CN104962562A - 全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列及获得方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列及获得方法和应用。本发明的基因序列获得方法包括：全人源EGFR ScFv基因序列的获得，全人源EGFR ScFv基因序列的改变，对改变的VH-L-VL基因序列添加酶切位点Xba1、BamH1，加保护碱基，且在ATG后加组氨酸标签、在5’端的酶切位点内加3个终止码子。本发明的全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列克服了鼠源性基因序列在体内易产生人抗鼠的抗体反应及其它源性基因序列导致的其它不良反应。本发明利用烟草这一植物生物反应器进行高效表达的全人源EGFR ScFv具有抗肿瘤作用。

Description

全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列及获得方法和应用

技术领域

本发明属于利用植物生物反应器生产一种抗肿瘤药物的领域，特别涉及一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列及获得方法和应用。

背景技术

目前利用化学疗法治疗癌症已经成为常规治疗方法，但化疗有其应用瓶颈。如今急需另外的医疗方法突破化疗的瓶颈。肿瘤生物治疗(cancer biotherapy)成为继手术、化疗和放疗三大经典肿瘤治方法后的第四种方法。表皮生长因子受体(EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，EGFR表达异常可以导致细胞信号通路持续活化、最终导致肿瘤发生(非专利文献1)。EGFR是一种酪氨酸蛋白激酶型受体，其相对分子质量约为170 000。廖刚等人认为EGFR在多种恶性肿瘤细胞中存在过表达的现象，EGFR的过表达甚至突变在肿瘤发生与发展中很关键，并与肿瘤的恶性生物学行为和肿瘤患者的不良预后有着紧密关系。

EGFR受体常高表达于恶性肿瘤细胞(非专利文献2)，EGFR已成为肿瘤生物治疗的一个理想靶点。针对EGFR靶点的ScFv药物的研究具有广阔的前景，利用配体或抗体将治疗分子运送到高表达EGFR的肿瘤细胞局部也受到越来越多的关注。利用ScFv作为靶向分子具有以下优点：分子量小，穿透性较强，能实现人源化，易对它进行改造，可大规模生产等(非专利文献3)。目前国内外已经研制出多种ScFv，并用于临床(非专利文献4)。

近年来靶向EGFR的肿瘤生物治疗方法在针对于肿瘤靶向治疗的药物研发 及应用受到了强烈的重视。以EGFR为靶点的治疗方式主要有以下两种：小分子酪氨酸激酶拮抗剂和单克隆抗体。在肿瘤生物治疗中，EGFR这一靶点起关键作用。以EGFR为靶点的单克隆抗体治疗，通过现代分子生物学和遗传学等技术方法在基因及细胞分子水平对其表达、活性及其效应等多个环节进行有效抑制而达到治疗肿瘤的目的，是近年来抗肿瘤治疗新的方法和手段之一。然而，由于目前制备的单克隆抗体多为鼠源性的，在体内易产生人抗鼠的抗体反应，加之其分子量大，血管通透性差，给临床应用带来了一定的困难。而至今尚未见全人源抗EGFR ScFv的构建和应用的报道。

现有技术文献 

非专利文献 

非专利文献1：MENDELSOHN J，BASELGA J.Epidermal growth factor receptor targeting in cancer[J].Semin Oncol,2006,33(4):369-385. 

非专利文献2：Normanno N,Bianco C,Strizzi L,et a.l The ErbB receptors and their ligands in cancer:an overview[J].Curr Drug Targets,2005,6(3):243-257. 

非专利文献3：赵晓蓉,戴维,彭吉林,黄鹤,袁晓梅,刘静,朱慧芬,沈关心.EGFR特异性单链抗体与靶细胞结合的特异性[J].郧阳医学院学报200625(4):202-204

非专利文献4：Sun C,Wirsching P,Janda KD.Enabling ScFvs as multidrug carriers:A dendritic approach[J].Bioorg Med Chem,2003,11(8):176168. 

发明内容

为克服以上缺陷，本发明利用烟草这一植物生物反应器进行高效的表达全人源EGFR ScFv序列，该发明的基因序列高效表达后具有抗肿瘤作用。

本发明目的是由以下技术方案实现的：

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列，包括的核苷酸序列见SEQ ID NO1。

本发明还提供了一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，包括以下步骤：

a、全人源EGFR ScFv基因序列的获得，通过连接肽(Linkr)将重链可变区(VH)DNA序列与轻链全长(VL)DNA序列连接起来，得到VH-L-VL基因序列；

b、全人源EGFR ScFv基因序列的改变，对全人源EGFR ScFv基因序列进行烟草密码子偏好性基因序列改变，得到改变的VH-L-VL基因序列；

c、对改变的VH-L-VL基因序列添加酶切位点Xba1、BamH1，TCTAGA为Xba1的酶切位点，且序列中没有BamH1的酶切位点，为方便PBI121+GUS的载体构建，选择Xba1和BamH1两个酶切位点，把碱基TCTAGA改动成密码子频率次之的密码子，改为TCAAGG，得到Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列；

d、在Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列两端加保护碱基，且在ATG后加组氨酸标签(组氨酸标签不可切除)、在5’端的酶切位点内加3个终止码子，修饰成Xba1---HIS---VH-L-VL--BamH1基因序列，既全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列。

进一步的，本发明目的还可以由以下技术方案实现：

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述重链可变区(VH)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO2。

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述轻链全长(VL)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO3。

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述连接肽(Linkr)包括的核苷酸序列见SEQ ID NO4。

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述步骤a所得VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO5。

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述步骤b所得改变的VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO6。

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述步骤c所得Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO7。

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述步骤d所得全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO1。

本发明的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列高效表达后具有抗肿瘤作用。

全人源EGFR ScFv(VH-L-VL)烟草密码子偏好基因序列蛋白质高级结构的预测，通过ORF Finder预测VH-L-VL的ORF，可知它是一个完整的编码序列。通过理化性质分析，可知VH-L-VL是一种稳定蛋白，且还是一种亲水性蛋白，通过TMHMM分析，可知VH-L-VL并非是跨膜蛋白，TargetP对VH-L-VL蛋白的亚细胞定位进行预测，结果表明，VH-L-VL是分泌到细胞周质的蛋白。以上各种结果符合ScFv的特点。

利用植物作为工厂生产重要的药用蛋白，包括疫苗抗原和治疗的单克隆抗体(mAbs)，有几个优势，首先，植物可以产生大量的蛋白质，有效和可持续，并在一定条件下，可以有显着的优势，成本低。其次，植物的生长不需要的动物或人来源的营养素，因此动物或人类病原体和毒素的污染的风险极低。第三， 植物具有类似于哺乳动物的细胞，允许适当的重组蛋白的翻译后修饰，可以表达具有功能的产物。将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物，在植物中可表达出具有功能的抗体，即具有结合特性的全抗体或部分抗体片段。在植物中表达重组抗体，可以大规模在大田种植，条件相对简单，价格低廉，外源抗体基因片段可以整合进入植物染色体中稳定遗传。植物细胞可以对表达的重组抗体蛋白进行正确的组装和翻译后修饰，其表达产物还能保持良好的生物学特性；同时由于植物表达系统表达的抗体以二聚体形式存在，因此表达产物的亲和力高，有助于全面发挥抗体的功能。

本发明的有益效果：

本发明的全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列，克服了鼠源性基因序列在体内易产生人抗鼠的抗体反应及其它源性基因序列导致的其它不良反应。利用烟草这一植物生物反应器进行高效表达的全人源EGFR ScFv，烟草中表达的全人源EGFR ScFv的氨基酸序列和它的原始序列相同，并且能形成类似于人类等哺乳类动物的复杂型糖链结构。本发明对抗体药物的植物生产具有指导意义，可以大幅度降低抗体药物的生产成本，具有较高的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明的基因序列在烟草中高效表达后所得蛋白质对乳腺癌细胞增值的抑制作用结果图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，包括以下步骤：

a、全人源EGFR ScFv基因序列的获得，通过连接肽(Linkr)将重链可变区(VH)DNA序列与轻链全长(VL)DNA序列连接起来，得到VH-L-VL基因序列；

所述重链可变区(VH)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO2。

所述轻链全长(VL)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO3。

所述连接肽(Linkr)包括的核苷酸序列见SEQ ID NO4。

所得VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO5。

b、全人源EGFR ScFv基因序列的改变，对全人源EGFR ScFv基因序列进行烟草密码子偏好性基因序列改变，得到改变的VH-L-VL基因序列；

具体操作步骤包括：采用Codon Usage Database软件，得到烟草偏好性密码子；用高频率烟草偏好性密码子对VH-L-VL基因序列中的密码子进行替换，得到改变的VH-L-VL基因序列。

所得改变的VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO6。

c、对改变的VH-L-VL基因序列添加酶切位点Xba1、BamH1，TCTAGA为Xba1的酶切位点，且序列中没有BamH1的酶切位点，为方便PBI121+GUS的载体构建，选择Xba1和BamH1两个酶切位点，把碱基TCTAGA改动成密码子频率次之的密码子，改为TCAAGG，得到Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列；

所得Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO7。

d、在Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列两端加保护碱基，且在ATG后加组氨酸标签(组氨酸标签不可切除)、在5’端的酶切位点内加3个终止码子，修饰 成Xba1---HIS---VH-L-VL--BamH1基因序列，既全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列。

所得全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO1。

实施例2

酶切位点、氨基酸序列分析

利用生物信息学软件BIOXM2.6对全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列酶切位点、氨基酸序列等分析。

全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码后的氨基酸序列为：

SSRMHHHHHHMDFQVQIFSFLLISASVIISRGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKR***GSG 

可编码的氨基酸序列见SEQ ID NO8。

全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码后的氨基酸序列为：

DFQVQIFSFLLISASVIISRGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKR 

可编码的氨基酸序列见SEQ ID NO9。

结论：编码后的氨基酸序列与原氨基酸序列一致，说明本发明的全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列正确。

实施例3

ORF分析

利用在线软件BIOXM2.6提供的ORF Finder对全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列进行分析，预测其理化性质。

结果：通过理化性质分析，可知全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白是一种稳定蛋白。

实施例4

亲/疏水性分析

利用在线软件ProtScale对全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列进行亲水性/疏水性分析。

结果：全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白是一种亲水性蛋白。

实施例5

跨膜区分析 

利用在线软件TMHMM对全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列进行分析跨膜区。

结果：全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白不是跨膜蛋白。

实施例6

亚细胞定位 

利用软件TargetP对全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列进行亚细胞定位分析。

结果表明，全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白是分泌到细胞周质的蛋白。

结论：实施例3-6的结果表明全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白符合ScFv的特点。

实施例7

烟草表达及蛋白鉴定

a、通过OVER LAP PCR技术，引入连接肽，把VH与VL序列通过连接肽拼接获得792bp的VH-L-VL基因序列。

b、构建pBI121-VH-L-VL重组烟草表达载体，将测序正确的VH-L-VL基因的PCR回收产物和pBI121空载体以XbaI、BamHI双酶切，37℃水浴过夜后，进行琼脂糖凝胶电泳并回收，然后在T4DNA连接酶作用下室温连接4h，转化E.coli DH5α，通过卡那霉素(Kanamycin，Kan+)抗性筛选得到pBI121-VH-L-VL重组子。

c、将鉴定成功后的pBI121-HLL-YC质粒通过电转法转化农杆菌株。

d、将转化成功的农杆菌株通过叶盘法浸染烟草，并对阳性转基因烟草进行筛选。

e、将阳性转基因烟草的叶片在液氮中研磨，取上清液，用上清液对体外培养的乳腺癌细胞处理。

将体外培养的乳腺癌细胞平均分为A、B、C三部分，A部分癌细胞培养时培养基中不加上清液；B部分癌细胞培养时培养基中加2％的上清液；C部分癌细胞培养时培养基中加10％的上清液，在共聚焦显微镜下观察上清液对体外培养的乳腺癌细胞的增殖抑制影响，结果如图1。

结论：通过烟草表达及蛋白鉴定结果表明，烟草表达蛋白为全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白，烟草表达蛋白对体外乳腺癌细胞的增值具有良好的抑制作用。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员 对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列，其特征在于，包括的核苷酸序列见SEQ ID NO1。

2.一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、全人源EGFR ScFv基因序列的获得，通过连接肽(Linkr)将重链可变区(VH)DNA序列与轻链全长(VL)DNA序列连接起来，得到VH-L-VL基因序列；

b、全人源EGFR ScFv基因序列的改变，对全人源EGFR ScFv基因序列进行烟草密码子偏好性基因序列改变，得到改变的VH-L-VL基因序列；

c、对改变的VH-L-VL基因序列添加酶切位点Xba1、BamH1，TCTAGA为Xba1的酶切位点，且序列中没有BamH1的酶切位点，为方便PBI121+GUS的载体构建，选择Xba1和BamH1两个酶切位点，把碱基TCTAGA改动成密码子频率次之的密码子，改为TCAAGG，得到Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列；

d、在Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列两端加保护碱基，且在ATG后加组氨酸标签(组氨酸标签不可切除)、在5’端的酶切位点内加3个终止码子，修饰成Xba1---HIS---VH-L-VL--BamH1基因序列，既全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列。

3.根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，所述重链可变区(VH)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO2。

4.根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，所述轻链全长(VL)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO3。

5.根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，所述连接肽(Linkr)包括的核苷酸序列见SEQ ID NO4。

6.根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，所述步骤a所得VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO5。

7.根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，所述步骤b所得改变的VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO6。

8.根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，所述步骤c所得Xba1-VH-L-VL-BamH1基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO7。

9.根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，所述步骤d所得全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID NO1。

10.一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的用途，其特征在于，该全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列高效表达后具有抗肿瘤作用。