)尿苷；
图5示出流程4：合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷；
图6示出流程5：合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基Icaa-CPG-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷；
图7示出流程6：合成作为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘-β-D呋喃核糖基-N6苯甲酰基腺苷示出的、根据本发明的修饰的亚磷酰胺的替代实施方案；
图8示出结构C1，根据本发明的氘化寡核苷酸的特定实施方案的代表性图示；
图9A示出结构D1，具有磷酸二酯核苷酸间键的氘化寡核苷酸的替代实施方案；
图9B示出结构D2，作为硫代磷酸酯核苷酸间键示出的、具有变异的磷酸酯骨架氘化寡核苷酸的替代实施方案；
图10为使用具有Chrosep保护柱Omnisphere 5 C18的Shimazdu型HPLC管柱：Chromsep SS(4.6×250mm)，氘化核苷和亚磷酰胺的HPLC分析的总结图表；
图11A为1-O-乙酸-α/β2,3,5三苯甲酰基呋喃核糖苷的1H-NMR光谱；
图11B为1-O-乙酸-α/β2,3,5三苯甲酰基呋喃核糖苷的正离子质谱，批号#：SK38-38，计算质量：504.14，观察到的质量：522.40；
图12A为1-O-乙酸-α/β2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(结构VI)的1H-NMR光谱，其中H-4质子示出在大约50％强度，从而指示大约50％的氘并入在这一位置；
图12B为1-O-乙酸-α/β2,3,5-三苯甲酰基-l-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(VI)的正离子质谱，计算质量：509.17，观察到的质量：526.80(M+钠)；
图13A为2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构IX)的HPLC色谱图；
图13B为2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构IX)的HPLC报告；
图13C为2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构IX)的质谱，计算质量：249.10，观察到的质量：247.30；
图14A为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构X)的HPLC报告；
图14B为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构X)的1H-NMR光谱；
图14C为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构X)的1H-NMR光谱；
图14D为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(化合物结构XXIII)的1H-NMR光谱；
图15A为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构XI)的HPLC色谱图；
图15B为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构XI)的HPLC色谱图；
图15C为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构XI)的1H-NMR光谱；
图15D为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构XI)的质谱，计算质量：665.32，观察到的质量：664.00；
图16A为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构XIII)的HPLC色谱图；
图16B为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构XIII)的HPLC报告，纯度：96.72％；
图16C为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构XIII)的UV分析；
图16D为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构XIII)的UV分析报告；
图16E为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构XIII)的质谱，计算质量：865.43，观察到的质量：866.50(质量+钠离子(888.4)；
图16F为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构XIII)的31P NMR光谱，批号#：SK188-38，尖锐的双重峰在150.560&150.069ppm，纯度：100％，Δ＝0.491；
图17A为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XIV)的HPLC色谱图；
图17B为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XIV)的HPLC报告；
图17C为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XIV)的1H-NMR光谱；
图17D为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XIV)的质谱，计算质量：768.36，观察到的质量：769.30；
图17E为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构XIV)的1H-NMR光谱；
图17F为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构XIV)的正离子模式质谱，计算质量：764.83，观察到的质量：788.10(+钠离子)；
图18A为2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XVIII)的HPLC报告；
图18B为2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XVIII)的1H-NMR光谱；
图18C为2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XVIII)的质谱，计算质量：352.14，观察到的质量：352.50；
图18D为2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XVIII)的质谱，计算质量：352.14，观察到的质量：352.50；
图19A为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷(结构XIV)的正离子模式质谱，计算质量：764.83，观察到的质量：788.10(+钠离子)；
图19B为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(化合物XIX)的HPLC报告；
图19C为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(化合物XIX)的1H-NMR光谱；
图19D为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(化合物XIX)的1H-NMR光谱；
图20A为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XXII)的HPLC色谱图，纯度：78.88％；
图20B为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XXII)的HPLC报告，纯度：78.88％；
图20C为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XXII)的UV分析；
图20D为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XXII)的UV分析；
图20E为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XXII)的31P NMR光谱，尖锐的双重峰在150.576&149.852ppm，纯度：95％，Δ＝0.724；
图20F为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XXII)的31P NMR光谱，尖锐的双重峰在150.576&149.852ppm，纯度：95％；Δ＝0.724；
图21A为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(结构XXII)的31P NMR光谱，尖锐的双重峰在150.576&149.852ppm，纯度：95％；Δ＝0.724；
图21B为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-N4苯甲酰基胞苷(化合物结构XXIII)的质谱，计算质量：867.95，观察到的质量：869.20；
图22A为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’3’,4’,5’,5”-五氘β-D呋喃核糖基-N6苯甲酰基腺苷(结构XXVIII)的HPLC色谱图；
图22B为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’3’,4’,5’,5”-五氘β-D呋喃核糖基-N6苯甲酰基腺苷(结构XXVIII)的HPLC色谱图；
图22C为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’3’,4’,5’,5”-五氘β-D呋喃核糖基-N6苯甲酰基腺苷(结构XXVIII)的质谱，批号#：09015RDV，计算质量：678.28，观察到的质量：679.2；
图23A为SEQ ID No.1、完全氘化RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
图23B为SEQ ID No.1、完全氘化RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；
图23C为SEQ ID No.1、完全氘化RNA的纯化寡核苷酸的UV分析；
图24A为SEQ ID No.2、大约25％氘化RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
图24B为SEQ ID No.2、大约25％氘化RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；
图24C为SEQ ID No.2、大约25％氘化RNA的纯化寡核苷酸的UV分析；
图25A为SEQ ID No.3、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
图25B为SEQ ID No.3、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；
图25C为SEQ ID No.3、天然RNA的纯化寡核苷酸的UV分析；
图26A为SEQ ID No.4、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
图26B为SEQ ID No.4、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；
图26C为SEQ ID No.4、天然RNA的纯化寡核苷酸的UV分析；
图27A为SEQ ID No.5、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳分析；
图27B为SEQ ID No.5、天然RNA的纯化寡核苷酸的毛细电泳报告；以及
图27C为SEQ ID No.5、天然RNA的纯化寡核苷酸的UV分析。
发明详述
本发明描述高纯度氘化核糖以及糖、基于氘化核糖的核苷酸、氘化RNA寡核苷酸，以及用于合成供在治疗剂中使用的并入氘的寡核苷酸的受控方法。所述受控方法将需要开发在0.1％至98％范围内的各种所选择氘化度的方法，以及确定反应条件的分析方法。分析方法提供所含有的氘在每个位置0.1％至每个位置98％范围内的氘化寡核苷酸。在核苷内并入不同百分比的氘后，将进行进一步的化学合成以产生亚磷酰胺，所述化学合成将在每一步骤维持氘百分比，直到亚磷酰胺步骤。随后，将施用所述固定比率D/H寡核苷酸合成子来产生寡核苷酸。通过各种分析方法如质子NMR和质谱确定氘的并入百分比后，如果维持正确选择的反应条件，氘/氢比率将不受影响。本发明进一步描述氘标记的核苷-3’-丁二酸核苷的受控合成的所选择实施例，所述核苷在供用于固相寡核苷酸合成的糖和嘌呤/嘧啶碱基的特定位置具有部分或完全饱和的在0.1％-98％氘变化的氘标签。因此，类似于常规寡核苷酸合成，即从3’端至5’端方向进行本寡核苷酸合成方法。
因此，本发明的氘化核糖以及糖、基于氘化核糖的核苷酸、氘化RNA寡核苷酸可出于治疗益处而使用。寡核苷酸疗法，即使用寡核苷酸来调节特定基因的表达，提供选择性改变基因表达、而无较多常规治疗剂的不合意的非特异性毒性作用的机会。在说明性实例中，本发明的氘化核糖以及糖、基于氘化核糖的核苷酸、氘化RNA寡核苷酸可用在反义疗法中。因此，本发明可用来提供具有增高的保护的修饰的反义RNA，以提供更稳定、不易消化的反义RNA。因此，本发明的寡核苷酸可用于许多疾病的临床实践并且针对已知反义疗法适合或有待鉴别的任何靶RNA。本发明的氘化寡核苷酸可用于其他基于核酸的分子疗法，包括使用基于核酸的分子如RNA干扰在mRNA水平使基因表达沉默。
以下描述用于合成氘化核苷、糖和碱基保护、亚磷酰胺以及所涵盖的对应寡核苷酸的数个说明性步骤。合成糖氘保护的核苷包括选择性地氘化不可交换质子，如B-D-核糖的5’的H-1、H-2、H-3、H-4以及H-5。H-1’和H-4’质子在变成核苷的一部分时性质为略酸性的，并且具有在某种程度上与氢交换的趋势。因此，这两个质子不会产生大于90％的D/H比率。尽管质子H-2’、H-3’、H-5’、5”具有较高的pK并且因此可氘化至大于95％的D/H比率，但在反应中在质子性溶剂中或在与略碱性pH条件接触时不易交换回氢。
本发明公开一种具有结构A的结构的修饰的亚磷酰胺：
其中X或X1表示氘或氢，R1表示阻断基团，R2独立地表示阻断基团，R3为磷酸酯保护基团、优选地氰基乙基二烷基氨基，并且R4独立地为保护基团、优选地3’B-氰基乙基保护基团，并且B表示核碱基。尽管核糖的1’位也被氘化，然而氘的程度在此位置可变并且氘化后可交换氢。因此，1’位在图中示出为D/H。通过数据可见，此位置的氘并入为大约50:50氘:氢。因此，在进一步的讨论中，如果在制剂中氘并入降低至较低的氘，那么与核糖环的其他位置的氘化相比，1’位的氘富集将为剩余位置的几乎50％。4’位的氘也可变。
封闭或保护基团通常致使分子的化学官能团对于特定反应条件来说成惰性，并且稍后可从分子中的所述官能团去除，而不实质上损害分子的剩余部分。作为寡核苷酸方法的一部分，可封闭核碱基和2’糖基上的官能团。根据本发明的羟基保护基团包括多种多样的基团。优选地，保护基团在碱性条件下是稳定的，但可在酸性条件下去除。优选地，R1(5’羟基)为二甲氧基三苯甲基(DMT)。其他代表性羟基保护基团包括但不限于三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基呫吨-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)呫吨-9-基(Mox)。优选地R2(2’羟基)用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保护。对于其他基团，还可使用如叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基(TOM)。磷酸酯保护基团起作用来在例如固相寡核苷酸合成方案过程中保护一个或多个含有磷的核苷酸间键。用脱保护剂如氢氧化铵水溶液处理其上具有磷保护基团的一个或多个核苷酸间键将使得去除磷保护基团，并且在其位置处留下羟基或巯基。除了以上所列的那些，也可使用其他保护基团诸如但不限于二苯基甲硅烷基乙基、δ-氰基丁烯基、氰基对二甲苯基(CPX)、甲基-N-三氟乙酰基乙基(META)以及乙酰氧基苯氧基乙基(APOE)。
核碱基B可为生物碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。B还可为修饰的碱基，如氘化腺嘌呤，参见图1A；氘化鸟嘌呤，参见图1B；氘化胞嘧啶，参见图1C；氘化尿嘧啶，参见图1D；或所属领域的技术人员已知的其他修饰的碱基，包括生物碱基、合成碱基以及修饰碱基的类似物，如但不限于次黄嘌呤(hypoxanthine)(次黄嘌呤(inosine))、5-甲基胞嘧啶、5-氮杂胞嘧啶、5-卤化尿嘧啶和胞嘧啶以及5-烷基取代的核碱基类，如C-5丙炔尿嘧啶以及C-5丙炔胞嘧啶，这些类似物也已氘化。B还可含有阻断基团，如苯甲酰基保护基团或异丁酰基保护基团、乙酰基保护基团、苯氧基乙酰基保护基团、4-异丙基苯氧基乙酰基保护基团或二甲基甲脒基、二甲基乙脒保护基团。
图2描绘在合成氘化RNA-核苷、n-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的过程中起始材料的说明性实例的合成。根据流程，以α/β-D呋喃核糖苷(-D-核糖，结构I)起始进行1-O-乙酸-α/β2,3,5-O-三苯甲酰基-l-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(结构VI)的合成。通过A.Foldesi,F.R.Nilson,C.Glemarec,C.Gioeli&J.Chattopadhyaya,Tetrahedron,9033,1992所述程序的稍微修改引入氘。合成氘化阮内镍的程序也是从此处引用的文献的同一作者采纳而来，稍微加以修改以改进氘并入的效率。步骤包括由D-核糖(I)合成1-O-甲基-α/β-D呋喃核糖苷(II)。使用氘化阮内镍由化合物II合成1-O-甲基α/β2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(III)。通过在温和条件下进行苯甲酰基化由具有结构III的化合物合成1-O-甲基-α/β2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(IV)。通过首先选择性去除1-O-甲基以产生1-羟基糖、随后用溴置换，而不分离中间体1-羟基糖，由化合物IV合成1-溴-α/βD 2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(V)。化合物V不进行纯化直接用于合成1-O-乙酸-α/β2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(VI)。使化合物VI结晶并且通过1H NMR充分表征，参见图12A。由此分析确认在每个糖位置所并入的氘百分比，并且通过质谱分析进一步表征糖，参见图12B。
合成1-O-乙酸-α/β2,3,5-O-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，流程1：
制备氘阮内镍催化剂：将192mL去离子水置于装备温度计和泰氟隆(Teflon)涂覆的磁性搅拌器的500ml鄂伦麦尔烧瓶(Erlenmeyer flask)中。将鄂伦麦尔烧瓶置于塑料烧杯中，所述塑料烧杯半填充有水，并且位于加热板/磁性搅拌器上。缓慢添加氢氧化钠团粒(51.2g)至烧瓶内的水中，同时轻轻搅拌。轻轻搅拌使水温维持在约50℃。搅拌混合物直至所有氢氧化钠(NaOH)团粒均已溶解。添加另外的化学品之前，烧瓶内的温度维持在大约50℃。随后，在30分钟的时间帧内按多个小份逐渐添加40g阮内镍合金(Sigma Aldrich)。外部、即烧杯内的水温维持在大约50℃+/-4℃。添加阮内镍合金后，将组合物搅拌大约60分钟，同时维持内部温度。随后，将反应烧瓶缓慢冷却至室温，耗费大约1小时。将1升去离子水一次性添加至烧瓶，并且小心倾析出。再重复此过程两次，总计3次。在每次添加水和倾析过程中，所有固体材料均留在烧瓶中。完成3次加水和倾析步骤后，将固体转移至500ml过滤烧瓶。将管连接至过滤烧瓶以去除在将去离子水添加至过滤烧瓶顶部时所产生的任何溢出的水。持续洗涤并且搅拌过滤烧瓶的内容物，直至所有浑浊消失。浑浊消失后，使用大约20升去离子水继续用去离子水进行另外的洗涤。在水具有pH 6.5-7.0时终止洗涤，并且上清液澄清。
随后制备氘化阮内镍催化剂。将洗涤后的催化剂颗粒转移至隔片加盖的瓶中。将泰氟隆涂覆的磁性搅拌器置于瓶中并且将橡胶塞置于隔片瓶的顶部。用氩吹扫瓶。将悬浮液搅拌1分钟，之后使颗粒沉降。使用巴斯德(Pasteur)吸管小心去除水。这一过程进行4次，每次要求添加、通过添加1.5ml去离子水、搅拌并且小心去除水。随后，添加氧化氘(D2O，1.5ml；Cambridge Isotope Labs.,Massachusetts，纯度大于98％)。将混合物搅拌30分钟。固体沉降至底部后，通过吸管小心去除液体。将所述过程再重复两次，添加另外的氧化氘(D2O，1.5ml)并且搅拌30分钟。每次打开隔片加盖的瓶，并且添加试剂，用氩吹扫瓶，并且用隔片快速密封。三次后，添加3ml D2O。然后，将混合物搅拌1小时，接着去除上清液。将此过程再重复12次，每次用氩吹扫瓶。用D2O(10ml)处理混合物并且在用氩吹扫后保持密封过夜。小心去除上清液，接着以相同方式添加新鲜D2O(10ml)。倾析出上清液。
合成1-O-甲基α/β2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(结构III)：向8克1-O-甲基-α/β-D呋喃核糖苷添加10ml D2O(10ml)。在旋转蒸发器上蒸发溶液。将此过程再重复两次，每次使用10ml D2O。将残余物溶解在160ml D2O水中。将氘化阮内镍(40ml)转移到溶液中。将氩鼓入反应混合物中，持续10分钟。然后，将反应混合物在氩氛围下维持在110℃油浴中，持续7天。将反应混合物冷却至室温，并且通过硅藻土床层过滤并且用小体积的去离子水洗涤。在旋转蒸发器上蒸发滤液。将残余物与吡啶共蒸发三次，并且使用直接的真空线干燥另外6小时。所述过程得到6.8g油状产物。
合成1-O-甲基-α/β2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(结构IV)：将干燥的1-O-甲基-α/β2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(III，6.8g)置于圆底三颈烧瓶中，并且配备压力平衡漏斗和磁性搅拌器。添加无水蒸馏二氯甲烷(34.1ml)。搅拌反应混合物。接着添加无水吡啶(68.2ml)。在零摄氏度下搅拌溶液。随后，通过压力平衡漏斗将苯甲酰氯(21.2ml)逐滴添加至密封的反应烧瓶中。添加苯甲酰氯后，去除压力平衡漏斗并且用塞替换。将混合物在冰箱中在0-4℃下在密封的聚乙烯袋中保持48小时。将反应倾倒在冰水混合物上，并且将反应混合物保持1小时。用氯仿萃取胶质材料，用冷(0-5℃)饱和碳酸氢钠溶液洗涤，之后用盐水溶液洗涤。使有机层通过无水硫酸钠，并且在旋转蒸发器上蒸发溶液。随后，将残余物与吡啶共蒸发，之后添加无水甲苯。在直接真空线上着手1次进一步干燥，进行6小时。获得油状产物，并且使用其合成1-溴-α/βD-2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷。
合成1-溴-α/βD 2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(结构V)：将不含甲苯的1-O-甲基-α/β2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(IV)溶解于溶于在冰乙酸中制备的33％溴化氢(HBr)溶液并且紧密密封。在室温下搅拌溶液。30分钟后，将反应混合物冷却至8-10℃。随后，将冰乙酸(200ml)添加至反应混合物。然后，按逐滴方式添加去离子水(130ml)。将反应混合物搅拌23分钟。将反应混合物倾倒在5-10℃冷却的去离子水上。用氯仿提取胶质物质。将冷(0-5℃)碳酸氢钠水溶液添加至有机层，直至有机层的pH为碱性(pH>8)。分离有机层并且用冷碳酸氢钠水溶液再一次洗涤，之后使有机层通过无水硫酸钠。在旋转蒸发仪上蒸发过滤的溶液。将胶质固体与无水吡啶共蒸发两次。获得油状产物并且将其用于下一步骤。
合成1-O-乙酸-α/β2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(结构VI)：将上一步骤中获得的干燥产物1-溴-α/β2,3,5-三苯甲酰基-2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷(结构V)溶于无水吡啶(40ml)中并且在氯仿(40ml)中无水蒸馏。向反应混合物添加乙酸酐(13.9ml)。轻轻混合溶液、密封并储存在室温下72小时。然后，用氯仿稀释溶液。将全部的有机层置于分液漏斗中并且用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次，之后用饱和盐水溶液洗涤。使有机层通过无水硫酸钠，之后在旋转蒸发仪上干燥。将残余物与甲苯共蒸发三次。使用直接真空线将胶质物质干燥2小时。将无水乙醇添加至胶质物质。将溶液保持在4℃下2小时。过滤所获得的固体并且用冷乙醇洗涤。将固体转移至圆底烧瓶中，并且在高真空直接线上在37℃下干燥12小时。所述过程得到4.5克灰白色产物的产量。通过1H NMR和质谱分析分析产物。
参见图3、5以及7，示出了修饰的亚磷酰胺的合成并且所述合成是分别根据流程4、6以及8进行，并且以下概括了单个步骤。图3、5以及7示出具有核碱基尿嘧啶、胞嘧啶以及腺嘌呤的亚磷酰胺的说明性实例。可使用相同或类似的步骤合成具有其他核碱基如鸟嘌呤或修饰的核碱基的亚磷酰胺。因此，以下实施例仅为说明性的并且不意在为限制性的。
合成2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖尿苷(结构IX)：使尿嘧啶(化合物VII；0.5g；4.46mmol)、六甲基二硅胺(15ml)以及硫酸铵(20mg，0.15mmol)的混合物在回流下沸腾，直至尿嘧啶溶解，大约15小时。随后，在真空下蒸发六甲基二硅胺，并且添加甲苯。振荡混合物，并且蒸发出溶剂以获得由三甲基甲硅烷基化尿嘧啶组成的残余固体。固体残余物在不纯化情况下用于偶联。将新鲜蒸馏的1,2二氯乙烷(经CaH2新鲜蒸馏)(16ml)添加至残余物。在40℃下搅拌混合物，接着在40℃温度下添加氯化锡(1.13ml，1.46mmol)。反应在40℃下持续15分钟。将氘化1-乙酸α/β-D呋喃核糖苷(结构VI；1.81g；3.56mmol)的1,2二氯乙烷(经CaH2新鲜蒸馏)溶液置于压力平衡漏斗中，并且安装在以上反应烧瓶的顶部。逐滴添加溶液，并且使反应在回流下沸腾2.5h。冷却反应混合物并且在饱和碳酸氢钠溶液中搅拌1.5h。经由硅藻土粉末床层过滤反应混合物。分离有机层并且使其通过无水硫酸钠。在真空下蒸发反应混合物，并且在氯仿:甲醇(8:2)中通过TLC进行检查。在二氧化硅(70:230目)(100g)柱(1.5”×14cm)上用EtOAc:己烷(6:4)作为洗脱剂对所获得的胶质物质进行色谱分离。通过TLC监控洗脱份。在氯仿:甲醇(8:2)中Rf值为0.46。通过UV可视化监控纯洗脱份，将其合并，在旋转蒸发仪上浓缩，并且获得呈泡沫形式的具有结构VIII的化合物(产量1.7g)。
将结构VIII(1.7g)在吡啶(20ml)和氨水溶液(37w/v％，20ml)中的混合物在37℃下在紧密密封的烧瓶中保持48小时。然后，在真空中蒸发混合物，并且与异丙醇一起共蒸发至干燥。将残余物的二氯甲烷溶液施加至装填有在氯仿中的硅胶(70:230)(100g)的管柱(2×15cm)，接着施加氯仿:甲醇85:15(V:V)。通过UV使纯洗脱份可视化，并且蒸发以得到结构IX的2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷的化合物粉末(产量：700mg；93.3％)，参见图13A-13C。在系统氯仿:甲醇(85:15)中Rf为0.4。UV最大为260(0.494)，Emax：7826.22。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构X)：用无水吡啶将2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构IX；0.7g；0.175mmol)干燥两次，接着添加无水吡啶(10ml)。搅拌溶液并且用所附接的干燥管冷却至0℃。向溶液以1小时间隔按两份添加4,4,二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl；1.16g；3.42mmol)。通过TLC在氯仿(85:15)中监控反应进程。反应完成(大约4小时)后，用冷甲醇(5ml)淬灭反应混合物，接着在旋转蒸发仪上去除溶剂。将残余的胶状物溶解在氯仿中，并且用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，接着用盐水溶液洗涤一次。在硅胶(70:230目大小)(150g)柱上用氯仿:甲醇(95:5)作为洗脱剂色谱分离去除溶剂后获得的粗产物。通过TLC监控洗脱份并且通过UV可视化。在氯仿:甲醇(95:05)中的Rf为0.4。合并纯洗脱份并且蒸发以得到几乎无色的泡沫状物，产量：1.3g，86.6％；UVmax为250nm；Emax为11,671。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参见图14A-14D。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷XI以及5’-O-二甲氧基三苯甲基-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷XII：通过与无水乙腈一起并且在真空下持续数小时共蒸发来干燥化合物5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构IX；1.3g；2.36mmol)。将所干燥的产物添加至无水四氢呋喃(THF，13ml)。通过反应烧瓶顶部上的干燥管在无水条件下向所述溶液添加硝酸银(AgNO3，0.5g，2.94mmol)。向混合物添加无水吡啶(0.69ml，8.54mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，在无水条件下添加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMS-氯，0.53g，3.52mmol)。密封反应混合物并且在室温下搅拌2.5小时。通过TLC监控反应进程，并且在UV下可视化。TLC溶剂系统为氯仿:己烷:丙酮(65:25:10)。粗产物示出2’异构体(结构XI)与3’异构体形成。在TLC上进行未修饰的2’和3’异构体的比较性分析，并且斑点共迁移。
常用处理后，在硅胶(230:400目)柱上用由氯仿:己烷:丙酮65:25:10组成的溶剂系统对粗产物进行色谱分离。通过TLC监控洗脱份，并且通过UV可视化。在相同溶剂系统中Rf值为0.38。蒸发合并的纯洗脱份，以得到产量为800mg的、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基-尿苷的泡沫状物，50.9％。UVλmax为250nm(0.350)；Emax为1634。未分离3’异构体1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2,3,4,5,5’五氘β-D呋喃核糖基)尿嘧啶XII。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参见图15A-15D。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(化合物结构XIII)：用无水乙腈彻底干燥来自5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构XI)以及5’-O-二甲氧基三苯甲基-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(结构XII)的合成的2’-TBDM甲硅烷基异构体(结构XI，430mg)，并且置于圆底烧瓶中。添加无水四氢呋喃(4.3ml)，并且用氩吹扫溶液，并且重新盖上塞。在搅拌下，向溶液添加2,4,6-三甲基吡啶(430微升；5当量)，之后添加1-甲基咪唑(51微升；1.0当量)。在室温下搅拌溶液并且快速添加N,N-二异丙基氨基氰基乙基膦酰胺酸氯(磷酰基化试剂，ChemGenes目录号RN-1505；290微升；2当量)。70分钟后，反应完全，并且通过用氯仿稀释进行处理。将有机层置于分液漏斗中，并且用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，接着用盐水溶液进一步洗涤有机层。使有机层通过无水硫酸钠。在旋转蒸发仪上浓缩溶液。在乙酸乙酯:己烷:三乙胺(30:60:10)系统中检查TLC。在硅胶(230-400目)柱上纯化粗产物，柱直径(30cm×1.5cm)。在硅胶柱上纯化粗产物。通过TLC监控纯洗脱份，将其合并并且然后浓缩。获得干重为300mg的无色泡沫状产物。通过HPLC、UV、1H NMR、质谱数据以及31P NMR分析产物，参见图16A-16F。
需要附接有氘标记的核苷的固体载体来合成寡核苷酸。寡核苷酸合成后结合有氘标记的核苷的固体载体使得氘标记的核苷处于寡核苷酸的3’端。在此过程中，由3’端至5’端方向(常规寡核苷酸合成)进行寡核苷酸合成。本发明公开用于合成氘标记的核苷-3’-丁二酸核苷的方法，所述核苷在糖和嘌呤/嘧啶碱基的特定位置处具有可在0.1％-98％氘变化的受控的氘标签。本发明公开并入含氘的亚磷酰胺和固体载体的方法，所述含氘的亚磷酰胺和固体载体具有不同百分比的富集的氘，其中氘与氢比率在20:98范围内。
结构B示出具有以下化学结构的氘化固体载体结构：
其中X表示氘或氢，R1表示阻断基团，R2独立地表示阻断基团，R3表示连接分子，并且R4表示固体载体，并且B表示核碱基。如先前所述，B可为生物碱基、修饰的碱基或其组合。连接分子在本领域中通常已知是起作用来连接固体载体与官能团的小分子。优选的连接分子为丁二酰基-Icaa，但可使用所属领域的技术人员已知的其他连接分子。固体载体通常用于附接至第一核苷。在优选实施方案中，固体载体为受控的多孔玻璃(CPG)。然而，还可使用其他载体如但不限于草酰基-受控的多孔玻璃、大孔聚苯乙烯(MPPS)、氨基聚乙二醇。
图4示出流程3：合成偶联至固体载体结构的氘化核糖核苷，在本文中示出为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基Icaa-CPG-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(化合物结构XIV)：将化合物5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(XI；350mg)置于3.5ml无水吡啶中并且搅拌。向搅拌的溶液添加丁二酸酐(158mg；1,58mmol)，之后添加4-二甲基氨基吡啶(20mg；0.163mmol)。密封反应混合物并保持在水浴中并维持在37℃下14小时。通过TLC检查反应混合物并且发现完全。随后，用冷甲醇(200微升)淬灭反应混合物，之后在旋转蒸发仪上去除溶剂。将粗反应混合物置于氯仿中，并且用饱和盐水溶液洗涤有机层。通过无水硫酸钠过滤有机层，并且在真空下去除氯仿溶液。通过短柱色谱法使用氯仿:甲醇(95:5)溶剂系统纯化粗化合物。合并且蒸发纯的洗脱份。在真空下干燥泡沫状产物6小时。在此系统中产物的Rf值为0.3。所述过程得到120mg。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参见图17E和17F。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基Icaa-CPG-2,’3,’4,’5,’5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(化合物结构XV)：将上一步骤的核苷、3’-丁二酸-吡啶鎓盐、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基尿苷(化合物结构XIV；85mg)置于圆底烧瓶中并且用无水乙腈彻底干燥，之后在高真空下使用直接线干燥6小时。向固体添加无水乙腈(6ml)，之后添加O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸盐HBTU(47mg；1.1当量)。然后添加二异丙基乙基胺(39微升；2当量)。向溶液添加氨基连接体Icaa CPG(长链烷基胺受控多孔玻璃；500A粒径；Pennsylvania的Prime Synthesis公司的产品；1.5g)。彻底密封混合物并且在37℃下保持12小时。过滤CPG，用乙腈洗涤，之后用乙醚洗涤。将CPG空气干燥过夜。
封闭残余氨基。将干燥的CPG置于鄂伦麦尔烧瓶中，并且添加CAP A溶液(ChemGenes产品，目录号：RN-1458，由乙酸酐:吡啶:四氢呋喃(10:10:80)组成，10ml)。将悬浮液保持在室温下并且密封，持续2小时。过滤CPG，用异丙醇洗涤，之后用乙醚洗涤。通过茚三酮测试检查完全封闭残余氨基官能团的完成。阴性茚三酮测试指示残余氨基官能团完全封端。对所加载CPG进行三苯甲基测定。三苯甲基值为44μmol/g。
参考图5，流程4示出合成根据本发明并且具有包括结构XXII的核碱基胞嘧啶的亚磷酰胺的替代实施方案的实施例。以下概括合成中所包括的单个步骤的细节。
合成2’,3’,5’-三O-苯甲酰基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(结构XVII)：使N4bz-胞嘧啶(化合物结构XVI；750mg；3.47mmol)、六甲基二硅胺(HMDS；19ml)以及硫酸铵(32mg；0.24mmol)的混合物在回流下沸腾，直至N4bz-胞嘧啶溶解，大约15小时。然后在真空下蒸发六甲基二硅胺并且添加甲苯。振荡混合物并且蒸发出溶剂以获得由三甲基甲硅烷基化的N4bz-胞嘧啶组成的残余固体。固体残余物在不纯化情况下用于偶联。将16ml新鲜蒸馏的1,2二氯乙烷(经CaH2新鲜蒸馏)添加至残余物。在40℃下搅拌混合物。然后在40℃温度下添加氯化锡(0.86ml；3.29mmole)。继续在40℃温度下反应15分钟。将氘化β-D核糖-1-乙酸(结构VI；1.42g；2.79mmol)的1,2二氯乙烷(4.3ml；经CaH2新鲜蒸馏)溶液置于压力平衡的漏斗中，并且安装在反应烧杯顶部。逐滴添加溶液，并且使反应在回流下沸腾2.5小时。冷却反应混合物并且在饱和碳酸氢钠水溶液中搅拌1.5小时。通过硅藻土粉末床层过滤反应。分离有机层并且使其通过无水硫酸钠。在真空下蒸发反应混合物，并且使用TLC在氯仿:甲醇(98:02)中进行检查。Rf值为0.46。反应得到2.14g。
合成2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(具有结构XVIII的化合物)：搅拌2’,3’,5’-三O-苯甲酰基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(结构XVII)(2.14g；3.22mmol)在吡啶(20.5ml)中的混合物直至溶解。然后添加甲醇(5ml)。将溶液冷却至0℃并且添加2N氢氧化钠水溶液(6.26ml)用于选择性水解O-苯甲酰基。水解反应在0℃下进行20分钟，同时继续搅拌。用2N HCl水溶液(7ml)将反应混合物小心中和至pH 7.5。添加吡啶(10ml)后蒸发溶液。将残余物与异丙醇共蒸发至干燥。用蒸馏水湿磨残余物，以得到无色固体。过滤固体、用乙醚洗涤，并且在高真空下干燥。获得呈粉末形式的具有结构XII的化合物(产量：1.0g；88.49％)。在氯仿:甲醇(85:15)中Rf值为0.5；UVmax为260(0.903)并且Emax为16,000。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据、和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参见图18A-18D。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(具有结构XIX的化合物)：用无水吡啶将化合物2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(结构XVIII；1.0g；2.88mmol)干燥两次，接着添加无水吡啶(10ml)。搅拌溶液并且用所附接的干燥管冷却至0℃。向溶液以1小时间隔按两份添加4,4,二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl；1.15g；3.39mmol)。通过TLC在氯仿:85:15中监控反应进程。反应完成(大约4小时)后，用冷甲醇(5ml)淬灭反应混合物，接着在旋转蒸发仪上去除溶剂。将残余的胶状物置于氯仿中，并且用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，接着用盐水溶液洗涤。在硅胶(70:230目大小)(150g)柱上用氯仿:甲醇:丙酮(50:30:20)色谱分离去除溶剂后获得的粗产物。通过TLC监控洗脱份并且通过UV可视化。在氯仿:甲醇94:06中Rf为0.4。合并纯洗脱份并且蒸发以得到几乎无色的泡沫状物(产量：1.5g；81.08％)，UVλmax为260nm；Emax：16609.66(260nm)。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参见图19A-19D。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷和5’-O-二甲氧基三苯甲基-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(具有结构XX和XXI的化合物)：通过与无水乙腈一起并且在真空下持续数小时共蒸发来干燥化合物5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(化合物XIII；1.5g；1.95mmol)。将所干燥的产物添加至无水四氢呋喃(THF；15ml)。通过反应烧瓶顶部上的干燥管在无水条件下向所述溶液添加硝酸银(AgNO3；0.49g；2.94mmol)。向混合物添加无水吡啶(0.60ml；7.26mmol)并且在室温下搅拌10分钟。随后，在无水条件下添加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMS-氯；0.52g；3.52mmol)，密封反应混合物。将混合物在室温下搅拌2.5小时。通过TLC监控反应进程，并且在UV下可视化。使用溶剂系统首先使用氯仿:己烷:丙酮(65:25:10)(Rf值为0.38)并且然后使用乙酸乙酯:己烷(50:50)进行TLC检查。粗产物示出2’异构体(结构XX)与3’异构体(结构XXI)形成。在TLC上进行未修饰的2’和3’异构体的比较性分析，并且斑点共迁移。
在硅胶(230:400目)柱上用由氯仿:己烷:丙酮(65:25:10)组成的溶剂系统对粗产物进行色谱分离。通过TLC监控洗脱份，并且通过UV可视化。在相同溶剂系统中Rf为0.38。蒸发合并的纯洗脱份，以得到产量为800mg的、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷的泡沫状物，50.9％。UVλmax为250nm(0.350)；Emax为1634。未分离3’-异构体5’-O-二甲氧基三苯甲基-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基)N4苯甲酰基胞苷(结构XXI)。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基)N4苯甲酰基胞苷(具有结构XXII的化合物)：用无水乙腈彻底干燥来自上一步骤的2’-TBDM甲硅烷基异构体(化合物XX；430mg)，并且置于圆底烧瓶中。添加无水四氢呋喃(2.0ml)，并且用氩吹扫溶液，并且重新盖上塞。在搅拌下，向溶液添加2,4,6-三甲基吡啶(176微升；5当量)，之后添加1-甲基咪唑(21微升；1.0当量)。在室温下向搅拌溶液添加N,N-二异丙基氨基氰基乙基膦酰胺酸氯(磷酰基化试剂，ChemGenes目录号：RN-1505；119微升；2当量)。75分钟后，发现反应完全，并且通过用氯仿稀释进行处理。将有机层置于分液漏斗中，并且用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，接着用盐水溶液进一步洗涤有机层。使有机层通过无水硫酸钠。在旋转蒸发仪上浓缩溶液，并且使用TLC用乙酸乙酯:己烷:三乙胺50:40:10以及乙酸乙酯:己烷:三乙胺(30:60:10)和(50:40:10)溶剂系统进行检查。
在硅胶(230-400目)柱上纯化粗产物，柱直径为30cm×1.5cm。柱首先在使用乙酸乙酯:己烷:三乙胺(30:60:10)的系统中操作，并且在去除上部杂质后，将系统变换成乙酸乙酯:己烷:三乙胺(50:40:10)。通过TLC监控纯洗脱份，将其合并并且浓缩。获得干重为125mg的无色泡沫状产物。通过HPLC、UV、1H NMR、质谱数据以及31P NMR分析产物，参见图20A-20F。
参考图6，流程5示出合成氘化固体载体结构的替代实施方案的实施例，所述氘化固体载体结构示出为5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基Icaa-CPG--2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(具有结构XXIII的化合物)：将化合物5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(结构XXIII)(300mg)置于3.0ml无水吡啶中。向搅拌的溶液添加丁二酸酐(120mg；1.99mmol)，之后添加4-二甲基氨基吡啶(14mg；0.115mmol)。密封反应混合物并保持在水浴中、维持在37℃下14小时。通过TLC检查反应混合物并且确定完全。随后，用冷甲醇(180微升)淬灭反应混合物，之后在旋转蒸发仪上去除溶剂。将粗反应混合物置于氯仿中，并且用饱和盐水溶液洗涤有机层。通过无水硫酸钠过滤有机层，并且在真空下浓缩氯仿溶液。通过短柱色谱法使用氯仿:甲醇(95:5)溶剂系统纯化粗化合物。合并且蒸发纯的洗脱份。在高真空下干燥泡沫状产物6小时。在此系统中产物的Rf值为0.35。所述过程得到80mg。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参见图21A-21B。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基Lcaa-CPG-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(化合物having结构XXIV)：将上一步骤的核苷、3’-丁二酸-吡啶鎓盐、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基吡啶鎓盐-2’,3’,4’,5’,5”五氘β-D呋喃核糖基N4苯甲酰基胞苷(化合物结构XXIII；40mg)置于圆底烧瓶中并且用无水乙腈彻底干燥，之后在高真空下使用直接线干燥6小时。向干燥材料添加无水乙腈(6ml)，之后添加HBTU(19.2mg；1.1当量)，接着添加二异丙基乙基胺(16微升；2当量)。向溶液添加氨基连接体Lcaa CPG(长链烷基胺受控多孔玻璃；500A粒径；Pennsylvania的PrimeSynthesis公司的产品；680mg)。彻底密封混合物并且在37℃下保持12小时。过滤CPG，用乙腈洗涤，之后用乙醚洗涤。将CPG空气干燥过夜。
封闭残余氨基。将干燥的CPG置于鄂伦麦尔烧瓶中，并且添加CAP A溶液(ChemGenes产品，目录号：RN-1458，由乙酸酐:吡啶:四氢呋喃(10:10:80)组成，10ml)。将悬浮液密封并且保持在室温下，持续2小时。随后，过滤CPG，用异丙醇洗涤，之后用乙醚洗涤。通过茚三酮测试检查完全封闭残余氨基官能团的完成。阴性茚三酮测试指示残余氨基官能团完全封端。三苯甲基值指示33μmol/g的加载量。
参考图7，流程6示出合成根据本发明具有核碱基腺嘌呤、结构XXVIII的亚磷酰胺的替代性实施方案的实施例。以下概括合成中所包括的单个步骤的细节。
合成2’,3’,5’三-O-苯甲酰基-2’,3’,4’,5’,5”-五氘β-D呋喃核糖基N6苯甲酰基腺苷(具有结构XXVI的化合物)：将N6bz-腺嘌呤(XXV；760mg；3.18mmol)置于蒸馏的1,2-二氯乙烷中并且干燥。添加双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA；3.116ml；15.29mmol)并且在回流下沸腾直至N6bz-腺嘌呤溶解(15h)。随后，在真空下蒸发BSA，并且添加甲苯。振荡混合物并且蒸发溶剂以获得由甲硅烷基化的N6bz-腺嘌呤组成的残余固体。固体在不纯化情况下用于偶联。将新鲜蒸馏的1,2二氯乙烷(50ml；经CaH2新鲜蒸馏)(16ml)添加至残余物。在40℃下搅拌混合物，接着在此温度下添加氯化锡(0.55ml；0.73mmol)。反应在40℃下持续15分钟。将氘化β-D核糖-1-乙酸(结构VI；1.29g；2.53mmol)的1,2二氯乙烷(4.3ml；经CaH2新鲜蒸馏)溶液置于压力平衡漏斗中，并且安装在以上反应烧瓶的顶部。逐滴添加溶液，并且使反应在回流下沸腾2.5h。
冷却反应混合物。在饱和碳酸氢钠溶液中搅拌1.5h。经由硅藻土粉末床层过滤反应。分离有机层并且使其通过无水硫酸钠。在真空下蒸发反应混合物并且使用TLC使用氯仿:乙酸乙酯:三乙胺(47:47:8)进行检查。Rf值测定为0.53。
通过柱色谱法(硅胶；230-400目)，使用氯仿:乙酸乙酯:三乙胺(47:47:6)的溶剂系统纯化粗产物。通过TLC监控纯洗脱份、合并并且在旋转蒸发仪上浓缩。获得纯的泡沫状产物，其产量为400mg。
合成2’,3’,5’三羟基-2’,3’,4’,5’,5”-五氘β–D呋喃核糖基N6苯甲酰基腺苷(具有结构XXVII的化合物)：将前述三苯甲酰基化合物、2’,3’,5’三-O-苯甲酰基-2’,3’,4’,5’,5”-五氘β-D呋喃核糖基N6苯甲酰基腺苷(XXVI；400mg)置于吡啶(4.8ml)和甲醇(1.2ml)中。搅拌混合物以使化合物溶解。然后，用外部的冰桶将溶液冷却至0℃。向溶液添加2N NaOH(1.16ml)，并且使碱性反应混合物水解以去除O-苯甲酰基，持续20分钟的一段时间。然后，向反应混合物添加2N HCl(冷却至0℃)。小心进行添加以便将碱性溶液中和至pH 7.5(使用1.0ml 2N HCl)。向反应混合物添加吡啶(5ml)并且浓缩溶液。与吡啶(2×5ml)一起共蒸发，接着是浓缩步骤。通过添加水结晶来纯化残余物。过滤所获得的固体并且用乙醚洗涤。使用TLC使用氯仿:甲醇(85:15)溶剂系统检查溶液。真空干燥的产物的Rf值为0.4并且产量为200mg。
合成5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’,3’,4’,5’,5”-五氘β-D呋喃核糖基N6苯甲酰基腺苷(具有结构XXVIII的化合物)：用无水吡啶将化合物2’,3’,5’-三羟基-2’,3’,4’,5’,5”-五氘β-D呋喃核糖基N6苯甲酰基腺苷(XXVII；200mg)干燥两次，接着在无水条件下添加无水吡啶(2M)。搅拌溶液并且用所附接的干燥管冷却至0℃。向溶液添加一份4,4,二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl；0.21g；0.619mmol)。通过TLC在氯仿(95:05)中监控反应进程。反应完成(大约4小时)后，用冷却的甲醇(2ml)淬灭反应混合物。然后，在旋转蒸发仪上去除溶剂。将残余胶状物置于氯仿中，并且用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，接着用盐水溶液进行单次洗涤。在硅胶(70:230目大小)(150g)柱上用氯仿:甲醇(95:5)作为洗脱剂对去除溶剂后获得的粗产物进行色谱分离。通过TLC监控洗脱份并且通过UV可视化。在氯仿:甲醇(95:05)中，Rf值为0.38。合并纯洗脱份并且蒸发以得到几乎无色泡沫状物。所述过程得到80mg；UVmax为250nm；Emax为11,671。通过以下HPLC、UV、1H NMR、质谱数据和/或31P NMR中的一种或多种分析产物，参见图22A-22C。
寡核苷酸合成：使用流程1-6来合成必需的化学结构，本发明描述了用于产生氘化核糖核苷酸的寡核苷酸合成方法。参考图8A，示出了具有结构C1的氘化核糖寡核苷酸的说明性实施例，其中n表示寡核苷酸的核苷单元(核糖+核碱基)的数量，从而限定寡核苷酸序列；B表示天然或修饰的核碱基，并且X为氘，其中W可为氧(O-)或硫(S-)；Y可为氧(O-)、C1-C18烷氧基、C1-18烷基，NHR3，其中R3为C1-C18烷基或C1-C4烷氧基-C1-C6-烷基，NR3R4，其中R3如以上所定义并且R4为C1-C18烷基，或其中R3如以上所定义并且R4为C1-C18-烷基，或其中R3和R4与携带它们的氮原子一起形成5-6元杂环，所述杂环可以另外含有另一来自系列O、S以及N的杂原子。或者，寡核苷酸键可含有可被由式II表示的X-C-(Y1Y2Y3Y4)-取代的Y基团：
其中W可为氧(O-)或硫(S-)；Y可以单个或多个为氢、甲基、乙基；X可为吸电子基，如但不限于卤素如氟、氯或溴，CN、NO2、SO2、芳族基团如但不限于苯硫基、苯基硫氧基、苯基磺酰基。苯基环基团可被卤素、CN、NO2取代。式II中的[X-C-(Y1,Y2)]还可能被CF、CCl或CBr3置换。
寡核苷酸中核苷单元的数量可为例如2-200，优选地小于100并且最优选地介于2与50之间。寡核苷酸单元可具有的通过用冷材料稀释实现的氘水平在1％至98％范围内。例如，具有100％氘化度的寡核苷酸可用冷RNA连续稀释以用于介于0.1％与98％之间的最终浓度。如图9A所示出，寡核苷酸优选地含有磷酸二酯核苷酸间键。图9B示出图8中所示出的氘化寡核苷酸的替代实施方案，其具有示出为但不限于硫代磷酸酯核苷酸间键的变异的磷酸酯骨架。硫代磷酸酯修饰已示出可用于递送生物活性寡核苷酸，参见Protocols forOligonucleotides and Analogs，Sudhir Agarwal编，Humana Press，Totawa，NJ，1993。此外，使用变异的骨架如硫代磷酸酯可用于抵抗细胞酶降解，从而提供更稳定的修饰的寡核苷酸。
磷酰基化试剂N,N-二异丙基氨基氰基乙基磷酰胺酸氯或2-氰基乙基，N,N,N,N-四异丙基磷烷是可易于商购获得的，并且通过ChemGenes公司(Wilmington，MA)生产。高纯度二甲氧基三苯基氯(DMT-氯)获自EssceeBiotech India Pvt.Ltd。高纯度吡啶获自Caledon Laboratories。
使用3’→5’导向的氘化核苷-2’-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-氰基乙基亚磷酰胺以及1μmol规模标准或天然RNA亚磷酰胺化学法合成表1中所列的寡核苷酸。使用标准RNA 1μmol循环，在Expedite 8900合成仪上进行合成。
表1.通过常规合成方法合成氘化/天然寡核苷酸序列
SEQ ID NO 序列(5’至3)
SEQ ID NO:1 CUCUCUCUCUCU
SEQ ID NO:2 CAUUGGUUCAAACAU
SEQ ID NO:3 AGGUUCAAACAU
合成所需寡核苷酸后，将受控多孔玻璃(CPG)固体载体转移至2ml微量离心管。从CPG裂解寡核苷酸，并且通过在65℃下在1ml 40％甲基胺水溶液中孵育30min脱保护。去除上清液并且用1ml水洗涤CPG。汇集上清液并且干燥。通过用250μl新鲜无水三乙基三氢氟化铵在室温下在超声浴中处理2小时从RNA残余物去除叔丁基-二甲基甲硅烷基保护基团。通过1.5ml正丁醇沉淀寡核苷酸。在-20℃下冷却样品1小时，然后在10,000g下离心10分钟。倾析出上清液后，用正丁醇洗涤团粒另外一次。
然后，使用缓冲液A＝(10.0％，0.5M TRIS和10.0％ACN)、pH 7.5和缓冲液B＝缓冲液A中1.0M氯化锂线性梯度，通过离子交换HPLC纯化寡核苷酸。将整个样品加载在Source15Q柱(1.0cm×25cm)上并且用线性5％至75％乙腈梯度经40分钟洗脱。在260nm下监控样品并且收集对应于所需寡核苷酸物类的峰，并且通过添加5.0体积的(丙酮中2％LiClO4)进行沉淀，接着在10,000g下离心10分钟。倾析上清液，并且用乙醇洗涤团粒。
以下描述用于寡核苷酸合成的1.0μmol磷酸二酯的一般程序。将用于所关注的特定序列的亚酰胺(固体)个别置于20mL expedite瓶中，并且溶解在一定量的无水乙腈中以制备0.075M溶液。用氩吹扫瓶，并且在迅速密封螺旋盖后进行振荡，以完全溶解固体。然后，将单体溶液瓶拧到合成仪上。另外，1.0um expedite柱与ChemGenes公司生产的产品5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-丁二酰基lcaa-A载体，目录#N-6104。制备天然RNA碱基加载的载体，并且附接至合成仪。表2示出使用自动DNA/RNA合成仪的寡核苷酸合成流程。
表2：自动DNA/RNA合成仪上的寡核苷酸合成
RNA方案
根据如表2中所列的关键特征的总结合成完成后，用3.0ml乙醚洗涤受控多孔玻璃(CPG)固体载体并且转移至2ml微量离心管。从CPG裂解寡核苷酸1，并且通过在65℃下在1ml 40％甲基胺水溶液中孵育30min脱保护。去除上清液并且用1ml水洗涤CPG。汇集上清液并且干燥。通过用500μl新鲜12.0％四乙基氟化铵的DMSO溶液在45℃下在超声浴中处理1小时从RNA残余物去除叔丁基-二甲基甲硅烷基保护基团。用1.5ml正丁醇沉淀寡核苷酸1。沉淀后，在-20℃下冷却样品1小时，然后在10,000g下离心10分钟。倾析出上清液后，用正丁醇洗涤团粒一次。用500μl乙醇进行最终洗涤。将样品在10000rpm下离心5分钟。离心后，倾析出上清液。将团粒溶解在1000μl M.Q水中。测量样品的光学密度OD(脱盐粗产物)。然后，使用缓冲液A(10.0％，0.5M TRIS和10.0％ACN)、pH 7.5和缓冲液B(缓冲液A中1.0M氯化锂)线性梯度，通过离子交换HPLC纯化寡核苷酸。
将整个样品加载在Source15Q柱(1.0cm×25cm)上并且用线性5％至75％乙腈梯度经40分钟洗脱。在260nm下监控样品并且收集对应于所需寡核苷酸物类的峰，并且通过添加5.0体积的在丙酮中的2％LiClO4进行沉淀，接着在10,000g下离心10分钟。倾析上清液，并且用乙醇洗涤团粒。
寡核苷酸合成实施例1：寡核苷酸1A：合成根据SEQ ID NO:1具有序列rC*rU*rC*rU*rC*rU*rC*rU*rC*rU*rC*rU*的寡核苷酸1A，其中r为核糖，并且*表示由在合成过程中使用氘标记的亚磷酰胺产生的氘化核糖。寡核苷酸1A使用用1μmol规模氘化RNA亚磷酰胺化学法导向的5’→3’法进行合成。使用标准RNA 1μmol循环和单体与固体载体的10.0分钟偶联时间，在Expedite 8900合成仪上进行合成。
所用的亚酰胺为：(A)1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2,3,4,5五氘β-D呋喃核糖基)尿嘧啶，结构XIII；和(B)1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2,3,4,5五氘β-D呋喃核糖基)N4苯甲酰基胞嘧啶(化合物结构XXII)。所用固体载体为1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-丁二酰基Icaa-CPG-2,3,4,5五氘β-D呋喃核糖基)尿嘧啶(化合物结构XV)。毛细电泳分析结果示出在图23A-23C中。
寡核苷酸合成实施例2：寡核苷酸1B：合成根据SEQ ID NO:1具有序列rC**rU**rC**rU**rC**rU**rC**rU**rC**rU**rC**rU**的寡核苷酸1B，其中r为核糖，并且**表示使用氘标记的亚磷酰胺由合成产生的比率为25:75的氘化核糖与天然、未修饰核糖的混合物，以及与天然未修饰的核苷亚磷酰胺的混合物。使用1μmol规模5’→3’导向的RNA亚磷酰胺化学法合成具有大约25％氘标签的寡核苷酸1。使用标准RNA 1μmol循环和单体与固体载体的10.0分钟偶联时间，在Expedite 8900合成仪上进行合成。
所用的亚酰胺为(A)1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2,3,4,5五氘β-D呋喃核糖基)尿嘧啶(结构XIII)；(B)1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2,3,4,5,5’五氘β-D呋喃核糖基)N4苯甲酰基胞苷(XXII)；(C)1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺-2,3,4,5,5’五氘β-D呋喃核糖基)N6腺苷，天然RNA碱基，用于在序列中混合天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5674；以及(D)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷Nbz-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，天然RNA碱基，用于在序列中混合天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5672。所用固体载体为(A)1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-丁二酰基Icaa-CPG-2,3,4,5,5’五氘β-D呋喃核糖基)尿嘧啶(结构XV)，和(B)5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-2’-丁二酰基Icaa-A载体，由ChemGenes公司生产，目录号N-6104。将天然RNA碱基加载的载体与以上列出的载体A按25:75的比率混合，以获得1.0微摩尔柱，以便获得对于在序列中混合的修饰的RNA碱基来说，由比率为75:25的具有天然U的3’-末端U和氘修饰的3’-末端U组成的寡核苷酸1B。
寡核苷酸合成实施例3：寡核苷酸1C：合成根据SEQ ID NO:1具有序列rCrUrCrUrCrUrCrUrCrUrCrU的寡核苷酸1C，其中r为由未修饰的生物碱基尿苷和胞苷组成的核糖单元。使用1μmol规模3’→5’导向的RNA亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸。使用标准RNA 1μmol循环和单体与固体载体的10.0分钟偶联时间，在Expedite 8900合成仪上进行合成。所用的亚酰胺包括(A)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5674；和(B)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷Nbz-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于混合天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5672。所用固体载体为5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-2’-丁二酰基Icaa-A载体，由ChemGenes公司生产，目录号N-6104。天然RNA碱基加载的载体。
寡核苷酸合成实施例4：寡核苷酸2：合成具有根据SEQ ID NO:2的由未修饰的生物碱基尿苷、胞苷以及腺苷组成的序列的寡核苷酸2。使用1μmol规模5’→3’导向的RNA亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸。使用标准RNA 1μmol循环和单体与固体载体的10.0分钟偶联时间，在Expedite 8900合成仪上进行合成。所用的亚酰胺包括(A)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5674；(B)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷Nbz-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5672；(C)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-腺苷Nbz-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5671；(D)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-鸟苷Nibu-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5673。所用固体载体包括5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-2’-丁二酰基Icaa-A载体，由ChemGenes公司生产，目录号N-6104。天然RNA碱基加载的载体。毛细电泳分析的结果示出在图24A-24C中。
寡核苷酸合成实施例5：寡核苷酸3：合成具有SEQ ID NO:3的由未修饰的生物碱基尿苷和胞苷、鸟苷以及腺苷组成的序列的寡核苷酸3。使用1μmol规模5’→3’导向的RNA亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸。使用标准RNA 1μmol循环和单体与固体载体的10.0分钟偶联时间，在Expedite 8900合成仪上进行合成。所用的亚酰胺包括(A)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5674；(B)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷Nbz-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5672；(C)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-腺苷Nbz-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5671；以及(D)5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-鸟苷Nibu-3’-N,N-二异丙基氰基乙基亚磷酰胺，用于天然RNA碱基序列的天然RNA碱基，ChemGenes目录产品ANP-5673。所用固体载体为5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-2’-丁二酰基lcaa-A载体，由ChemGenes公司生产，目录号N-6104。天然RNA碱基加载的载体。毛细电泳分析的结果示出在图25A-25C中。
将合成具有用氘标记的糖的数种优选的RNA序列并且用于根据以上所述的方法进行生物测定和测试，参见表3。预期合成中所包括的步骤不会引起任何氘损失，并且预期将维持氘/氢比。
表3.有待通过常规合成方法合成的另外的氘化/天然寡核苷酸序列
SEQ ID NO 序列 名称
SEQ ID NO.4 CAUUGGUUCAAACAU ECX
SEQ ID NO.5 UUGAUGAAACAU CLX
SEQ ID NO.6 CAGUUCAAACAU PSX
SEQ ID NO.7 GACCAGUUCAAACAU PSX-2
SEQ ID NO.8 AGGUUCAAACAU KLX
SEQ ID NO.9 AAACGCCUCCAU STRX
SEQ ID NO.10 AAAUGAAAAUGUCAU STRX-2
SEQ ID NO.11 AAAUUCUAACAU STAX
SEQ ID NO.12 UUCAAAUUCUAACAU STAX-2
寡核苷酸合成实施例6：寡核苷酸4：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸4，其具有SEQ ID NO:4，具有序列r-C*A*U*U*G*G*U*U*C*A*A*A*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:4的寡核苷酸4还可经合成具有序列r-C*p(s)A*p(s)U*p(s)U*p(s)G*p(s)G*p(s)U*p(s)U*p(s)C*p(s)A*p(s)A*p(s)A*p(s)C*p(s)A*p(s)U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；**表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQ ID NO:4的寡核苷酸4，以组成通过天然磷酸二酯键或变异的核苷酸键如硫代磷酸酯键附接至核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物。如本文所用，术语部分是指糖和/或碱基部分上的不包括氘的一个或多个位置。另外，所述术语可指包括氘化核糖单元和未氘化核糖单元作为骨架的一部分的合成的寡核苷酸。毛细电泳分析的结果示出在图26A-26C中。
寡核苷酸合成实施例7：寡核苷酸5：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸7，其具有SEQ ID NO:5，具有序列r-U*U*G*A*U*G*A*A*A*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’-五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:5的寡核苷酸7还可经合成具有序列r-U*p(s)U*p(s)G*p(s)A*p(s)U*p(s)G*p(s)A*p(s)A*p(s)A*p(s)C*p(s)A*p(s)U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；**表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷；p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQ ID NO:5的寡核苷酸7，从而具有附接至各核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物并且具有天然磷酸二酯核苷酸键或变异键如硫代磷酸酯键。毛细电泳分析的结果示出在图25A-25C中。
寡核苷酸合成实施例8：寡核苷酸6：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸6，其具有SEQ ID NO:6，具有序列r-C*A*G*U*U*C*A*A*A*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:6的寡核苷酸6还可经合成具有序列r-C*p(s)A*p(s)G*p(s)U*p(s)U*p(s)C*p(s)A*p(s)A*p(s)A*p(s)C*p(s)A*p(s)U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；其中*表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQ ID NO:6的寡核苷酸6，从而具有通过天然磷酸二酯核苷酸键或变异键如硫代磷酸酯键附接至核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物。
寡核苷酸合成实施例9：寡核苷酸7：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸7，其具有SEQ ID NO:6，具有序列r-G*A*C*C*A*G*U*U*C*A*A*A*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:7的寡核苷酸7还可经合成具有序列r-C*p(s)A*p(s)G*p(s)U*p(s)U*p(s)C*p(s)A*p(s)A*p(s)A*p(s)C*p(s)A*p(s)U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；其中*表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQ ID NO:7的寡核苷酸7，从而具有附接至核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物以及天然磷酸二酯核苷酸键或变异键如硫代磷酸酯键。
寡核苷酸合成实施例10：寡核苷酸8：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸8，其具有SEQ ID NO:8，具有序列r-A*G*G*U*U*C*A*A*A*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:8的寡核苷酸8还可经合成具有序列r-A*p(s)G*p(s)G*p(s)U*p(s)U*p(s)C*p(s)A*p(s)A*p(s)A*p(s)C*p(s)A*p(s)U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；其中*表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQ ID NO:8的寡核苷酸8，从而具有附接至核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物以及天然磷酸二酯键或变异核苷酸键如硫代磷酸酯键。
寡核苷酸合成实施例11：寡核苷酸9：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸11，其具有SEQ ID NO:11，具有序列r-A*A*A*C*G*C*C*U*C*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:11的寡核苷酸11还可经合成具有序列r-A*p(s)A*p(s)A*p(s)C*p(s)G*p(s)C*p(s)C*p(s)U*p(s)C*p(s)C*p(s)A*p(s)U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；其中*表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQ ID NO:11的寡核苷酸11，从而具有附接至核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物以及天然磷酸二酯键或变异核苷酸键如硫代磷酸酯键。
寡核苷酸合成实施例12：寡核苷酸10：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸10，其具有SEQ ID NO:10，具有序列r-A*A*A*C*G*C*C*U*C*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:10的寡核苷酸10还可经合成具有序列r-rA*p(s)A*p(s)A*p(s)U*p(s)G*p(s)A*p(s)A*p(s)A*p(s)A*p(s)U*p(s)*G*p(s)*U*p(s)*p(s)Ap(s)U**，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；其中*表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQ ID NO:10的寡核苷酸10，从而具有附接至核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物以及天然磷酸二酯键或变异核苷酸键如硫代磷酸酯键。
寡核苷酸合成实施例13：寡核苷酸11：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸11，其具有SEQ ID NO:11，具有序列r-A*A*A*U*U*C*U*A*A*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:11的寡核苷酸11还可经合成具有序列r-A*p(s)A*p(s)A*p(s)U*p(s)U*p(s)C*p(s)U*p(s)A*p(s)A*p(s)C*p(s)A*p(s)U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；其中*表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQ ID NO:11的寡核苷酸11，从而具有附接至核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物以及天然磷酸二酯键或变异核苷酸键如硫代磷酸酯键。
寡核苷酸合成实施例14：寡核苷酸12：使用以上所概括的程序，可合成寡核苷酸12，其具有SEQ ID NO:12，具有序列r-U*U*C*A*A*A*U*U*C*U*A*A*C*A*U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；*表示部分或完全氘化的核糖，如通过天然磷酸二酯骨架附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，如图8所示。具有SEQ ID NO:12的寡核苷酸12还可经合成具有序列r-U*p(s)U*p(s)C*p(s)A*p(s)A*p(s)A*p(s)U*p(s)U*p(s)C*p(s)U*p(s)A*p(s)A*p(s)C*p(s)A*p(s)U*，其中r为核糖寡核苷酸或RNA序列；其中*表示部分或完全氘化的核糖，如附接至RNA分子的各核苷单元的2,3,4,5,5’五氘-D呋喃核糖苷，p(s)表示核苷酸间硫代磷酸酯。另外，可使用氘化亚磷酰胺和天然亚磷酰胺合成具有SEQID NO:12的寡核苷酸12，从而具有附接至核碱基的部分或完全氘化的核糖与天然核糖的混合物以及天然磷酸二酯键或变异核苷酸键如硫代磷酸酯键。
本说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物以引用的方式并入本文中，其程度如同指示以引用的方式将各单个出版物明确且单独地并入。
还应理解尽管说明了本发明的某一形式，但本发明不限于本文描述且示出的特定形式或安排。所属领域的技术人员应清楚可在不背离本发明的范围的情况下作出各种变化，并且不认为本发明限于说明书和本文所包括的任何附图/图式中所示且描述的内容。
所属领域的技术人员将易于理解本发明可充分改适来进行所提及的目的并且获得所提及的目标和优点以及本文所固有的那些部分。本文描述的实施方案、方法、程序以及技术代表目前优选的实施方案，旨在为示例性的，并且不旨在限制范围。所属领域的技术人员将会想到本发明的精神所涵盖且随附权利要求书的范围所限定的其中的变化和其他用途。尽管已结合特定优选实施方案来描述本发明，但应理解要求保护的发明不应不当地限于所述特定实施方案。实际上，所属领域的技术人员显而易见的、对用于进行本发明的所述模式的各种修改旨在处于以下权利要求书的范围内。

Claims (36)

1.一种修饰的亚磷酰胺，其具有包括以下的结构式：
其中X或X1表示氘或氢，R1表示阻断基团，R2独立地表示阻断基团，R3为磷酸酯保护基团、优选地氰基乙基二烷基氨基，并且R4独立地为保护基团，B表示核碱基。
2.根据权利要求1所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的R1为二甲氧基三苯甲基保护基团，R2为t-叔丁基二甲基氯硅烷基保护基团，R3为二异丙氨基保护基团，R4为3’β-氰基乙基保护基团。
3.根据权利要求1所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的B包含阻断基团。
4.根据权利要求1所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的核碱基为生物碱。
5.根据权利要求4所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的生物碱为腺嘌呤。
6.根据权利要求4所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的生物碱为鸟嘌呤。
7.根据权利要求4所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的生物碱为胞嘧啶。
8.根据权利要求4所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的生物碱为尿嘧啶。
9.根据权利要求4所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的核碱基为修饰的核碱基。
10.根据权利要求9所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的修饰的核碱基为氘化腺嘌呤。
11.根据权利要求9所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的修饰的核碱基为氘化鸟嘌呤。
12.根据权利要求9所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的修饰的核碱基为氘化胞嘧啶。
13.根据权利要求9所述的修饰的亚磷酰胺，其中所述的修饰的核碱基为氘化尿嘧啶。
14.根据权利要求1所述的修饰的亚磷酰胺，其中核糖是部分氘化的。
15.一种氘化的寡核苷酸固体载体，其具有如下结构：
其中X表示氘或氢，R1表示阻断基团，R2独立地表示阻断基团，R3表示连接分子，并且R4表示固体载体，并且B表示核碱基。
16.根据权利要求15所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的R1为二甲氧基三苯甲基保护基团，R2为t-叔丁基二甲基氯硅烷基保护基团，R4为丁二酰基Icaa，且R4为CPG。
17.根据权利要求15所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的核碱基为生物碱。
18.根据权利要求17所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的生物碱为腺嘌呤。
19.根据权利要求17所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的生物碱为鸟嘌呤。
20.根据权利要求17所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的生物碱为胞嘧啶。
21.根据权利要求17所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的生物碱为尿嘧啶。
22.根据权利要求15所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的核碱基为修饰的核碱基。
23.根据权利要求22所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的修饰的核碱基为氘化腺嘌呤。
24.根据权利要求22所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的修饰的核碱基为氘化鸟嘌呤。
25.根据权利要求22所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的修饰的核碱基为氘化胞嘧啶。
26.根据权利要求22所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中所述的修饰的核碱基为氘化尿嘧啶。
27.根据权利要求15所述的氘化的寡核苷酸固体载体，其中核糖是部分氘化的。
28.一种合成修饰的亚磷酰胺的方法，包括将氘引入所述的亚磷酰胺。
29.一种合成修饰的亚磷酰胺的方法，包括将氘引入所述的亚磷酰胺，进一步包括如下步骤：
将核糖结构转化为氘化的呋喃核糖苷(ribofuranoside)；
将核碱基连接到所述氘化的呋喃核糖苷，所述的连接由此形成氘化的核苷；
连接一个或多个保护基团到所述氘化的核苷。
30.根据权利要求28所述的合成修饰的亚磷酰胺的方法，其中所述的核碱基为天然的核碱基。
31.根据权利要求30所述的合成修饰的亚磷酰胺的方法，其中所述的天然的核碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶。
32.根据权利要求28所述的合成修饰的亚磷酰胺的方法，其中所述的核碱基为修饰的核碱基。
33.根据权利要求32所述的合成修饰的亚磷酰胺的方法，其中所述的修饰的核碱基为氘化的腺嘌呤、氘化的鸟嘌呤、氘化的尿嘧啶或氘化的胞嘧啶。
34.根据权利要求28所述的合成修饰的亚磷酰胺的方法，其中所述的连接一个或多个保护基团包括将DMT保护基团连接到5’羟基。
35.根据权利要求34所述的合成修饰的亚磷酰胺的方法，其中所述的连接一个或多个保护基团包括连接二异丙氨基保护基团。
36.根据权利要求35所述的合成修饰的亚磷酰胺的方法，其中所述的连接一个或多个保护基团包括连接3’β-氰基乙基保护基团。
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