CN104964908A - 细胞图像的归类方法 - Google Patents

Abstract

本发明中所描述的方法被用于分析循环肿瘤细胞(CTC)的图像。从多种平台获取图像，包括多参数流式细胞计量术、CellSpotter荧光显微术成像系统和CellTracks分析仪。接着根据多种性质将这些图像进行归类，并以最有可能到可能性最小阳性CTC事件的顺序将图像呈递给用户。这种归类方法可以用于诊断和筛选基于循环稀少细胞的疾病，例如根据CTC所确定的恶性。

Description

细胞图像的归类方法

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2007年8月30日；申请号：200780032919.7(PCT/US2007/019045)；发明名称：同上。

相关申请的交叉引用

本申请是2006年9月5日提交的美国临时申请No.60/842,405的非临时申请，通过参照将其并入本文，并要求其部分优先权。

发明领域

本发明整体上涉及图像分析。图像，例如循环肿瘤细胞是从流式细胞计量术或荧光显微术获得的，并且根据它们的物理性质进行归类。

发明背景

许多临床医生相信癌症在其早期是器官局限性疾病。然而似乎这种观点是不正确的，并且在被使用目前可以利用的方法首次检测到时，癌症通常是系统性疾病。有证据证明原发癌在出现临床表现之前的疾病早期开始脱落瘤细胞进入循环。在肿瘤血管化之后，肿瘤细胞脱落进入循环可能会附着到远距离的位点并形成集落，以形成转移。这些循环肿瘤细胞(CTC)含有通常在健康个体细胞中无法发现的标记物，因此形成了诊断和治疗具体癌症的基础。因此，在循环中肿瘤细胞的出现可以代替其他测试或与其他测试结合例如乳房X线照相术或PSA测量，用于筛选癌细胞。通过采用适当的针对靶细胞上或靶细胞中相关标记物的单克隆抗体，或者通过使用细胞蛋白质表达的其他检验，或者通过分析细胞mRNA，容易测定这些细胞的来源器官例如乳房癌、前列腺癌、直肠癌、肺癌、卵巢癌或其他非造血系统癌症。

因此，在能够检测癌细胞的情况中，尽管基本上没有肿瘤的临床征兆，但仍可能鉴定它们的存在以及来源器官。此外，根据临床数据，癌症需要被认为是经血液传播的疾病，其特征在于存在潜在非常有害的转移细胞，从而进行治疗。在完全没有可检测的CTC证据的情况中，例如在外科手术之后，可以从进一步的临床研究确定是否需要后续治疗例如辐射、激素治疗或化学治疗。考虑到这些治疗的成本，预测患者对这类治疗的需要，或者其效率将是重要并且有利的临床信息。同样清楚的是循环中肿瘤细胞的数目涉及疾病从疾病的开始到其最终阶段发展的阶段。

恶性肿瘤的特征在于它们侵入邻近组织的能力。通常，直径1mm的肿瘤被血管化，并且动物研究显示在24小时内肿瘤中所存在的细胞中有几乎4％能够脱落进入循环(Butler，TP&Gullino PM，1975CancerResearch 35：512-516)。肿瘤的脱落能力最有可能依赖肿瘤的攻击性。尽管肿瘤细胞以连续的方式脱落进入循环，但相信没有或者仅有很少的一部分会引起长距转移(Butler&Gullino，同前)。肿瘤质量的提高被认为可能与循环肿瘤细胞频率的提高成比例。如果发现事实如此的话，则具有高水平灵敏性的方法将有助于评价患有长距转移的患者以及患有局部疾病的患者中的肿瘤负荷。在患有局部疾病的患者的外周血液中检测肿瘤细胞不仅具有检测早期肿瘤的潜力，而且还提供了关于肿瘤潜在入侵能力的指示。

类似地，可分类瘤细胞(classifiable tumor cell)中假象降低以及相应的干扰性可染色碎片对通过显微镜成像检测循环肿瘤细胞有不利影响。因此，维持血液样本的完整性或质量是最重要的，因为在血液提取和样本处理之间存在几乎24小时的延迟。这些延迟被认为是因为在用于该检验的处理血液中所使用的技术和设备可能无法在每个实验室中容易得到。用于使样品到达实验室进行样品处理所必要的时间可能会显著地变化。因此，重要的是建立样品可以被处理的时间窗口(timewindow)。在常规的血液学分析中，可以在24小时内分析血液样品。然而，由于稀有血细胞的分析是更重要的，因此血液样品能够被分析的时间段较短。

例子是血液细胞的免疫表型分析，其通常必须要在24小时内进行。在癌细胞检验中，需要处理较大体积的血液，血液样品的降解可能变得更有问题，因为来自CTC和来自造血细胞的破碎细胞所释放的材料会提高背景，并因此降低了检测肿瘤细胞的能力。大量CTC能够持续地从肿瘤位点脱落，并且维持了稳态水平，其中CTC的瓦解等于脱落速度，而脱落速度则依赖于肿瘤负荷的尺寸(参见JG Moreno等人“在转移性前列腺癌症患者中的循环癌细胞的变化与疾病状态相关.”Urology 58.2001)

通常，抗性和增殖能力更强的细胞会存活，以建立次级或转移位点。在外周循环中，CTC被激活的嗜中性粒细胞和巨噬细胞在体内(以及还有体外)进一步攻击，这渐进地导致膜穿孔、泄露电解质、小分子和最终损失对于细胞生存能力必要的重要细胞成分包括DNA、染色质等。在细胞死亡的关键点，细胞凋亡进一步辅助了细胞瓦解。细胞凋亡的特征在于一系列逐步缓慢的细胞内事件，这与由于细胞外物质例如细胞毒性抗肿瘤药物所激发或介导的细胞坏死或者快速细胞死亡不同。这些瓦解过程的全部或者某些可能会导致形成碎片和/或聚集体，其包括来自破碎的CTC以及来自正常造血细胞的偶然瓦解的可染色DNA、DNA片段和“DNA梯度”结构。，因为大部分细胞毒性药物是以接近毒性剂量给药的。

在该特定技术领域中已知多种方法用于从血液回收肿瘤细胞。例如授予AmCell和Miltenyi的美国专利#6,190,870教导免疫磁性分离，接着进行流式细胞计量术计数。然而，在免疫磁性分离之前，血液样品被使用密度梯度进行预处理。其也没有对样品的可视化分析。

在授予Immunivest的美国专利#6,365,362中，描述了用于免疫磁性富集和分析样品得到血液中肿瘤细胞的方法。这些方法具体地针对分析原始细胞，其中细胞的数目与疾病状态相关。所分离的细胞被标记以分析核酸和其他标记物的存在，这能够在分析的过程中排除非靶样品组分。

其来源组织的上皮细胞服从所建立的生长和发育“规则”。这些规则包括群体控制(population control)。这意味这在正常情况下，细胞的数目和尺寸保持稳定，只有在生物体的正常生长和发育时变化才是必要的。只有上皮细胞的基底细胞或永生细胞才会分裂，并且只有在对于上皮细胞发挥其功能必要时才会分裂，无论怎样都依赖于上皮细胞的性质和位置。在某些异常但良性的情况下，细胞会增殖，基底层会比通常分裂得多，这造成了增生。在某些其他异常但良性的情况下，细胞的尺寸会增大到超过对于特定组织的正常尺寸，造成细胞巨大症，例如在叶酸缺乏症中。

上皮组织还可能由于恶性前或恶性损伤而导致细胞尺寸或数目的提高。在这些情况中，与上述类似的变化伴随着细胞核异常，其从温和的低度内皮损伤到严重的恶性。相信这些细胞中的变化会影响上皮细胞的部分厚度，并且随着严重性的提高，它们将包括这些上皮细胞更厚的部分。这些细胞不遵守接触抑制的限制，并且继续生长而没有组织控制。当上皮细胞的整体厚度受到恶性变化的影响时，该条件被称作原位癌(CIS)。

随着它们恶性能力的提高，恶性细胞最终能够通过基底膜并侵入器官的基质。在侵入基质后，这些细胞被认为具有达到血管的能力。一旦它们渗透进血管，恶性细胞会发现它们处于与其发源的环境不同的环境。

这些细胞可以作为单个细胞或者两个或更多细胞的团块渗入血管。循环通过循环系统的上皮起源单细胞注定具有两种结果之一。其可能死亡或者可能存活。

发明简述

本发明中所描述的方法用于分析循环肿瘤细胞(CTC)的图像。图像可以是从多种平台获得的，包括多参数流式细胞计量术、CellSpotter荧光显微术成像系统和CellTracks分析仪(CellTracksAnalyzer)。接着根据各种性质对这些细胞进行归类，并以最有可能到可能性最小阳性CTC事件的顺序呈递给用户。本文描述了用于诊断、监控和筛选疾病的方法，其基于循环的稀有细胞，包括通过CTC所确定的恶性。

附图说明

图1显示阳性CTC事件的图像。

图2显示在同样框架中具有白细胞的阳性CTC事件的图像。

图3显示在同样框架中具有多个白细胞的阳性CTC事件的图像。

发明详述

在本文中，使用被本领域技术人员充分理解的各种术语。这些术语的期望含义不离开所公认的含义。

术语“生物样本”或“生物样品”可以互换使用，并且指的是从怀疑含有目的细胞的人类对象提取并进行分析的一小部分流体或组织。生物样本指的是流体部分、细胞部分和含有可溶材料的部分。生物样本或生物样品包括但不限于体液例如外周血、组织匀浆液、乳头抽吸液、结肠灌洗液、唾液、吸气管灌洗液、以及可以从人类对象获得的任何其他细胞来源。示范性组织匀浆液可以从乳癌患者中的前哨淋巴结(sentinel node)获得。

术语“稀有细胞”在本文中被定义为正常情况下不在生物样品中存在，但可以作为异常条件例如感染疾病、慢性疾病、损伤或怀孕指示存在的细胞。稀有细胞还指正常情况下可以存在于生物样品中，存在于生物样品中，但存在频率比正常生物样品中通常存在的细胞低几个数量级的细胞。

术语“决定簇”在用于任何前述靶生物体(target bioentity)时，宽广地指在通常诱导免疫应答的大分子抗原上存在的化学嵌合体(chemicalmosaics)。“决定簇”还可以与“表位”可互换地使用。在本文可互换使用的“生物特异性配体”或“生物特异性反应物”可以特异性地结合决定簇。决定簇指的是靶生物体的一部分，其残余和引起、选择性结合特异性结合物质(例如配体或反应物)，其存在对于发生选择性结合是必需的。因此，在基本术语中，决定簇是靶生物体上被具有结合亲和力的抗原、配体和/或反应物在特异性结合对反应中所识别的分子接触区。

本文所使用的术语“特异性结合对”包括抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、植物凝集素-糖类、核酸(RNA或DNA)杂交序列、Fc受体或小鼠IgG-蛋白质A、抗生物素蛋白-生物素、链亲合素-生物素和病毒-受体相互作用。

本文所使用的术语“可检测标记”是指任何物质，其直接或者间接通过物理或化学手段的检测或者测量，是在测试样品中存在目标生物体的指示。可以使用的可检测标记的代表性例子包括但不限于下列：根据光吸收、荧光、反射、光散射、磷光或发光性质可以检测的分子或者离子；通过它们的核磁共振或者顺磁性质可以检测的分子或者离子。可以根据光吸收或荧光间接检测的分子组中所包括的是各种酶，其能够使得适当的底物转化(例如从非光吸收转化为光吸收分子，或者从非荧光转化成荧光分子)。可以使用多种通常所使用的平台的任何平台进行分析，包括多参数流式细胞计量术、免疫荧光显微术、激光扫描细胞仪、亮视野基图像分析、毛细管容量、光谱成像分析、手工细胞分析、CellSpotter分析、CellTrack分析以及自动细胞分析。

短语“基本上排他的”指的是生物特异性配体或生物特异性试剂与其相应靶决定簇之间结合反应的特异性。生物特异性配体和试剂对它们的靶决定簇具有特异性结合活性，而对其他样品组分还可以表现出低水平的非特异性结合。

在本文中，短语“早期癌症”与“I期”或“II期”癌症是可互换使用的，并且指的是已经被临床确定为器官局限性的。还包括太小而不能被传统方法测定的肿瘤，例如对于乳癌患者的乳房X线照相术，或者对于肺癌患者的X-射线。而乳房X线照相术能够检测具有大约2×10⁸个细胞的肿瘤，本发明的方法需要从差不多该尺寸或较小的肿瘤检测循环癌细胞。

在本文中所使用的术语“形态分析”指对象的可视化观察的特征例如尺寸、形状或者某些特征的存在/不存在。为了对形态特征进行可视化，通常将目标进行非特异性染色。

在本文中所使用的术语“表位分析”指对已经被标记某些表位的目标进行观察。为了可视化表位特征，通常对目标进行特异性染色或者标记。可以将形态分析与表位分析结合，以提供对目标的完整分析。

在对样品进行分析时，可以对大量图像进行观察，以确定地评估样品。目前，为观察员呈递了所有事件的图像。这些事件的顺序仅仅是通过它们在样品室中的位置来确定的，即开始的图是在获取的开始，最后的图来自获取的终点。必须要独立于其他人对每张图进行观察，以进行自信地确定。因为目标事件是稀有靶细胞，它们的位置将在样品室内随机出现，随后在观察中随机。因此，鉴定所有感兴趣的罕见事件可能需要观察整个样品。

在进行诊断时，阳性事件的总数目是最重要的结果。在疾病例如癌症中，较大数目的阳性事件决定疾病的严重性。如果已经建立了阳性事件数目的阀值，则实际的数目可能不如确定是否样品超出阀值重要。换句话说，如果样品具有许多阳性事件，并且超过阀值，则样品能够被认为是阳性的，而不需要观察每一单个事件。

本发明将通过以最有可能到可能性最小满足为鉴定特定事件所建立的标准的顺序呈递结果，而辅助观察者。在观察开始时呈递的某些候选物越多，则观察会越快地做出决定是否样品超出阀值。而且，使用该方法，会有评分，其中在评分之上的事件最有可能是阳性事件，而之下的则不是。

为了分析图像，观察者使用标准例如图像中对象的尺寸、形状和强度。为了测定事件是否是阳性，观察者使用标准例如对象的相似尺寸，以及对于给定事件的图像重叠的量。在鉴定CTC时，细胞需要是圆形或者卵形。细胞核图像需要比细胞质图像小。细胞核还需要明显地在细胞质周围。图像的强度对于做出决定也是重要的。

本发明根据标准的样品组对CTC事件进行归类。首先，其鉴定细胞角蛋白阳性事件。接着，对于给定的细胞角蛋白事件，测量与细胞核事件重叠的量。如果这些图像被适当重叠，则确定该事件作为白细胞是阳性还是阴性。当每个事件都经过这些组标准时，最有可能的CTC候选事件获得较高的评分，并且在分析过程中，观察者被呈递基于它们的归类评分的图像。

实施例

实施例1 CellTracks分析仪(CellTracks Analyzer)图像归类

将利用CellTracks分析仪(CellTracks Analyzer)分析的样品使用细胞角蛋白-PE、DAPI和CD45-APC进行染色。对于CTC样品，同样满足细胞标准的藻红蛋白(PE)阳性、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)阳性、别藻蓝蛋白(APC)阴性事件被计数为肿瘤细胞。PE阴性、APC阳性事件被计数为白细胞。然而，存在PE阳性、APC阳性事件的情况。这些被计数为双阳性事件。

对于细胞角蛋白-PE图像，本发明分析了染色强度等高线(contour)。这些图像中出现的对象的强度可能是有噪音的。细胞角蛋白染色在明显阳性细胞中很少是一致的。对于典型的细胞，在图像中存在一定量的噪音。在本发明中，使用kuan过滤去除噪音。需要发现与背景相比，不是一致地亮的对象。过滤还导致使得系统能够通过发现每个对象的边界，而鉴定靠近在一起的单独对象。

DAPI用于标记核酸。对DAPI图像进行分析，并根据强度特征隔离到区段内。设定阙值以防止单个对象被描绘成多个独立的区段的过分割(over-segmenting)。然而，因为核酸染色比细胞角蛋白更可预测，所以对于区分独立的对象需要较少的过滤。

一旦鉴定了对象，则根据它们对细胞角蛋白-PE和DAPI二者的强度，对它们进行评分。强度较高的对象被给出较高的评分。接着，根据两幅图的重叠对对象进行分析。核酸应当出现在细胞角蛋白的边界内。具有较高重叠部分的对象被给出较高的评分。如图1所示，在细胞角蛋白内充分符合的DAPI对象是阳性CTC事件。

还使用CD45-APC对样品进行染色。其被用于染色白细胞，并且鉴定非靶事件。对于APC阳性的对象将不被认为是CTC。然而，存在一小部分事件，其对PE和APC是阳性的，这被称作双阳性事件。因此，不是简单地使用APC阳性或阴性作为标准，而是APC和PE的比例被用于区分来自CTC和白细胞的双阳性事件。根据该比例对这些事件进行评分，以便可能的CTC被给出比可能的白细胞高的评分。在图2和图3中，CTC(DAPI阳性和PE阳性)可以与白细胞(APC阳性和DAPI阳性)同时被观察。

一旦通过上述过程分析每个对象，则按照评分的顺序将这些图像呈递给观察者。结果是最有可能CTC的事件出现在图像组的开始，可能性较低的对象出现在图像组的较后面。

可以使用本发明的组合物、方法和试剂盒检测的不同类型癌症的例子包括胺前体摄取脱羧细胞瘤(apudoma)、迷离瘤、鳃原性瘤、恶性类癌综合症、类癌心脏病、癌例如沃克癌(Walker)、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、Brown-Pearce癌、导管癌、艾氏肿瘤(Ehrlich tumor)、原位癌、克雷布斯2癌(Krebs 2)、梅克尔细胞癌(merkel cell)、粘液癌、非小细胞癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、硬癌、细支气管癌、支气管癌、扁平细胞癌和过度细胞网状内皮组织增殖、黑色素瘤、软骨母细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、间叶性肿瘤、中肾瘤、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、滋养层(throphoblastic)肿瘤、腺癌、腺瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒导细胞瘤、两性胚细胞瘤、肝细胞瘤、汗腺腺瘤、胰岛细胞瘤、睾丸非生殖细胞瘤、乳头状瘤、睾丸滋养细胞瘤、卵泡膜细胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤(neurilemmoma)、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、纤维神经瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬性副神经节瘤、神经鞘瘤、引起硬化的血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果体瘤、癌肉瘤、软骨肉瘤、囊性叶状叶柄肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病性肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、肉瘤(考波希氏(Kaposi's)和乳突细胞)、赘生物(例如骨的、消化系统的、结肠直肠的、肝的、胰腺的、垂体的、睾丸的、眼窝的、头和颈的、中枢神经系统的、听觉系统的、骨盆的、呼吸道的和泌尿生殖器的)、神经纤维瘤和宫颈非典型增生。

然而，本发明不仅仅局限于检测检测循环上皮细胞。例如，在患有心肌梗死的病人的血液中已经观察到内皮细胞。与上皮细胞类似，内皮细胞、心肌细胞和病毒感染细胞也具有能够被可利用单克隆抗体识别的细胞类型特异性决定簇。因此，本发明的方法可以适于检测这样的循环内皮细胞。另外，本发明允许检测在患有传染病的患者的外周血液中所携带的细菌细胞，还可以使用本发明的组合物、方法和试剂盒对这些患者进行检验。如果在与上述相似的条件下存在，预料这些稀有细胞将在循环中具有相似的行为是合理的。

本文所公开的发明的优选实施方式还被认为能够在癌症诊断以外的领域和应用中采用本发明。对于本领域技术人员而言明显的是，本发明的改进诊断模式并不受到前面优选实施方式的描述的限制。最后，尽管上面所提供的实施方式提供了详细的描述，但后面的权利要求并不被限制在详细的描述中。事实上，可以对其做出各种修改而不离开后面的权利要求的主旨。

Claims (11)

1. 一种对流体样品中的细胞图像进行归类的方法，其包括：

a.     从平台获取图像；

b.     对来自形态分析、表位分析及其组合的所述图像性质进行归类；

c.     以最有可能到可能性最小阳性循环肿瘤细胞的顺序呈递图像；以及

d.     选择所述图像进行分析，其中所述分析是选自诊断疾病、监控疾病、筛选疾病及其组合。

2.  权利要求1的方法，其中所述平台是多参数流式细胞计量术、CellSpoter荧光显微术或CellTracks分析仪成像。

3.  权利要求1的方法，其中所述形态分析选自测量、形状分析、尺寸分析、细胞质/细胞核重叠、细胞质/细胞核相对强度及其组合。

4.  权利要求1的方法，其中所述表位是鉴定PE阳性事件、DAPI阳性事件和APC阴性事件。

5.  权利要求4的方法，其中通过kuan过滤除去背景噪音。

6.  权利要求1的方法，其中所述细胞图像来自循环肿瘤细胞、上皮细胞、内皮细胞、细菌细胞和病毒感染细胞。

7.  权利要求6的方法，其中所述细胞图像是循环肿瘤细胞。

8.  权利要求7的方法，其中所述表位分析是鉴定细胞角蛋白-PE阳性事件、DAPI-染色的细胞核阳性事件和CD-45 APC阴性事件。

9.  权利要求8的方法，其中所述顺序是通过对细胞角蛋白-PE阳性事件和所述DAPI-染色的细胞核阳性事件进行强度评分。

10. 权利要求9的方法，其中所述表位分析是进一步通过所述细胞角蛋白-PE阳性事件和所述DAPI-染色的细胞核阳性事件进行部分重叠而确定的。

11. 权利要求10的方法，其中通过APC与PE强度比例对CD-45 APC阳性事件进行进一步评分，其中较高的所述强度比例表示较低的循环肿瘤细胞评分。