CN104957189A - 一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，该消毒剂由单过硫酸氢钾、苹果酸、氯化钠及黄连提取物混合均匀后制得，其各组分按重量百分比计包括：单过硫酸氢钾，46-78%；苹果酸，3-15%；氯化钠，2-10%；黄连提取物，19-35%；本发明还设计了一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂的使用方法；本发明所设计的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂及其使用方法既能够有效杀灭水产养殖池塘中主要病原微生物，又不会对草鱼和对虾造成不良影响，同时具有无残留、无公害的优点。

Description

一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂及其使用方法

技术领域

本发明涉及水产养殖中水体消毒净化技术领域，特别是一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂及其使用方法。

背景技术

中国是水产养殖大国，据统计，我国水产养殖量占世界水产养殖总量的三分之二以上，然而，水产疾病问题一直是阻碍水产养殖业健康发展的严重问题；据不完全统计，我国每年水产养殖病害发病率在50%以上，损失率高达20%，造成直接经济损失达100亿元以上；近年来，随着高密度集约化养殖的发展，水产疾病日趋严重，从而给水产养殖业造成巨大的经济损失，其中由病毒疾病造成的损失也日益增加；在水产病害防控过程中，通过水体消毒杀灭水体或养殖动物体表的病原微生物（病毒、细菌等）以改善水生动物生存环境是有效防控水产病害的重要技术手段。

目前，常见的水产消毒剂主要有卤素类（分别有含氯消毒剂、含溴消毒剂和含碘消毒剂）、酚醛醇类、酸碱类、季铵盐类等几大类，如中国专利CN03113687.7（一种水产养殖用消毒剂组合物及其应用）、CN00115919.4（用于水产养殖业的消毒剂）、CN200610015379.9（二氧化氯消毒剂）、CN200710028424.9（复合氧化胺络合碘消毒剂）、CN200310104184.8（水产专用三氯异氰尿酸复合消毒剂）、CN200310104181.4（水产用双长链季铵络合碘异噻唑啉酮复合消毒剂）、CN200610031925.8（一种高效、低成本二氧化氯消毒剂的生产方法）、CN200810179622.X（一种新型聚六亚甲基胍复方消毒剂及制备方法）和CN201110185495.6（池塘水体复合消毒剂及其应用）等。

就目前来看，现有的消毒剂还存在许多不足之处，如含氯消毒剂易受水体有机物和酸碱度变化的影响，且对器具有腐蚀作用，对鱼体毒性也较大；季铵盐类杀菌效果易受水质硬度影响；碘制剂效果易受光线、温度等条件影响，且易挥发失效等（黄小丽和邓永强，2004）；同时，目前生产上所用的大部分消毒剂种类单一、制剂单一、多数是从人药、兽药和水处理剂等方面转向而来，专门针对水产养殖池塘和水产养殖动物开发的消毒剂还很有限；特别是近年以来，草鱼和对虾混养模式发展很快，然而到目前为止还没有见到能够针对草鱼和对虾混养模式条件下的池塘水体而设计的消毒剂产品；因此，针对草鱼和对虾混养模式，开发高效、低毒、无残留、无公害的新型水产消毒剂是大势所趋，也是本发明所要解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的缺点，提供一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂及其使用方法，既能够有效杀灭水产养殖池塘中主要病原微生物，又不会对草鱼和对虾造成不良影响，同时具有无残留、无公害的优点。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，该消毒剂由单过硫酸氢钾、苹果酸、氯化钠及黄连提取物混合均匀后制得，其各组分按重量百分比计包括：

单过硫酸氢钾，46-78%；

苹果酸，3-15%；

氯化钠，2-10%；

黄连提取物，19-35%。

本发明进一步限定的技术方案是：

进一步的，前述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，其各组分按重量百分比计包括：

单过硫酸氢钾，70%；

苹果酸，5%；

氯化钠，6%；

黄连提取物，19%。

前述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，其各组分按重量百分比计包括：

单过硫酸氢钾，50%；

苹果酸，15%；

氯化钠，10%；

黄连提取物，25%。

前述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，其各组分按重量百分比计包括：

单过硫酸氢钾，57%；

苹果酸，15%；

氯化钠，2%；

黄连提取物，26%。

本发明还设计了一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂的使用方法，当进行养殖池塘水体彻底消毒时，其使用浓度为水体的1%；当进行养殖池塘水体表面消毒时，其使用浓度为水体的0.5%；当进行养殖池塘中细菌和病毒的常规控制时，其使用浓度为0.5ppm；在养殖池塘疾病高发期使用时，其使用浓度为1ppm。

技术效果：本发明所设计的水产池塘水体消毒剂，针对养殖虾塘水化学和病原微生物生理特点，选择高效的氧化剂单过硫酸氢钾作为消毒剂主要成分可对细菌和病毒进行有效杀灭；氯化钠在单过硫酸氢钾的氧化作用下产生氯气，在水解作用下逐渐产生次氯酸进行水体的消毒反应，达到长久高效消毒的作用；且经消毒后，这些化学物质又转变成氯化钠，达到对水体和养殖动物无毒性、无残留的效果；

此外，苹果酸作为一种有机酸，添加到水体中可达到降低PH的作用，增强消毒剂的消毒效果；黄连提取物的有效成分是盐酸小檗碱，经试验验证可有效杀灭水体中的病毒，且对养殖动物无任何毒副作用。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

（1）本发明所设计的水体消毒剂原料易得，配制简单；

（2）本发明所设计的水体消毒剂能够有效预防多种水产病菌，包括细菌（弧菌）、病毒和真菌、用于各类海、淡水鱼虾养殖；

（3）本发明所设计的水体消毒剂使用方便、作用迅速，作用方式多样；

（4）本发明所设计的水体消毒剂对草鱼和对虾完全无不良影响，同时对环境友好，无公害无残留。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的技术方案作进一步的详细说明：

实施例1：

按照以下各组分重量百分比配制水产养殖池塘用水体消毒剂：

单过硫酸氢钾，70%；苹果酸，5%；氯化钠，6%；黄连提取物，19%；

将上述组成按重量百分比混合均匀即制得；

将上述水体消毒剂，进行针对气单胞菌杀灭效果的实验：

将消毒剂配制成浓度为0.5ppm的消毒液；培养基为牛肉膏液体及固体培养基，pH7.0±0.2；所用试剂均为分析纯，供试菌株为气单胞菌标准菌株（Aeromonashydrophila）ATCC7966（购自中国农业微生物保藏中心）菌悬液的制备，将每株纯培养气单胞菌用单倍肉汤培养，经过增菌摇床过夜培养，取24h新鲜培养物加甘油置于-80℃冰箱中保存备用；

试验前1天取出，保存于－80℃冰箱中的菌株，分别接种于营养琼脂斜面，置28℃温箱中培养24h后取出，用胰蛋白胨生理盐水溶液（TPS）洗下菌苔，制成菌悬液，分别取各菌悬液与有机干扰物（3%牛血清白蛋白）以1∶1混合后制备成试验菌悬液，备用；配制试验用菌悬液，浓度为5×105～5×106cfu/ml；将消毒剂用蒸馏水稀释成浓度为0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、1ppm和2ppm的受试液，取各稀释度受试液2.5ml加入到含2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中；取0.1ml含菌量约为1×108cfu/ml的菌悬液接种于消毒剂的营养肉汤的试管中，作为试验组样本；

以同样方法接种于不含消毒剂的营养肉汤的试管，作为阳性对照组样本；取2支只含营养肉汤的试管，作为阴性对照组样本；

将试验组、阳性对照组及阴性对照组样本放置28℃培养箱中，培养24h，观察结果，通过细菌的生长与否，确定消毒剂抑制受试菌生长的最低浓度（MIC）；当阳性对照管有细菌生长（混浊），阴性对照管无菌生长（透明），试验用菌悬液的作用浓度为5×105～5×106cfu/ml时，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抑菌剂浓度为该样品对受试菌的MIC，最小杀菌浓度（MBC）的测定可在MIC测定试验的基础上进行；

MIC测定试验培养24h后，观察结果，吸取试验组无菌生长的各个稀释度所对应的抗（抑）菌剂0.5ml，加入含4.5ml中和剂溶液管中，混匀，作用10min，吸取该最终样液2.5ml，加入到含2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中，同时设立阳性对照组、阴性对照组和中和剂对照组；将各试验组和对照组放置28℃培养箱中，培养24h，观察结果。当阳性对照管有细菌生长（混浊），阴性对照管无菌生长（透明），中和剂对照管无菌生长（透明），试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗菌剂浓度为该样品对受试菌的MBC；

实验结果显示，本实施例中的消毒剂浓度在0.3ppm以上时，即能够起到抑制气单胞菌的作用，当本实施例中消毒剂浓度在1ppm以上时，即能够起到杀灭气单胞菌的作用，综上所述，本实施例中的消毒剂在较低浓度条件下对致病菌具有较好的杀灭效果。

实施例2：

按照以下各组分重量百分比配制水产养殖池塘用水体消毒剂：

单过硫酸氢钾，50%；苹果酸，15%；氯化钠，10%；黄连提取物，25%。

将上述组成按重量百分比混合均匀制得；

使用实施例2所制得的水体消毒剂，2014年5月在大丰方强农场某草鱼和对虾混养池塘进行水体消毒实验：对虾放苗放养前15天，按照1%浓度配制消毒液对池塘进行全面消毒，然后按正常步骤投放对虾苗种和草鱼苗种及进行养殖；放苗后每15天，按照0.5ppm浓度配制消毒剂对水体进行常规消毒；实验共进行123天，实验过程中对虾生长正常，草鱼也正常生长，全程未发现病毒性疾病及对虾猝死现象；实践证明使用该消毒剂对提高对虾养殖成功率，减少对虾病害发生有非常有效的作用。

使用实施例2所制得的水体消毒剂，进行针对水霉菌抑制效果的实验：挑取保藏于试管的水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（即PDA，马铃薯块200-300g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL）平板上，25℃下培养48h。待铺满整个培养皿后，用0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤3次，经4层纱布过滤，加入pH值为7.4的M199细胞培养液，分别调整孢子浓度为1*104、1*106、1*108个/mL，待用；

以不同梯度浓度的消毒剂2mL加至18mL，经溶化，56℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基使之均匀,迅速倾倒于培养皿中待凝固后用于实验，即药物PDA平板浓度为原浓度的1/10；采用多点接种方法，每点接种1uL水霉孢子菌悬液于凝固的培养基上；

设空白对照组，25℃下培养5d，孵育期内每24h观察1次，肉眼判定无菌落生长的培养皿内的最低药物浓度为MIC（最低抑菌浓度）；每个浓度设2个对照，同时设不加药液的空白PDA培养基为对照；将经马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养48h后，铺满平板的水霉用无菌刀片切成约1、2、3cm2的小块，将切好的水霉小块放入盛有各种浓度消毒剂倍释液的试管中浸泡0.17、0.5、1、2h；用无菌镊子取出浸泡过的水霉小块置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃下培养观察5d；

孵育期每24h观察一次，肉眼判定无水霉菌落生长的，表示本实施例中的消毒剂在该浓度该作用时间下对水霉具有杀灭作用；每个浓度设2个对照，同时设经生理盐水浸泡过的水霉块空白对照；实验结构显示浓度为0.5ppm以上的消毒剂溶液对水霉病菌丝有明显的抑制作用。

实施例3：

按照以下各组分重量百分比配制一种水产养殖池塘用水体消毒剂：

单过硫酸氢钾，57%；苹果酸，15%；氯化钠，2%；黄连提取物，26%；

将上述组成按重量百分比混合均匀即制得；

使用实施例3所制得的水体消毒剂，进行针对草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）杀灭效果的实验：草鱼呼肠孤病毒用草鱼肾脏（CIK）细胞培养，维持液为无血清DMEM培养基（含TPCK处理胰酶2g/ml、2%胎牛血清），按Reed-Meuench计算病毒对细胞半数感染剂量（TCID50），用维持液2倍系列稀释消毒剂12个稀释度，加入到CIK细胞96孔培养板中，26°培养箱培养，每天观察细胞病变；

确定对细胞无毒性的消毒剂最高稀释度。用维持液2倍系列稀释1：2、1：4、1：8、1：16、1：32五个浓度，共稀释三组。消毒剂每组的5个浓度分别与草鱼呼肠孤病毒（100TCID50/0.1ml）按9:1的比例混合作用，每组作用时间不同，分别5min、10min、30min；作用一定时间后，用维持液做10倍系列稀释,加入到96孔CIK细胞板中滴定样品中的残留病毒量，每个稀释度3孔，26°培养箱培养3d，观察细胞病变，根据Reed-Meuench法确定消毒剂每一浓度不同时间的病毒感染滴度（TCID50）；

在测试消毒剂灭活病毒实验的同时，测试50%乙醇灭活病毒的作用，方法与消毒剂的测试方法相同；试验结果显示，0.5ppm及以上浓度的消毒剂对草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）有明显的杀灭效果；2倍系列稀释的消毒剂与草鱼呼肠孤病毒作用5min、10min和30min，观察细胞病变判断指标确定各组的病毒感染滴度，计算消毒剂对草鱼呼肠孤病毒的平均灭活对数值，确定消毒剂实验室消毒合格的浓度和作用时间；结果显示消毒剂作用于草鱼肾（CIK）细胞的最大无毒浓度为1：200，1：2、1：4和1：8稀释的消毒剂与草鱼呼肠孤病毒作用5min、10min和30min的平均灭活对数值>4.00；实验结果表明该消毒剂1:2、1:4、1：8与病毒作用5min后可以100%杀草鱼呼肠孤病毒。

实施例1-3中的黄连提取物可以选择亳州市乾元动物药业有限责任公司生产的类似产品（含盐酸小檗碱30%）。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。

Claims (8)

1.一种草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，其特征在于，该消毒剂由单过硫酸氢钾、苹果酸、氯化钠及黄连提取物混合均匀后制得，其各组分按重量百分比计包括：

单过硫酸氢钾，46-78%；

苹果酸，3-15%；

氯化钠，2-10%；

黄连提取物，19-35%。

2.根据权利要求1所述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，其特征在于，其各组分按重量百分比计包括：

单过硫酸氢钾，70%；

苹果酸，5%；

氯化钠，6%；

黄连提取物，19%。

3.根据权利要求1所述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，其特征在于，其各组分按重量百分比计包括：

单过硫酸氢钾，50%；

苹果酸，15%；

氯化钠，10%；

黄连提取物，25%。

4.根据权利要求1所述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂，其特征在于，其各组分按重量百分比计包括：

单过硫酸氢钾，57%；

苹果酸，15%；

氯化钠，2%；

黄连提取物，26%。

5.权利要求1-4中任一项所述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂的使用方法，其特征在于，当进行养殖池塘水体彻底消毒时，其使用浓度为水体的1%。

6.权利要求1-4中任一项所述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂的使用方法，其特征在于，当进行养殖池塘水体表面消毒时，其使用浓度为水体的0.5%。

7.权利要求1-4中任一项所述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂的使用方法，其特征在于，当进行养殖池塘中细菌和病毒的常规控制时，其使用浓度为0.5ppm。

8.权利要求1-4中任一项所述的草鱼、对虾混养池塘用水体消毒剂的使用方法，其特征在于，在养殖池塘疾病高发期使用时，其使用浓度为1ppm。