CN104968363A - Pi3k/akt抑制剂化合物与her3/egfr抑制剂化合物的组合及使用方法 - Google Patents

Pi3k/akt抑制剂化合物与her3/egfr抑制剂化合物的组合及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供包含GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐与MEHD7945A的组合。所述组合特别适用于治疗过度增殖性病症，如癌症(例如三阴性乳腺癌)。

Description

PI3K/AKT抑制剂化合物与HER3/EGFR抑制剂化合物的组合及使用方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2012年12月7日提交的美国申请序列号61/734,796和2013年10月9日提交的美国申请序列号61/888,892的优先权的权益，所述申请以引用的方式并入本文。
序列表
本申请包含已以ASCII格式电子地提交且据此以引用的方式整体并入的序列表。于2013年12月5日创建的所述ASCII拷贝名为01000.056WO1_SL.txt且大小为8,675字节。
发明领域
本发明大体涉及具有针对过度增殖性病症如癌症(例如，三阴性乳腺癌)的活性的化合物的药物组合，所述药物组合包括抑制PI3K/AKT途径的化合物和阻断HER3/EGFR的化合物的组合。本发明还涉及使用所述组合用于体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关联的病理状况的方法。
发明背景
蛋白激酶(PK)是通过从ATP转移末端(γ)磷酸酯来催化蛋白质的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上的羟基的磷酸化作用的酶。通过信号转导途径，这些酶取决于PK活性以一种方式或另一种方式调节细胞生长、分化和增殖，即细胞生命的实际上所有方面(Hardie,G.和Hanks,S.(1995)The Protein Kinase Facts Book.I和II,Academic Press,SanDiego,CA)。此外，已经将异常的PK活性与许多病症相关联，所述病症的范围从相对无生命威胁的疾病如银屑病到极其致命的疾病例如恶性胶质瘤(脑癌)。蛋白激酶是用于治疗性调节的重要目标类别(Cohen,P.(2002)Nature Rev.Drug Discovery 1:309)。
目前，仍然需要改进的可以用于治疗过度增殖性疾病如癌症(例如三阴性乳腺癌)的方法和组合物。
发明概述
已经确定通过施用GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合用于过度增殖性病症的治疗性治疗，可以实现在体外和体内抑制癌细胞的生长方面的改善效果。所述组合和方法将适用于过度增殖性病症如癌症，例如三阴性乳腺癌的治疗。在某些实施方案中，组合的施用可以提供协同效应。
因此，本发明的某些实施方案提供包含以下的治疗性组合：小分子ATP-竞争性AKT抑制剂GDC-0068(式I)或其药学上可接受的盐(参见WO 2008/006040)，
或小分子ATP-竞争性pan-PI3K抑制剂GDC-0941(式II)、或其药学上可接受的盐(参见US 7,781,433；US 8,247,397，Folkes等,J.Med.Chem.,51,5522-5532(2008))，也称为pictilisib，CAS登记号：957054-30-7，命名为4-(2-(1H-吲唑-4-基)-6-((4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)吗啉，并具有以下结构：
与MEHD7945A组合，MEHD7945A是包含两个相同的抗原结合结构域的双重作用抗体，每个所述结构域特异性地结合至HER3和EGFR(参见WO 2010/108127(例如，图33)和Schaefer等，Cancer Cell,20,472-486(2011)中的DL11f)；或与(西妥昔单抗)组合，是目前指定用于治疗头颈癌和结直肠癌的表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂；或与(帕尼单抗)组合，是目前指定作为单一药剂用于在氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康的化疗方案时或之后疾病进展情况下的转移性结直肠癌的治疗的表皮生长因子受体拮抗剂。
因此，本发明的某些实施方案涉及GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合，所述组合用于过度增殖性病症的治疗性治疗。
在某些实施方案中，过度增殖性病症是癌症。
在某些实施方案中，癌症与PTEN突变相关联。
在某些实施方案中，癌症与AKT突变、过表达或扩增相关联。
在某些实施方案中，癌症与PI3K突变相关联。
在某些实施方案中，癌症选自间皮瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、胃癌、结肠癌、肾癌、头颈癌，以及神经胶质瘤。
在某些实施方案中，癌症是乳腺癌。
在某些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在某些实施方案中，GDC-0068或其药学上可接受的盐与MEHD7945A组合施用。
在某些实施方案中，GDC-0941或其药学上可接受的盐与MEHD7945A组合施用。
在某些实施方案中，GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐与MEHD7945A同时施用。
在某些实施方案中，GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐与MEHD7945A依次施用。
本发明的某些实施方案涉及GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合，所述组合用于改善患有过度增殖性病症的患者的生活质量的治疗用途。
本发明的某些实施方案涉及GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合，所述组合用于治疗过度增殖性病症。
本发明的某些实施方案涉及GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合，所述组合用于治疗由AKT激酶调节的疾病或病状。
本发明的某些实施方案涉及GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合在制备用于治疗哺乳动物的过度增殖性病症的药物中的用途。
本发明的某些实施方案涉及GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合在制备用于治疗哺乳动物的由AKT激酶调节的疾病或病状的药物中的用途。
本发明的某些实施方案涉及包括GDC-0068或GDC-0941、或其药学上可接受的盐和MEHD7945A、容器以及包装插页或标签的试剂盒，所述包装插页或标签指示GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A用于治疗过度增殖性病症(例如癌症，如三阴性乳腺癌)的施用。
本发明的某些实施方案涉及包含GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的产品，其作为组合制剂在过度增殖性病症的治疗中单独、同时或依次使用。
本发明的某些实施方案涉及治疗哺乳动物的过度增殖性病症(例如，癌症，如三阴性乳腺癌)的方法，其包括向哺乳动物施用GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合。
本发明的某些实施方案涉及治疗哺乳动物的由AKT激酶调节的疾病或病状的方法，其包括向哺乳动物施用GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合。
在某些实施方案中，哺乳动物是患有三阴性乳腺癌(TNBC)的人类，其由于具有升高的EGFR表达的TNBC而被选择进行治疗。
在某些实施方案中，在治疗之后测量HER3的表达，其中相对升高的HER3表达指示因缺乏完全肿瘤消退的升高的风险。
附图简述
图1.TNBC临床前模型中的EGFR、HER3和PI3K/Akt途径的组合抑制的治疗活性。(A)蛋白质印迹显示所示治疗24小时后EGFR、HER3和下游信号途径的表达和活化。在10nM下使用MEHD7945A，而GDC-0068和GDC-0941均为1uM。(B)如所示处理的MDA-MB-468和HCC70细胞的五天增殖分析。在10nM下使用MEHD7945A，而GDC-0068和GDC-0941均为1uM。(C)如所示处理的TNBC患者来源的异种移植物(PDX)的肿瘤生长曲线。每周两次给予10mg/Kg的MEHD7945A，每天给予75mg/Kg的GDC-0941和每天给予40mg/Kg的GDC-0058。(D)如所示处理的PDX中的活化的和总的EGFR和HER3的CEER分析。在最后一次药物施用后2小时收获肿瘤。相对于总细胞角蛋白的量来标准化蛋白质以避免来自基质污染的信号，并且由计算单位(CU)来量化。误差条示出相对于单一试剂，组合GDC-0068或GDC-0941和MEHD7945A的SEM；*p<0.05，**p<0.01。使用双侧学生t-检验计算P-值。
图2.MEHD7945A或西妥昔单抗与PI3K抑制组合的功效。(A)左：如所示处理的HCC70细胞的五天增殖分析。在10nM下使用MEHD7945A和西妥昔单抗，而GDC-0068和GDC-0941均为1uM。右：蛋白质印迹显示如所示处理的HCC70细胞中的pEGFR和pHER3的表达。(B)如所示处理的HCC70异种移植物的肿瘤生长曲线。每周两次给予10mg/Kg的MEHD7945A和西妥昔单抗，并且每天给予75mg/Kg的GDC-0941。误差条示出相对于单一试剂或组合GDC-0941和西妥昔单抗，组合GDC-0941和MEHD7945A的SEM；*p<0.05。(C)如所示处理的HCC70异种移植物中的活化的和总的EGFR和HER3的CEER分析。误差条示出针对pEGFR的所有情况相对于对照(**p<0.01)，以及组合GDC-0068和MEHD7945A相对于组合GDC-0941和西妥昔单抗或西妥昔单抗单一试剂(*p<0.05)的SEM。使用双侧学生t-检验计算P-值。
图3.TNBC患者中的EGFR表达和对于抗EGFR治疗的应答。(A)用基于帕尼单抗疗法治疗的40位TNBC患者中的基线EGFR表达与病理学完全应答(pCR)之间的相关性。(B)基线与患者的残余肿瘤之间的EGFR表达的变化，所述患者在用基于帕尼单抗疗法的治疗时未获得pCR。左条是治疗前的而右条是治疗后的。(C)代表性IHC示出相对于基线试样(治疗前)，在残余肿瘤中的减小的EGFR表达(治疗后)。
图4.TNBC患者中的HER3表达和对于抗EGFR治疗的应答。(A)基线与在用基于帕尼单抗疗法的治疗时未获得pCR的患者的残余肿瘤之间的HER3表达的变化。左条是治疗前的而右条是治疗后的。(B)代表性IHC示出相对于基线试样(治疗前)，在残余肿瘤中的增大的HER3表达(治疗后)。
图5.图5描绘作为双重HER3/EGFR抑制剂的MEHD7945A。
示例性实施方案和定义的详述
在本说明书和权利要求书中使用的词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”“包括(include)”、“包括(including)”和“包括(includes)”意在指定所述特征、整数、组分或步骤的存在，但它们并不排除一个或多个其它的特征、整数、组分、步骤或其组合的存在或加入。
术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”指治疗性治疗，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或紊乱，例如癌症的生长、发展或扩散。出于本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测或是不可检测。“治疗”还可以意指与如果没有接受治疗的预期的存活期相比，延长存活期。需要治疗的那些包括已患有病状或病症例如患有三阴性乳腺癌的患者。
短语“治疗有效量”意指这样的量，其(i)治疗特定疾病、病状或病症，(ii)减弱、改善或消除一种或多种特定疾病、病状或病症的症状，或(iii)预防或延迟一种或多种本文所述的特定疾病、病状或病症的症状的发生。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤的尺寸；抑制(即，在某种程度上减慢并且优选停止)癌细胞对周边器官的浸润；抑制(即，在某种程度上减慢并并且优选停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与癌症相关联的一种或多种症状。在组合可以阻止生长和/或杀死现有的癌细胞的程度上，它可以为细胞抑制的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，功效可以例如通过评估疾病发展的时间(TTP)和/或测定应答率(RR)来测量。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长不受调控的生理病状。“肿瘤”包含一种或多种癌性细胞。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric)或胃癌(stomach)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾(kidney)癌或肾(renal)癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。如本文所用的胃癌，包括胃癌，其可以发展至胃的任何部分中，并且可以延伸遍布至胃以及其它器官；特别是食道、肺、淋巴结和肝脏。
“化疗剂”是生物学的(例如大分子)或化学的(例如小分子)化合物，可用于癌症的治疗，而不考虑作用机理。
“铂剂”是包含铂，例如卡铂、顺铂以及奥沙利铂的化疗剂。
术语“哺乳动物”包括但不限于，人类、小鼠、大鼠、豚鼠、猴、狗、猫、马、牛、猪、羊和家禽。术语“患者”是指哺乳动物，并且在一个实施方案中，患者是男性人类或女性人类。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装内的用法说明，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于使用这些治疗性产品的警告。
本文所使用的短语“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包括但不限于双甲磺酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟碱酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐“甲磺酸酯”、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、以及双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐。药学上可接受的盐可涉及夹杂另一分子，如乙酸盐离子、琥珀酸盐离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可具有多于1个的带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个的抗衡离子。
可以通过本领域中任何适当的方法制备所需的药学上可接受的盐。例如，用无机酸处理游离碱，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等，或用有机酸，如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸，如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羟基酸，如柠檬酸或酒石酸、氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸，芳族酸，如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，如对甲苯磺酸或乙磺酸等。讨论通常被认为适用于从碱性药物化合物来形成药学上有效的或可接受的盐的酸，例如，通过P.Stahl等，Camille G.(编者)Handbook of Pharmaceutical Salts.Properties,Selection and Use.(2002)Zurich:Wiley-VCH；S.Berge等，Journal of Pharmaceutical Sciences(1977)66(1)1 19；P.Gould,International J.of Pharmaceutics(1986)33201 217；Anderson等，The Practice of Medicinal Chemistry(1996),Academic Press,New York；Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版，(1995)Mack Publishing Co.,Easton PA；并且在橙皮书中(Food&Drug Administration,Washington,D.C.在其网站上)。这些公开以另外引用的方式并入本文。
短语“药学上可接受的”表示所述物质或组合物在化学上和/或毒理学上与构成制剂的其它成分和/或用所述制剂治疗的哺乳动物是相容的。
本文所用的术语“协同”是指比两个或多个单一试剂的相加作用更有效的治疗组合。可以基于在本领域中已知的测定中获得的结果来确定协同相互作用。可以使用Chou和Talalay组合方法，以及配备CalcuSyn软件的剂量-效应分析来分析这些测定的结果以获得组合指数(Chou和Talalay,1984,Adv.Enzyme Regul.22:27-55)。可以利用用于量化抗癌剂之间的协同作用、相加作用和拮抗作用的标准程序来分析本文提供的组合。示例性程序由Chou和Talalay在“New Avenues inDevelopmental Cancer Chemotherapy，”Academic Press，1987，第2章中有所描述。小于0.8的组合指数值表示协同作用，大于1.2的值表示拮抗作用，并且在0.8至1.2之间的值表示相加作用。组合治疗可以提供“协同作用”并且证明“协同性”，即当一起使用活性成分时实现的作用大于单独使用所述化合物所产生的作用之和。当活性成分是：(1)以组合的单位剂量制剂的形式共同配制和同时施用或递送；(2)作为单独的制剂交替地或并行地递送；或(3)通过一些其它方案时，可以获得协同作用。在交替治疗中递送的情况下，当化合物按依次地施用或递送(例如通过在单独注射器中的不同注射)时，可以获得协同作用。通常，在交替治疗期间，有效剂量的每种活性成分按依次(即连续地)施用，而在组合治疗中，有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。使用BLISS独立模型和最高单一试剂(HSA)模型来评估组合效果(Lehár等，2007,Molecular Systems Biology 3:80)。BLISS分数量化来自单一试剂的增强程度，并且正BLISS分数(大于0)表明大于简单加合。大于250的累积正BLISS分数被认为是在测试的浓度范围内观察到的强协同作用。HSA分数(大于0)表明组合效果大于在对应浓度下单一试剂的最大应答。癌细胞的突变状态可以是癌细胞将如何应答于不同的治疗方案的生物标记。例如，具有PI3K途径(例如PI3K或AKT)突变的癌细胞对于在此描述的组合治疗可以显示正(例如协同)应答。进一步，癌细胞的PTEN状态也可以是生物标记。因此，本发明的某些实施方案包括利用这些组合治疗来治疗癌细胞的方法(体外或体内)，所述癌细胞具有这些生物标记的组合。本发明的某些实施方案包括选择具有这些生物标记的组合的患者用于组合治疗。
除了提供对给定的过度增殖性病症的改进治疗之外，与由接受不同治疗的同一患者所经历的生活质量相比，施用本发明的特定组合可以改善患者的生活质量。例如，与在同一患者接受了仅一种单独的试剂作为治疗时他们将经历的生活质量相比，向患者施用组合可以提供改善的生活质量。例如，用在此描述的组合的组合治疗可以减少治疗剂的所需要的剂量。组合疗法还可以减少或消除使用化疗剂的需要和与高剂量化疗试剂相关联的副作用(例如恶心、呕吐、脱发、皮疹、食欲下降、体重减轻等)。组合还可以引起降低的肿瘤负荷和相关联的副作用，如疼痛、器官功能障碍、体重减轻等。因此，本发明的一个方面提供用于治疗用途的组合，其用于利用本文所述的组合改善被治疗过度增殖性病症的患者的生活质量。
一个方面包括患有癌症例如，包括PI3K、AKT或PTEN突变的患者的肿瘤生长抑制(TGI)的方法，包括向患者施用本文所述的组合。在某些实施方案中，组合提供协同效应。
在某些实施方案中，组合的TGI大于单独的GDC-0068或GDC-0941或MEHD7945A中的任一个的TGI。在某些实施方案中，组合的TGI大于单独试剂的TGI约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75百分比。
测量TGI的方法是本领域已知的。在一个示例性方法中，根据治疗前后的患者确定和比较平均肿瘤体积。可以使用本领域中的任何方法，例如UltraCal IV卡钳(Fred V.Fowler Company)或用PET(正电子发射断层扫描术)，或通过一些其它方法在两个尺寸上(长度和宽度)来测量肿瘤的体积。可以使用公式肿瘤体积(mm3)＝(长×宽2)×0.5。可以使用混合建模线性混合效应(LME)方法(Pinheiro等，2009)在多个时间段内测量肿瘤体积。这种方法可以解决两个重复测量(和多个患者)。可以使用三次回归样条以拟合在各剂量水平下肿瘤体积的时程的非线性曲线。然后使这些非线性曲线与混合模型内的剂量相关。作为媒介物的百分比的肿瘤生长抑制可以计算为相对于媒介物的每天拟合曲线下百分比面积(AUC)，使用下面的公式：
使用这个公式，100％的TGI值表明肿瘤停滞，大于约1％但小于约100％的TGI值表明肿瘤生长抑制，而大于约100％的TGI值表明肿瘤消退。
GDC-0068、GDC-0941和MEHD7945A的制备
可以如WO 2008/006040中所述制备小分子ATP-竞争性AKT抑制剂GDC-0068(式I)或其药学上可接受的盐：
可以如美国7,781,433、美国2010/0292468或Folkes等,J.Med.Chem.,51,5522-5532(2008)中所述制备小分子ATP-竞争性pan-PI3K抑制剂GDC-0941(式II)或其药学上可接受的盐：
可以如WO 2010/108127(参见DL11f，例如，图33)和Schaefer等，Cancer Cell,20,472-486(2011)中所述制备包含两个相同的抗原结合结构域的双重作用抗体MEHD7945A，其中每个结构域特异性地结合至HER3和EGFR。用于重链可变区的MEHD7945A的氨基酸序列作为SEQ ID NO:1提供，并且轻链可变区作为SEQ ID NO:2提供。用于重链区的MEHD7945A的氨基酸序列作为SEQ ID NO:3提供，并且轻链可变区作为SEQ ID NO:4提供。
分离方法
在用于制备化合物的任何合成方法中，彼此和/或从起始原料分离反应产物可以是有益的。通过本领域公知的技术分离和/或纯化每个步骤或系列步骤的所需产物至所需程度的均质性。通常，这种分离包括多相提取、从溶剂或溶剂混合物中结晶、蒸馏、升华或色谱法。色谱法可包括许多方法，包括(例如)：反相和正相；尺寸排阻；离子交换；高、中和低压液相色谱方法和装置；小规模分析；模拟移动床(SMB)和制备薄层或厚层色谱法，以及小规模薄层和快速色谱法的技术。
另一类分离方法包括反应混合物的处理，所述混合物具有被选择来结合至所需产物或使所需产物可分离的试剂、未反应的原料、反应副产物等。所述试剂包括吸附剂或吸收剂如活性炭、分子筛、离子交换介质等。可选地，在碱性材料情况下试剂可以是酸，在酸性材料情况下是碱，结合试剂如抗体、结合蛋白、选择性螯合剂如冠醚、液体/液体离子提取试剂(LIX)等。
合适的分离方法的选择取决于所涉及材料的性质。例如，在蒸馏和升华中的沸点和分子量，在色谱法中的存在或不存在极性官能团，在多相提取中的材料于酸性介质和碱性介质中的稳定性等。本领域技术人员将会应用最可能实现所要分离的技术。
通过本领域技术人员熟知的方法，诸如通过色谱法和/或分步结晶，可基于非对映异构体混合物的物理化学差异将它们分离成其单独的非对映异构体。对映异构体可如下分离：通过与适当的光学活性化合物(例如手性助剂，诸如手性醇或Mosher氏酰基氯)反应将对映异构体混合物转化成非对映异构体混合物，分离所述非对映异构体以及将单独的非对映异构体转化(例如水解)成对应的纯对映异构体。此外，本发明的某些化合物可以是阻转异构体(例如取代的联芳基)，并且被认为是本发明的一部分。也可使用手性HPLC柱来分离对映异构体。
可使用如使用光学活性的拆分剂形成非对映体的方法通过拆分外消旋混合物来获得单个立体异构体，例如基本上不含其立体异构体的对映体(Eliel,E.和Wilen,S."Stereochemistry of Organic Compounds,"John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994；Lochmuller,C.H.,J.Chromatogr.,(1975)113(3):283-302)。本发明的手性化合物的外消旋混合物可通过任何合适的方法分离和离析，所述方法包括：(1)用手性化合物形成离子性非对映异构体的盐并通过分步结晶或其它方法分离，(2)用手性衍生试剂形成非对映异构体化合物，分离非对映异构体并转化成纯的立体异构体，以及(3)在手性条件下直接分离实质上纯的或富集的立体异构体。参见："Drug Stereochemistry,Analytical Methods andPharmacology,"Irving W.Wainer编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York(1993)。
在方法(1)下，非对映异构体的盐可通过对映异构纯的手性碱(诸如马钱子碱、奎宁、麻黄碱、番木鳖碱、α-甲基-β-苯乙胺(安非他明)等)与带有酸性官能团(诸如羧酸和磺酸)的不对称化合物的反应形成。通过分步结晶或离子色谱法可诱导非对映异构体盐的分离。为了分离氨基化合物的光学异构体，添加手性羧酸或磺酸，如樟脑磺酸、酒石酸、扁桃酸或乳酸，可以导致形成非对映异构体盐。
可选地，通过方法(2)，使要拆分的底物与手性化合物的一种对映异构体反应以形成非对映体对(E.和Wilen,S."Stereochemistry ofOrganic Compounds",John Wiley&Sons,Inc.,1994,第322页)。通过使不对称化合物与对映异构体纯的手性衍生试剂(诸如薄荷基衍生物)反应，可形成非对映体化合物，随后分离所述非对映异构体并水解产生纯的或富集的对映异构体。确定光学纯度的方法包括制备在碱存在下的手性酯类，如薄荷酯，如(-)氯甲酸薄荷醇酯，或外消旋混合物的Mosher酯，乙酸α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯酯(Jacob III.J.Org.Chem.,(1982)47:4165)，并分析1H NMR谱中两个阻转异构的对映异构体或非对映异构体的存在。按照用于分离阻转异构的萘基-异喹啉的方法(WO 96/15111)，通过正相和反相色谱法，可使阻转异构体化合物的稳定非对映异构体分离和离析。通过方法(3)，可以使用手性固定相("Chiral Liquid Chromatography"(1989)W.J.Lough编辑，Chapman和Hall,New York；Okamoto,J.of Chromatogr.,(1990)513:375-378)色谱分离两种对映体的外消旋混合物。通过用于区分具有不对称碳原子的其它手性分子的方法，诸如旋光度和圆二色性，可区分富集或纯化的对映异构体。
药物组合物
本发明的药物组合物或制剂包括如本文描述的组合。
本文描述的化合物或其药学上可接受的盐可以非溶剂化形式和具有如水、乙醇等的药学上可接受的溶剂的溶剂化形式存在，并且本发明意图涵盖溶剂化形式和非溶剂化形式两者。
化合物或其药学上可接受的盐还可以不同的互变异构的形式存在，并且所有这些形式都包括在本发明的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指可通过低能量壁垒而互相转换的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子异变互变异构体)包括通过质子迁移的互变，如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。化合价互变异构体包括通过一些成键电子的重组的互变。
药物组合物包括散装组合物和单独剂量单位两者，其由多于一种(例如两种)的药学活性剂以及任何药学上无活性的赋形剂、稀释剂、载体或助流剂组成。散装组合物和各单独剂量单位可以含有固定量的上述药学活性剂。散装组合物是尚未形成单个剂量单位的物质。说明性剂量单位为口服剂量单位，如片剂、丸剂、胶囊等。类似地，本文所述的通过施用本发明的药物组合物来治疗患者的方法也意图包括所述散装组合物和单独剂量单位的施用。
药物组合物还包含同位素标记的化合物，其与本文所述的那些化合物相同，但事实上，一个或多个原子被置换为原子质量或质量数与通常见于自然界中的原子质量或质量数不同的原子。如所指定的任何特定原子或元素的所有同位素以及它们的用途均涵盖在本发明化合物的范围内。可并入化合物中的示例性同位素包括：氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯和碘的同位素，如2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、32P、33P、35S、18F、36Cl、123I、以及125I。本发明的某些同位素标记化合物(例如3H和14C标记的那些化合物)适用于化合物和/或底物组织分布测定中。氚化(3H)和碳-14(14C)同位素可用于其制备及可检测性的简化。此外，较重同位素如氘(即2H)的取代可提供由更大代谢稳定性所致的某些治疗优势(例如体内半衰期的延长或剂量要求的降低)且因而在某些情况下可为优选的。诸如15O、13N、11C和18F等正电子发射同位素可用于检查底物受体占有率的正电子发射断层摄影(PET)研究。
按照标准药物实践制备化合物的药学上可接受的盐，用于在包括人(如人类男性或人类女性)的哺乳动物中的过度增殖性病症(例如癌症，如三阴性乳腺癌)的治疗性治疗的治疗组合中。本发明提供药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的组合。
合适的载体、稀释剂及赋形剂对于本领域的技术人员是众所周知的，并且包括物质如碳水化合物、蜡类、水溶性和/或水溶胀性聚合物、亲水性或疏水性物质、明胶、油类、溶剂、水及其类似物。使用的特定载体、稀释剂或赋形剂将视应用于本发明的化合物的手段和目的而定。通常基于本领域的技术人员确认为可安全(GRAS)施用给哺乳动物的溶剂来选择溶剂。一般来说，安全的溶剂是无毒的水性溶剂，如水，和其它可溶于水或与水混溶的无毒溶剂。适合的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如PEG400、PEG300)等以及其混合物。所述制剂也可包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂、稀释剂和其它已知的提供药物(即本发明化合物或其药物组合物)的优美外观或辅助制造药物产品(即药剂)的添加剂。
所述制剂可以使用常规的溶解和混合工序来制备。例如，在一种或多种上述赋形剂存在下，将主体药物物质(即本发明的化合物或所述化合物的稳定形式(例如，具有环糊精衍生物或其它已知复合剂的复合物)溶解于适合溶剂中。本发明的化合物通常配制成医药剂型以提供可容易控制的药物剂量和使患者能够顺应处方方案。
用于施用的药物组合物(或制剂)可根据用于施用药物的方法以多种方式包装。一般来说，用于分配的制品包括药物制剂以适当形式在其内贮存的容器。合适的容器对于本领域技术人员是熟知的并且包括材料如瓶(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒及其类似物。容器还可包括防干扰装置以防止不慎触碰包装的内容物。另外，容器上设有描述所述容器的内容物的标签。标签还可包括适当的警告。
可制备化合物的药物制剂用于各种途径和类型的施用。例如，具有所需纯度的化合物或其药学上可接受的盐可以任选地以冻干制剂、研磨粉末或水溶液的形式混合药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences(1995)第18版，MackPubl.Co.,Easton,PA)。制剂可以通过在环境温度下以适当的pH，以及所需的纯度与生理学上可接受的载体(即在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的载体)混合而进行。制剂的pH主要取决于化合物的具体用途和浓度，但是其范围可在约3至约8之内。
药物制剂优选为无菌的。特别是，用于体内施用的制剂必须是无菌的。可以通过无菌滤膜过滤容易地实现这种杀菌。
药物制剂通常可以固体组合物、冻干制剂或作为水溶液形式被储存。
药物制剂将以符合良好医学规范的方式(例如量、浓度、时程、过程、媒介物和施用途径)给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用时程及医学从业者已知的其它因素。待施用的“治疗有效量”将通过这些考虑事项决定，并且是预防、改善或治疗疾病所需的最小量。此类量优选低于对宿主有毒或使宿主明显更容易出血的量。
可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者来说是无毒的，且包含缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。所述活性药物成分也可包封在例如通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)中、或粗乳液中。这种技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版，(1995)Mack Publ.Co.,Easton,PA中。
可制备持续释放制剂。制备持续释放制剂的合适实例包括含有化合物或其药学上可接受的盐的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3773919)、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚体、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚体如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚体和乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球)以及聚-D-(-)3-羟基丁酸。
药物制剂包括适用于本文所详述的施用途径的那些制剂。所述制剂可以方便地制成单位剂量形式且可以通过药学领域熟知的任何方法来制备。这种技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版，(1995)Mack Publishing Co.,Easton,PA中。这样的方法包括下列步骤：使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体缔合。一般来说，通过使活性成分与液体载体或细粉状固体载体或两者均一且密切地缔合，且接着必要时使产物成形来制备制剂。
适于口服施用的组合的制剂可以制成分立单元，如丸剂、硬或软的如明胶胶囊、扁囊剂、含片(troch)、糖锭剂、水性或油性混悬液、可分散的粉末或颗粒剂、乳剂、糖浆剂或酏剂，每种各含有预定量的GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐，和MEHD7945A。GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的量可配制为丸剂、胶囊、溶液或混悬液作为组合制剂。可选地，组合可以分别配制为丸剂、胶囊、溶液或混悬液用于交替施用。
可根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备制剂，并且这样的组合物可包含一种或多种试剂(包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂)以提供适口的制剂。压制片剂可以通过在合适的机器中压制任选地与黏合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式如粉末或颗粒形式的活性成分得以制备。模制片剂可通过将用惰性液体稀释剂湿润的粉末状活性成分的混合物在合适的机器中模制而得以制造。
片剂可以任选被包覆或刻痕且任选地被配制以提供活性成分从其中的缓慢或控制释放。药物制剂的片剂赋形剂可以包括：填充剂(或稀释剂)以增加构成片剂的粉末药物的总体积；崩解剂以促进片剂当其被摄取时分解成小碎片、理想地单个药物颗粒，并且促进药物的快速溶解和吸收；粘合剂以确保颗粒和片剂可以形成具有所需的机械强度并且使片剂在被压制后保持在一起，防止其在包装、运输和常规处理期间分解成其组分粉末；助流剂以改善粉末的流动性在生产过程中构成片剂；润滑剂以确保压片粉末不会粘附在制造过程中用于压制片剂的设备上。它们通过压片机来改善粉末混合物的流动并当成品片剂从设备射出时使摩擦和破裂最小化；抗粘剂的功能类似于助流剂，其降低构成片剂的粉末与在制造期间用于冲压片剂形状的机器之间的粘附；调味剂掺入到片剂中以给予其更令人愉快的味道或以掩盖令人不快的味道，而着色剂有助于识别和患者的顺应性。
含有与适用于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂是可接受的。这些赋形剂可以为例如惰性稀释剂，如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未经包衣或通过已知工艺进行包衣的，所述工艺包括微囊封以延缓胃肠道内的崩解和吸收并且由此在较长时间内提供持续作用。例如，可以单独使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯这样的延时材料或将其与蜡一起使用。
就眼或其它外部组织(例如口和皮肤)的治疗而言，制剂可以优选作为含有例如0.075至20％w/w的量的活性成分的局部软膏或霜剂应用。当配制成软膏时，活性成分可与石蜡或水混溶性软膏基剂一起使用。可选地，活性成分可与水包油霜剂基剂一起配制成霜剂。
需要时，霜剂基剂的水相可包括多元醇，即具有两个或两个以上羟基的醇，如丙二醇、1.3-丁二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、以及聚乙二醇(包括PEG 400)、及其混合物。局部制剂可理想地包括增强活性成分穿过皮肤或其它患病区域的吸收或渗透的化合物。此种透皮吸收增强剂的实例包括二甲亚砜及相关的类似物。
本发明的乳剂的油相可以已知方式由已知成分构成，包括至少一种乳化剂与脂肪或油的，或脂肪和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂可以与亲脂性乳化剂(充当稳定剂)一起被包含在内。同时，含有或不含稳定剂的乳化剂组成乳化蜡，且所述蜡连同油和脂肪一起组成形成乳膏制剂的油性分散相的乳化软膏基质。适合用于制剂中的乳化剂和乳化稳定剂包括60、80、十六醇硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、苯甲醇、十四烷醇、甘油单硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠。
药物制剂的水性混悬液含有与适于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性物质。此类赋形剂包括：助悬剂如羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶及阿拉伯树胶；以及分散剂或湿润剂，如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪族醇(例如十七烷乙烯氧基十六醇)的缩合产物、环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)。水性混悬液还可以含有一种或多种防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
所述药物组合物可以是无菌的可注射制剂的形式，例如无菌的可注射水性或油性混悬液。可根据已知技术，使用已在上文提及的那些适合的分散剂或润湿剂以及助悬剂来配制这种混悬液。无菌的可注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的溶液或混悬液，如在1,3-丁二醇中的或从冻干粉末制备的溶液。可接受的媒介物和溶剂中可以使用的是水，林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常可被用作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以使用包括合成单甘油酯或二甘油酯的任何温和不挥发性油。另外，脂肪酸(例如油酸)可类似地用于注射剂的制备。
可以与载体材料组合以生成单一剂型的活性成分的量将随所治疗的宿主和特定施用模式而改变。举例来说，意欲口服施用给人的定时释放制剂可含有与适当和适宜量的载体材料混配的约1至1000mg活性物质，所述载体材料的量可自总组合物的约5％至约95％(重量:重量)变化。药物组合物可被制造以提供可容易测量的施用量。例如，意图用于静脉内输注的水溶液可含有约3至500μg的活性成分/毫升溶液，以便可以约30mL/小时的速率来输注合适的体积。
适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包括助悬剂和增稠剂。
适于眼部局部施用的制剂还包括滴眼液，其中活性成分溶解或悬浮于合适的载体中，特别是用于活性成分的含水溶剂中。优选地活性成分在这些制剂中以约0.5至20％w/w，例如约0.5至10％w/w，例如约1.5％w/w的浓度存在。
适于在口中局部施用的制剂包括糖锭剂，其在调味的基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性成分；软锭剂(pastille)，其在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分；以及漱口剂，其在适合的液态载体中包含活性成分。
用于直肠施用的制剂可呈现为具有包括例如可可脂或水杨酸盐的适合基质的栓剂。
适于肺内或鼻施用的制剂具有例如在0.1至500微米的范围内(包括在0.1与500微米之间的范围内，以诸如0.5、1、30微米、35微米等的增量微米数的粒径)的粒径，其通过经由鼻孔快速吸入或通过经由口吸入来施用以便到达肺泡囊。合适的制剂包含活性成分的水性溶液或油性溶液。适于气雾剂或干粉施用的制剂可以按照常规方法来制备，并且可与其它治疗剂(例如在此以前用于治疗或预防如下所述病症的化合物)一起递送。
适于阴道施用的制剂可呈现为除活性成分之外也含有如本领域中已知为适当的载体的阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
制剂可被包装于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以储存于冷冻干燥(冻干)的条件下，仅需在使用前即刻添加无菌液态载体(例如水)以供注射。临时注射溶液和混悬液是由前述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备得到。优选单位剂量制剂为含有如本文以上所述的每日剂量或单位每日次剂量或其适当部分的活性成分的制剂。
本发明还提供兽医学组合物，其包含本文所述的组合和兽医学载体。兽医学载体为适用于达成施用组合物的目的的物质，且可为另外在兽医学领域中惰性或可接受的并且可与活性成分相容的固体、液体或气体物质。这些兽医学组合物可以非经肠施用、口服或通过任何其它预期途径施用。
组合治疗
所述组合可以与用于治疗过度增殖性疾病或病症(包括肿瘤、癌和肿瘤组织，以及前-恶性和非肿瘤或非恶性过度增殖性病症)的化疗剂组合使用。在某些实施方案中，组合与另一种化合物被组合在给药方案中作为组合治疗，所述化合物具有抗过度增殖的性质或可用于治疗过度增殖性病症。给药方案的另外的化合物优选具有对所述组合的互补活性，并使得它们不会彼此不利影响。这样的化合物可以对于预期目的有效的量施用。在一个实施方案中，通过给药方案施用所述治疗组合，其中化合物GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐的治疗有效量为在每天两次至每三周一次(q3wk)范围内施用，并且MEHD7945A的治疗有效量为在每天两次至每三周一次范围内施用。
组合治疗可以作为同时或依次方案施用。当依次施用时，可在两次或更多次施用中施用所述组合。组合施用包括使用分立制剂的共同施用，和以任一顺序连续施用，其中优选存在使两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物活性的时间段。
在本发明的一个具体方面中，在开始施用MEHD7945A后可以施用GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐约1至约10天的时间段。在本发明的另一个具体方面中，在开始施用MEHD7945A前可以施用GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐约1至约10天的时间段。在本发明的另一个具体方面中，GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐的化合物的施用和MEHD7945A的施用在同一天开始。
在本发明的一个具体方面中，在GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐开始施用后可以施用MEHD7945A约1至约10天的时间段。在本发明的另一个具体方面中，在GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐开始施用前可以施用MEHD7945A约1至约10天的时间段。在本发明的另一个具体方面中，MEHD7945A的施用和GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐的施用在同一天开始。
任何上述共施用的药剂的合适剂量是目前使用的那些，并且可以由于最近鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗例如增加治疗指数或减轻毒性或其他副作用或后果的组合作用(协同作用)而降低。
在抗癌治疗的特定实施方案中，治疗组合可与外科治疗和放射疗法结合。选择组合的量和相对施用时机，以达到所需的组合治疗效果。
药物组合物的施用
化合物可通过待治疗病状的任何适当途径来施用。适当的途径包括口服、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、动脉内、吸入、真皮内、鞘内、硬膜外和输注技术)、透皮、直肠、鼻部、局部(包括口腔和舌下)、阴道、腹膜内、肺内和鼻内。局部施用也包括使用透皮施用，如透皮贴片或离子透入装置。
药物的配制描述于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版，(1995)Mack Publishing Co.,Easton,PA中。药物制剂的其它实例可以在Liberman,H.A.和Lachman,L.编辑，Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,Vol 3，第2版，New York,NY中找到。对于局部免疫抑制治疗，可以通过病灶内施用来施用化合物，包括灌注或以其他方式使移植物在移植前接触抑制剂。应理解，优选的途径可以根据例如接受者的状况而改变。在口服施用化合物时，其可以与药学上可接受的载体、助流剂或赋形剂配制成丸剂、胶囊、片剂等。在经胃肠外施用化合物时，其可以与药学上可接受的肠胃外媒介物或稀释剂配制，并且如以下详述的以单位剂量可注射的形式配制。
治疗人类患者的式I或式II的化合物或其药学上可接受的盐的剂量可以在每天约20mg至约1600mg的范围内。典型的剂量可以为约50mg至约800mg的化合物。剂量可以每天一次(QD)、每天两次(BID)或更频繁地施用，取决于药代动力学(PK)和药效动力学(PD)特性，包括特定化合物的吸收、分布、代谢和排泄。另外，毒性因素可能影响剂量和施用给药方案。当口服施用时，丸剂、胶囊或片剂可以每天两次、每天一次或更低的频率(如每周一次或每两周或三周一次)摄入，持续指定的时间段。所述方案可重复多个治疗周期。
治疗人类患者的抗体(如MEHD7945A)的剂量，可在约0.05mg/kg至约30mg/kg范围内。因此，可对患者施用为约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg.kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg或30mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以每天或间断地例如每周、每两周或每三周施用。
治疗方法
治疗组合可用于治疗哺乳动物的疾病、病状和/或病症，包括(但不限于)由AKT激酶调节的那些。根据本发明的方法可被治疗的癌症包括但不限于，间皮瘤、子宫内膜癌、神经胶质瘤、胰腺癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、胃癌、结肠癌和头颈癌。
本发明的组合可以提供针对某些癌症表型的改善效果。例如，本发明的某些组合可以提供针对与PTEN突变(或者低或无效状态)、AKT突变(或高pAKT表达或扩增水平)、PI3K突变，或者上述的组合相关联的癌症的改善效果。
因此，本文所述的某些组合针对这些类型的癌症可特别有用。
在一个实施方案中，本文所述的组合可用于治疗三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌是特征为ER-/PR-/HER2-的癌症。三阴性乳腺癌大约占所有乳癌的10-20％，并且往往影响青年女性。三阴性乳腺癌本质上具有强侵袭性，并且治疗选择是有限的。
可以通过本领域已知的任何合适的方法测量PTEN的无效(或低)状态。在一个实例中，使用IHC。可选地，可以使用蛋白质印迹分析。PTEN的抗体是市售可得的(Cell Signaling Technology,Beverly,MA,Cascade Biosciences,Winchester,MA)。用于IHC的示例性程序和用于PTEN状态的Western印迹分析在Neshat,M.S.等Enhanced sensitivityof PTEN-deficient tumors to inhibition of FRAP/mTOR,Proc.NatlAcad.Sci.USA 98,10314–10319(2001)和Perren,A.等Immunohistochemical Evidence of Loss of PTEN Expression inPrimary Ductal Adenocarcinomas of the Breast,American Journal ofPathology,Vol.155,No.4，1999年10月中有所描述。另外，可以使用本领域已知的技术识别与AKT突变或PI3K突变相关联的癌症。
与未活化或未磷酸化的AKT的水平相比，可通过本领域已知的方法测量给定样品中的AKT(“pAKT”)的活化或磷酸化水平。pAKT状态可以比率(例如在肿瘤细胞中的pAKT的量除以在相同类型的非肿瘤细胞中的pAKT的量)或减法(例如在肿瘤细胞中的pAKT的量减去在该细胞中或在相同类型的非肿瘤细胞中的pAKT的量)表示。通过测量AKT的磷酸化下游靶标(例如，pGSK或PRAS40)的量，pAKT曲线也可以所述途径的活化水平表示。高pAKT是指高于基线值的样品中总AKT的活化或磷酸化水平。在一个实例中，基线值为用于给定细胞类型的pAKT的基础水平。在另一实例中，基线值是在给定样品细胞(例如非-癌或细胞)群中的pAKT的平均值或平均水平。在另一实例中，当与来自相同哺乳动物或患者群体的相同类型的正常、健康的细胞(例如，非肿瘤)的平均值相比时，高pAKT是指过表达或过扩增在细胞中的磷酸化或活化AKT的肿瘤细胞。还可以结合其它标记物使用pAKT曲线，例如FOXO3a定位曲线，用于预测某些PI3k/AKT激酶途径抑制剂的功效。用于测试是否存在PI3k、KRAS和AKT突变的试剂盒是市售可得的(Qiagen)。
在一个具体方面中，本发明提供用于治疗患有癌症的患者的方法，所述癌症与PTEN突变或表达的损失、AKT突变或扩增，PI3K突变或扩增，或其组合相关联，所述方法包括对患者施用本发明的组合。在另一方面中，本发明提供用于识别患有可以用本发明的组合治疗的癌症的患者的方法，所述方法包括确定所述患者的癌症是否与PTEN突变或表达丢失、AKT突变或扩增，PI3K突变或扩增，或它们的组合相关联，其中患者的癌症与PTEN突变或表达的损失、AKT突变或扩增、PI3K突变或扩增或其组合的关联指示可用本发明的组合治疗的癌症。在另一方面中，本发明提供还包括治疗用本发明的组合如此识别的患者的方法。在一个实施方案中，癌症是卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、结肠癌或非小细胞肺癌。
制品
在本发明的另一实施方案中，提供制品或“试剂盒”，其包含可用于上述疾病和病症的治疗的组合。在一个实施方案中，试剂盒包括容器和本文所述的组合。
试剂盒还可以包括位于该容器上或与所述容器相关联的标签或包装插页。术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装内的用法说明，其含有关于以下的信息：适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于使用这些治疗性产品的警告。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可以由各种材料例如玻璃或塑料形成。容器可以容纳对治疗病状有效的组合或其制剂并且可具有无菌入口(例如，容器可为具有可经皮下注射针刺破的塞子的静脉内输液袋或小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗所选病状，例如癌症。在一个实施方案中，标签或包装插页指示包含组合的组合物可用于治疗由异常细胞生长引起的病症。标签或包装插页还可以指示组合物可以用于治疗其它病症。可选地，或另外地，制品还可包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其还可包括自商业及使用者观点看来合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头及注射器。
试剂盒还可以包括组合以及如果存在的话，第二药物制剂的施用说明。例如，如果试剂盒包括包含GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐的第一组合物和包含MEHD7945A的第二药物制剂，则试剂盒还可以包括向有相应需要的患者同时、依次或分别施用第一药物组合物和第二药物组合物的说明书。
在另一个实施方案中，试剂盒适合于组合的固体口服形式的递送，例如片剂或胶囊。这样的试剂盒优选地包括多个单位剂量。这些试剂盒可包括具有以其预期使用的次序导向的剂量的卡片。这种试剂盒的一个实例是“泡罩包装”。泡罩包装是包装工业中熟知并且广泛用于包装药物的单位剂量形式。如果需要的话，记忆辅助物可例如以数字、字母、或其它标记的形式提供，或设置有日历插入物，指明治疗方案中剂量可被施用的天数。
根据一个实施方案，试剂盒可以包括(a)含有GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐在其中的第一容器；(b)含有MEHD7945A的第二个容器；以及(c)含有第三药物制剂在其中的第三容器，其中所述第三药物制剂包含具有抗过度增殖活性的另一种化合物。可选地，或另外地，试剂盒可包括包含药学上可接受的缓冲液的另一容器，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其还可包括自商业及使用者观点看来合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头及注射器。
在试剂盒包括GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合物的情况下，所述试剂盒可以包括用于容纳单独组合物的容器(例如分开的瓶子或分开的箔包)，但是，单独组合物也可以被包含在单个未分开的容器内。通常，所述试剂盒包含单独成分的施用说明。当所述单独成分优选以不同的剂型(例如，口服和肠胃外)施用时，以不同的剂量间隔施用时，或者当处方医师希望所述组合的单独成分的效价时，所述试剂盒形式特别有利。
发明的具体方面
在本发明的一个具体方面中，过度增殖性病症是癌症。
在本发明的一个具体方面中癌症与PI3K/AKT途径的超活化相关联。
在本发明的一个具体方面中，癌症与PTEN突变相关联。
在本发明的一个具体方面中，癌症与AKT突变、过表达或扩增相关联。
在本发明的一个具体方面中，癌症与PI3K突变相关联。
在本发明的一个具体方面中，癌症与PTEN、AKT和/或PI3K突变的组合相关联。在一个实例中，癌症是卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、头颈癌、结肠或非小细胞肺癌。
在本发明的一个具体方面中，癌症选自间皮瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌(例如阉割抗性前列腺癌)、黑素瘤、胃癌、结肠癌、肾癌、头颈癌，以及神经胶质瘤。
实施例
为了阐述本发明，包括以下实施例。但是，应理解的是，这些实施例不限制本发明并且仅仅意图提出实践本发明的方法。
实施例1 PI3K/AKT和HER3/EGFR的组合阻断增强在三阴性乳腺癌中的抗肿瘤活性
高达60％的三阴性乳腺癌(TNBC)表达高水平的EGFR。此外，TNBC与磷酸酶和张力同源物(PTEN)功能丧失的增加频率相关联，导致磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途径的超活化。这提供在此患者亚组中使用PI3K/AKT抑制剂的理论基础。然而，受体酪氨酸激酶(RTK)(如HER3)的补偿表达可限制PI3K/AKT抑制剂的功效。评估与在TNBC中的单一药剂相比，EGFR和PI3K/AKT与HER3和PI3K/AKT途径的组合靶向是否导致优异的抗肿瘤活性。
用靶向EGFR和HER3两者的双重作用抗体MEHD7945A、AKT抑制剂GDC-0068，和pan-PI3K抑制剂GDC-0941来处理数个TNBC细胞系。通过CellTiter-Glo和Crystal Violet测量细胞活力。用MEHD7945A、GDC-0068、GDC-0941，或MEHD7945A与GDC-0068或GDC-0941的组合来处理细胞系来源的和患者来源的TNBC异种移植物模型两者。检查肿瘤尺寸和组织学。通过蛋白质印迹法、质谱、CEER和免疫组织化学测量蛋白表达。
GDC-0068和GDC-0941的治疗导致细胞活力的可变抑制，其中IC50在所有TNBC细胞系中处于170nM至>1μM范围内。在用EGF或Heregulin刺激的细胞中，MEHD7945A阻止HER3/EGFR受体磷酸化，并且改善PI3K抑制剂的抗增殖活性。
为了测试这些化合物在体内的活性，使用三种不同的TNBC模型：基于两个细胞系(MDA-MB-468和HCC70)和患者来源的异种移植物。MEHD7945A、GDC-0941或GDC-0068的施用显示可变的肿瘤生长的延迟，而MEHD7945A与GDC-0068或GDC-0941的组合优于单一试剂治疗。两种组合都阻止肿瘤生长或导致肿瘤缩小，其中每一队列中1/2的小鼠实现完全应答。值得注意的是，所有的治疗(高达9周的治疗性暴露)具有良好耐受性。经治疗的肿瘤的分析表明PI3K/AKT途径的有效抑制作用，同时磷酸-PRAS40和磷酸-S6的水平降低。此外，MEHD7945A有效阻止作为PI3K抑制的结果的EGFR和HER3的磷酸化作用。
本文提供了HER3在限制PI3K/Akt抑制剂和抗EGFR剂两者的抗肿瘤活性中起作用的证据。通过MEHD7945A同时靶向EGFR和HER3则提高了EGFR-阳性TNBC的临床前模型中的PI3K/Akt抑制的功效。此外，在抗EGFR治疗时，HER3表达似乎在TNBC患者中被诱导，具有较低的实现肿瘤消退的概率。EGFR、HER3和PI3K/Akt途径的同时抑制有可能极大地扩大可以得益于靶向治疗的TNBC患者的百分比。
由此，在TNBC临床前模型中，用MEHD7945A和GDC-0068或GDC-0941的组合治疗优于单一疗法。
结果
EGFR和HER3与PI3K/Akt抑制的组合的阻断导致优异的抗肿瘤活性
用GDC-0068、GDC-0941、MEHD7945A以及所述抑制剂的组合处理HCC70和MDA-MB-468TNBC细胞系，所述细胞系的特征为EGFR水平的升高和PTEN表达的丧失。用GDC-0068或GDC-0941的治疗导致HER3的表达增加，以及在HCC70细胞中，导致EGFR和HER3的活化(图1A)。MEHD7945A的添加阻止EGFR和HER3磷酸化的诱导并增强PI3K和ERK下游途径在两种细胞系中的抑制(图1A)。值得注意的是，GDC-0068与Akt的ATP-结合位点竞争，并且可导致这种酶在其两个调控位点(Thr308和Ser473处的过度磷酸化(Okuzumi等,Nat Chem Biol 5,484(2009))。
在HCC70和MDA-MB-468细胞中测试MEHD7945A与GDC-0068或GDC-0941的组合是否导致增强的抗增殖活性。在处理5天的细胞中，观察到对单一试剂GDC-0068、GDC-0941和MEHD7945A的可变的敏感性。然而，与单一试剂相比，抗PI3K/Akt药剂和MEHD7945A的组合导致细胞增殖/活力的优异抑制(图1B)。
为了扩展这些体内发现，在MDA-MB-468来源和HCC70来源的异种移植物中测试MEHD7945A与Akt或PI3K抑制剂的组合的功效。虽然肿瘤仅适度地应答单一试剂GDC-0068、GDC-0941和MEHD7945A，但与单一疗法相比，GDC-0068或GDC-0941和MEHD7945A的组合产生了显著优异的肿瘤生长抑制(p小于0.01，P-值是用双侧学生t-检验计算的)。此外，组合队列中的19只小鼠中的9只实现完全的肿瘤缩小，并且停止治疗后90天未观察到复发。
研究在实验结束时(第39天)收集的HCC70肿瘤中的EGFR和HER3的表达/活化水平。通过免疫组织化学(IHC)获得可靠的磷酸-HER3(pHER3)检测的技术挑战，与从由组合方案处理的肿瘤可得的组织的相对较低的量，促进了使用备选方法的HER3表达和磷酸化作用的测量。通过合作、增强的酶免疫反应性(CEER)分析冷冻组织，CEER是利用纳克数量的蛋白的反相检测的平台。Akt或PI3K抑制导致EGFR和HER3表达和磷酸化的总体增加(p小于0.05，P-值是用双侧斯氏t-检验计算)。尽管不希望限制于这种解释，但是GDC-0068后EGFR磷酸化的升高很可能是增加的EGFR/HER3的异源二聚化的结果，因为没有观察到总受体水平的变化。MEHD7945A至GDC-0068或GDC-0941的添加降低了由PI3K/Akt诱导的受体磷酸化作用。
然后测试TNBC的患者来源的异种移植物(PDX)中的相同治疗的活性。通过IHC表征这些肿瘤，其发现不可检测的PTEN水平，高的EGFR水平和～70％的Ki67染色。这些特征预测特别侵袭性的表型，这通过未处理的肿瘤异种移植物的快速生长得以确认(图1C，对照臂)。两种单一试剂GDC-0941和MEHD7945A都延缓肿瘤生长。在组合中，它们引起持久的肿瘤停滞(图1C)。与基于细胞的异种移植物一致，HER3和EGFR的活化水平和总水平在PI3K/Akt抑制后增加并且MEHD7945A阻止受体磷酸化(图1D)。有趣的是，与GDC-0941相比，GDC-0068单一疗法显示出优异的抗肿瘤活性。这种效果可能是由于它在这种模型中诱导EGFR和HER3磷酸化的能力较低(图1D)。尽管如此，通过加入MEHD7945A来进一步增强其功效。
使用在来自实验终点收集的异种移植物的试样中的Ki67指数测量肿瘤细胞增殖。Ki67-阳性细胞的百分比只在组合队列中明显较低。通过测量小鼠中的Ki67-阳性循环肿瘤细胞(CTC)的数量进一步证实这些结果，所述小鼠携带>1cm3体积的确定的患者来源肿瘤并且用GDC-0941、MEHD7945A或两种试剂的组合治疗6天。在整个实验过程中治疗是良好耐受的，并且在经历了完全肿瘤消退的小鼠中没有检测到肿瘤复发。总的来说，这些数据表明，靶向EGFR和HER3两者增强了PI3K/Akt抑制剂的抗肿瘤作用。
HER3抑制对于由PI3K/Akt抑制介导的最佳抗肿瘤活性是所需的
为了仔细分析HER3抑制在这些模型中的作用，测定西妥昔单抗(专门靶向EGFR的抗体)，与和GDC-0068或GDC-0941组合的MEHD7945A在HCC70细胞中的活性。两种抗体都增强了用表皮生长因子(EGF)刺激的细胞中由PI3K/Akt抑制介导的抗增殖活性。然而，在GDC-0068和GDC-0941在用heregulin(HRG)刺激的细胞中的抗增殖活性合作方面MEHD7945A优于西妥昔单抗(图2A)。
测定了与GDC-0941组合的西妥昔单抗和MEHD7945A在HCC70来源的异种移植物中的抗肿瘤活性。虽然与单一试剂治疗相比，西妥昔单抗和GDC-0941的组合未造成任何进一步的肿瘤生长的抑制，但EGFR、HER3和PI3K的伴随靶向导致肿瘤缩小(图2B)，其中9例中4例的异种移植物完全消退。生物化学上，MEHD7945A和西妥昔单抗都阻断这些异种移植物中的EGFR磷酸化；但是，仅MEHD7945A降低HER3活化(图2C)。这些结果证实HER3在限制这种设置中的PI3K抑制的功效中起重要作用。
EGFR下调和HER3上调与TNBC患者中对抗EGFR治疗的较低应答有关
为了研究EGFR和HER3的变化是否能够影响对临床上靶向治疗的应答，测量了从纳入两个先导性新辅助治疗临床试验中的TNBC患者得到的样品中的这些受体的表达，所述试验是测试与标准化疗组合的抗EGFR抗体帕尼单抗(40例患者)和西妥昔单抗(30例)的抗肿瘤活性。
在纳入组合帕尼单抗与4种标准细胞毒性剂的研究中的40位患者之中，19位(47.5％)实现病理学完全应答(pCR)(24周)且21位(52.5％)在手术时显示残余疾病。与只用基于细胞毒素的新辅助化疗(C.Liedtke等,Journal of clinical oncology:official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology 26,1275(2008))治疗的TNBC患者相比，pCR的这种两倍增加强调了在所述设置中添加抗EGFR治疗的益处。在所有的治疗前试样中和在手术时切除的21个残余侵袭性肿瘤中进行EGFR和HER3表达的IHC评估。治疗前EGFR组织分数大于70的患者组表现出58％(26中的15)的pCR率，而治疗前EGFR组织分数≤70的那些患者中，完全肿瘤消退限于28％(14中的4)(图3A)。然而，这种趋势没有达到统计学显著性(p＝0.08)，可能是反映了被分析患者的数量较少。
将来自未经历pCR患者的残余(治疗后)肿瘤的EGFR水平与它们的治疗前的对应物相比。与成对基线试样相比，21位非-pCR患者中的9位的残余肿瘤中的EGFR水平都降低(图3B和C，p＝0.07)。
测量了来自没有经历对于它们的治疗前对应物的pCR的患者的残余(治疗后)肿瘤中的HER3水平。可用于13位无应答患者的HER3免疫染色显示，与成对治疗前的样品相比，在13位非-pCR患者中的7位中的残余病变中的HER3表达较高(图4A和B，p等于0.010)。
纳入测试与多西他赛组合的西妥昔单抗的抗肿瘤活性的研究中的30位患者，9位经历pCR。与成对基线试样相比，19位非-pCR患者中的11位的残余肿瘤中的HER3表达被发现上调了(p＝0.103)。
这些结果表明1)高EGFR表达可能对于抗EGFR治疗性抗体的最佳响应是所需的，和2)在抗EGFR治疗后，不经历完全肿瘤消退的患者中的HER3表达增加。同样地，这些发现提供用于治疗性治疗的生物标记。例如，患者选择可基于高水平EGFR表达与“治疗中”的活组织检查以评估在治疗时的途径抑制和可能的RTK上调这两者。患有TNBC的患者可以被筛选用于EGFR表达，并且可以选择那些具有相对升高的EGFR表达的患者用于本文所述的治疗。也可以确定在接受治疗的患者中的HER3表达以将具有相对较高的HER3表达的那些患者识别为因缺乏完全肿瘤消退的升高的风险。
材料和方法
研究设计
本研究的目的是测试TNBC临床前模型中的EGFR、HER3和PI3K/Akt途径的伴随抑制的活性。此外，评估EGFR和HER3两者的表达是否影响TNBC患者对于抗EGFR治疗的临床反应。
计算动物组的尺寸以便测量安慰剂组和25％治疗组之间的平均差值，幂为80％，p值为0.01。携带异种移植物的宿主小鼠随机并均匀分配于对照组或治疗组。以可控和非盲方法进行动物实验。以盲法方式定量患者样品中的pS6(240-4)。体外实验至少进行两次，并且对于每个复制至少进行一式三份。
细胞系和化合物
MDA-MB-468和HCC70购自ATCC，并在潮湿气氛和5％CO2中在37℃保持在杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(DMEM)(分别Ham'sF-12 1:1和RPMI 1640，含有10％胎牛血清(FCS)、2mmol/L l-谷氨酰胺、20单位/ml青霉素和20μg/ml链霉素)中。pan-PI3K抑制剂、GDC-0941得自SU2C/PI3K Dream Team mouse pharmacy。Akt抑制剂、GDC-0068和双重EGFR-HER3抑制剂MEHD7945A由Genentech慷慨提供。将所有化合物溶解在二甲基亚砜(DMSO)中用于体外实验。
细胞活力和增殖
对于增殖，将5×105个细胞接种在96孔板中并用所示浓度的GDC-0068、GDC-0941和/或MEHD7945A处理。5天后，固定细胞并用结晶紫(Crystal Violet)染色。还使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)如生产商所述地分析细胞增殖。对于heregulin(HRG，Peprotech)和表皮生长因子(EGF，Peprotech)诱导的增殖，5×105个细胞在存在4ng/ml配体的情况下用GDC-0068、GDC-0941，和/或MEHD7945A处理5天，然后用结晶紫染色。
蛋白质印迹
用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并且用补充有磷酸酶抑制剂混合物将细胞刮到冰冷的RIPA裂解缓冲液(Cell Signaling)中(Complete Mini，和PhosphoStop(Roche))。通过在4℃下以13,000rpm离心10分钟使裂解液澄清，除去上清液，用Pierce BCA蛋白分析试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白浓度。三十五微克的总裂解液在NuPAGE 4-12％的Bis-Tris凝胶(Life Technologies)上解析并电泳转移至Immobilon转移膜上(Millipore)。膜用5％脱脂奶粉在TBS-Tween中封闭1小时，然后在5％牛血清白蛋白(BSA)TBS-Tween中使用于下列一抗杂交：磷酸-Akt(Ser473)、磷酸-Akt(Thr308)、Akt、磷酸-S6(Ser(240/4)、磷酸-S6(Ser235/6)、S6、磷酸-PRAS40(Thr246)、PRAS40、磷酸-Erk(Thr202/Tyr204)、Erk、磷酸-EGFR(Tyr1068)、EGFR、磷酸-HER3(Tyr1289)，HER3(1:500-1:1000，细胞信号传导)。β-肌动蛋白用作装载对照(1：5000，Sigma)，也包含于5％的BSA TBS-Tween中。小鼠和兔辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二抗(1:50,000，Amersham Biosciences)稀释在含2％脱脂奶粉的TBS-Tween中。用SuperSignal West FemtoChemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)检测蛋白质-抗体复合物，并且用G-BOX相机系统捕获图像。
建立肿瘤异种移植物和体内治疗
通过机构动物管理和使用委员会(IACUC)批准的动物协议按照研究指导手册进行所有小鼠研究。6周龄雌性无胸腺裸鼠购自CharlesRiver实验室，并圈养在空气过滤的层流机柜中采用12小时光照周期以及自由进食和饮水。
对于细胞系来源的异种移植物研究，将小鼠皮下注射1×107以4:1的比率悬浮于150μL培养基/Matrigel(BD Biosciences)中的HCC70或MDA-MB-468。如所述在小鼠饮用水中补充1μmol/L的17β-雌二醇(Garcia-Garcia等,Clinical cancer research:an official journal of theAmerican Association for Cancer Research 18,2603(2012))。
对于患者来源的异种移植物(PDX)研究，将肿瘤皮下植入至6周龄的雌性无胸腺裸鼠中。在异种移植物生长后，将肿瘤组织再移植到受体小鼠中，所述小鼠在植入物生长后被随机化。对于循环肿瘤细胞(CTC)的收集，将肿瘤植入无胸腺裸鼠的乳房衬垫中。
一旦肿瘤达到约150-250mm3的平均体积，将小鼠随机分入治疗组，n＝7-11个肿瘤/组。将GDC-0068[40mg/kg]或GDC-0941[75mg/kg]溶解于0.5％甲基纤维素和0.2％Tween-80(MCT)溶液中并通过口服管饲法每日施用一次。将MEHD7945A[10mg/kg]和西妥昔单抗[10mg/kg]在PBS中稀释并每周两次腹膜内注射。在整个治疗周期用数字测径器测量肿瘤。使用公式确定肿瘤体积：(长×宽2)×(π/6)。绘制肿瘤体积为平均±SEM。
协同、增强、酶免疫反应性(CEER)测定
通过CEER测定途径蛋白质表达的水平及其在异种移植中的活化。(Kim等,ASCO Annual Meeting abstract P2-06-13,(2010))CEER利用印刷在硝化纤维微阵列表面上的捕获抗体、细胞裂解物中与载片反应的靶分子、和两个独立的检测器-抗体之间的独特免疫复合物的形成。将检测器-抗体中的一个与葡萄糖氧化酶缀合，并且将另一个与辣根过氧化酶缀合。靶检测(表示为计算单位，CU)需要检测器-抗体两者的存在，并且葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶之间的酶穿隧事件将不会发生，除非两个抗体靠得很近。
循环肿瘤细胞(CTC)
如前文所述，在鲱骨式芯片上捕获、固定和透化循环肿瘤细胞(CTC)(Stott等,Proceedings of the National Academy of Sciences 107,18392(2010))。为了捕获，用抗EpCAM(R&D系统)和抗EGFR(西妥昔单抗，Eli Lilly)抗体涂覆鲱骨式芯片。用抗广谱细胞角蛋白(Abcam)、CD45(Santa Cruz Biotechnology)和Ki67(Life Technologies)的一抗以及与Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 555，和Alexa Fluor 488(全部来自Life Technologies)缀合的二抗来孵育含有CTC的芯片。用DAPI对细胞核染色。使用自动荧光显微镜检查扫描系统(BioView)鉴定Ki67-阳性CTC(CK+/CD45-/Ki67+)，Ki67-阴性CTC(CK+/CD45-/Ki67-)和污染的白细胞(CD45+)。
免疫组织化学(IHC)
异种移植物：将解剖的组织在取出后立即固定在室温(RT)下的10％缓冲的福尔马林溶液中最多24h，然后在真空条件下脱水和石蜡包埋。样品用正常山羊血清封闭，并用Ki67((Life Technologies)、EGFR(Cell Signaling)和PTEN(Cell Signaling)抗体孵育。通过Boost IHC检测试剂(Cell Signaling 8114)，以及作为底物的DAB(Dako)来显示抗原-抗体反应。
患者样品：将肿瘤组织固定在10％缓冲的福尔马林中48小时，且进一步包埋在石蜡中。将四微米切片在二甲苯中脱蜡并且在分级醇中水合。对于EGFR检测，通过蛋白酶处理(8分钟，37℃)修复抗原，并且在37℃用预稀释的即用型小鼠单克隆抗EGFR(克隆3C6,Ventana,Tucson,AZ)进一步孵育所述切片1小时。通过Benchmark XT自动IHC染色器(均来自Ventana)中的UltraView DAB显示系统来目测抗原-抗体反应。对于HER3，通过在PT-Link设备(Dako)中的Target Retrieval Solution High pH(Dako)中，在97℃下加热所述切片20分钟来进行抗原修复。然后用以1:50稀释的小鼠单克隆抗-HER3(克隆DAK-H3-IC,Dako,Glostrup,Denmak)将组织在37℃孵育2小时。使用Dako Autostainer Plus自动化仪中的FlexDAB系统来显示抗原-抗体反应。对于每个患者，治疗前和治疗后的肿瘤样品一起进行。由不知道患者信息的专业病理学者解释IHC染色。使用具有0、0.5、1、1.5、2、2.5和3的任意标度作为递增染色强度的量度来定量EGFR和HER3两者的表达。EGFR和HER3组织分数被定义为通过将染色强度与染色细胞百分比相乘而获得的积之和。
患者样品
对于PDX建立，在机构审查委员会批准和患者知情同意的情况下从马萨诸塞总医院获得新鲜组织。由马萨诸塞总医院临床实验室和病理学部门确定三阴性状态。
用于EGFR和HER3表达的IHC分析的FFPE试样获自参与两个法国多中心先导性II期新辅助治疗试验的机构，所述试验在TNBCII-IIIA期患者中测试与化学疗法组合的抗EGFR抗体的功效。一个试验方案由8个周期组成，每3周施用一次。前4个周期包含与各500mg/m2的5-氟尿嘧啶和环磷酰胺加上100mg/m2表阿霉素组合的9mg/kg帕尼单抗。后4个周期具有与100mg/m2多西他赛而非前文提及的3种细胞毒素一起的帕尼单抗。另一试验方案包含每周一次的西妥昔单抗(第一剂量为400mg/m2，而所有随后的剂量为250mg/m2)，其结合每3周给予一次的100mg/m2多西他赛，总共6个周期。在治疗结束时所有患者进行手术。病理学完全应答(pCR)为主要终点，其中临床反应和毒性作为次要终点。对于在帕尼单抗试验中的病理应答评估和生物标记研究，40位患者已经合格，而西妥昔单抗试验以30位合格患者结束。在新辅助治疗之前和结束时系统地收集肿瘤组织样品，并且所述收集在进行分子和病理分析的Jean PerrinComprehensive癌症中心集中。使用Chevallier’s(Chevallier等,American Journal of Clinical Oncology 16,223(1993))和Sataloff’s(Sataloff等,Journal of the American College of Surgeons 180,297(1995))的分类来评估pCR。
统计分析
使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行双向t检验。误差条代表SEM。*p<0.05，**p<0.01。所有的体外实验至少重复3次。对于每个治疗组，所有体内实验至少进行n＝7。
本文引用的所有文献通过参考并入。虽然描述了发明的特定实施方案，并且已经为举例说明列出许多细节，某些细节可以变化而不脱离本发明的基本原理。由于许多修改和变化对于本领域的技术人员来说将是显而易见，所以不希望将本发明限制于如本文所述的确切结构和方法。因此，所有适当的修改和等同物可以被认为落入由所附权利要求书所限定的范围内。

Claims (23)

1.一种GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合，其用于过度增殖性病症的治疗性治疗。
2.如权利要求1所述的组合，其中所述过度增殖性病症是癌症。
3.如权利要求2所述的组合，其中所述癌症与PTEN突变相关联。
4.如权利要求2所述的组合，其中所述癌症与AKT突变、过表达或扩增相关联。
5.如权利要求2所述的组合，其中所述癌症与PI3K突变相关联。
6.如权利要求2-5中任一项所述的组合，其中癌症选自间皮瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、胃癌、结肠癌、肾癌、头颈癌，以及神经胶质瘤。
7.如权利要求6所述的组合，其中所述癌症是乳腺癌。
8.如权利要求7所述的组合，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合，其中GDC-0068或其药学上可接受的盐与MEHD7945A组合施用。
10.如权利要求1-8中任一项所述的组合，其中GDC-0941或其药学上可接受的盐与MEHD7945A组合施用。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合，其中GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐与MEHD7945A同时施用。
12.如权利要求1-10中任一项所述的组合，其中GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐与MEHD7945A依次施用。
13.一种GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合，其用于改善患有过度增殖性病症的患者的生活质量的治疗用途。
14.所述GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合，其用于治疗过度增殖性病症。
15.所述GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合，其用于治疗由AKT激酶调节的疾病或病状。
16.GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合在制备用于治疗哺乳动物的过度增殖性病症的药物中的用途。
17.GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合在制备用于治疗哺乳动物的由AKT激酶调节的疾病或病状的药物中的用途。
18.一种包含GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐、MEHD7945A、容器和包装插页或标签的试剂盒，所述包装插页或标签指示GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A用于治疗过度增殖性病症的施用。
19.一种包含GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的产品，其作为组合制剂在过度增殖性病症的治疗中单独、同时或依次使用。
20.一种用于治疗哺乳动物的过度增殖性病症的方法，其包括向所述哺乳动物施用GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合。
21.一种用于治疗哺乳动物的由AKT激酶调节的疾病或病状的方法，其包括向所述哺乳动物施用GDC-0068或GDC-0941或其药学上可接受的盐和MEHD7945A的组合。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述哺乳动物是患有三阴性乳腺癌(TNBC)的人类，其由于具有升高的EGFR表达的TNBC而被选择进行治疗。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中在所述治疗后测量HER3的表达，其中相对升高的HER3表达指示因缺乏完全肿瘤消退的升高的风险。
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