CN104946532A - 一种雨生红球藻的破壁方法 - Google Patents

一种雨生红球藻的破壁方法 Download PDF

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Abstract

一种雨生红球藻的破壁方法，属于微藻生物技术领域，具体涉及一种雨生红球藻的破壁方法。其特征在于1）在无菌环境中，取微藻样品加入到培养基A中培养，得到藻液；将藻液接种于培养基A中进行培养，得到藻液A；2）将藻液A以无菌水进行稀释，涂布于液体培养基B上，在光照下的密闭培养箱中继续培养，得到微藻液；3）进行沉淀处理；4）收集细胞在胶体磨内进行磨碎；5）将一级磨碎后的细胞进行破壁处理。本发明的有益效果：通过胶体磨磨细胞，使雨生红球藻细胞壁变薄甚至细胞破碎，导致整个藻液粒径均匀，降低均质机破壁压力，安全隐患得到降低，提高破壁率。

Description

一种雨生红球藻的破壁方法
 
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种藻类的破壁方法。
背景技术
雨生红球藻(Haem atococcus pluvialis)亦称血球藻，是一种单细胞绿藻，在分类学上隶属于绿藻门(Chlorophata)、绿藻纲(Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、红球藻科(Haematococcaceae)、红球藻属(Haeematococcus)。
雨生红球藻的细胞壁由纤维素和果胶质分内外两层组成，胶样的物质填满了细胞壁和细胞质之间的空隙，细胞质连丝连接着细胞壁和原生质体。原生质体为卵形，前端乳头突起不与细胞壁连结，成熟的细胞乳头状突起常不明显。游动细胞具有 2 条(少数 4 条)顶生、等长、约等于体长的鞭毛，通过前端的叉状胶质伸出细胞壁。细胞核位于中央位置，有明显的核膜和核仁。伸缩泡有数个至数十个不等，并且不规则地分散在原生质体内。色素体可呈现多种形态，如杯状、网状、环状或是颗粒状。雨生红球藻的细胞幼期呈绿色，在光学显微镜下可见其细胞形态具有卵形和椭圆形两种，细胞宽 19～51 μm，长 28～63 μm，这些细胞可以游动。此时的细胞的光合作用能力很强，其内主要含有叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素和虾青素等。游动细胞大约经过 5 次分裂后便停止分裂，两个不再分裂的细胞失去鞭毛后开始融合，融合细胞体积增长至呈球形，细胞内开始积累虾青素，但此时细胞内主要的色素仍为叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素。细胞体积继续增大，雨生红球藻的光合作用效率降低，叶绿素含量维持不变，而叶黄素含量有少量增加，虾青素很快的累积后，细胞完全变红，当光合作用效率趋于最低时，虾青素含量达到最高。
虾青素（3,3’-二羟基，4，4’-二酮基，β，β’胡萝卜素），分子式为C40H52O4，是一种酮式类胡萝卜素，含有两个羟基和两个酮基，其天然产物以油脂的形式存在。雨生红球藻是公认自然界中生产天然虾青素的最好生物来源，在极佳的培养条件下，雨生红球藻的虾青素含量可达3%以上，远高于红酵母和其他微生物，被看作是天然虾青素的“浓缩品”。因此利用雨生红球藻提取虾青素，具有广阔的发展前景，极具大规模工业化生产潜力，已成为各国研究的热点。
目前，国内外从雨生红球藻中提取虾青素的方法主要有超临界CO2萃取、超声提取、微波提取、高压均质或研磨后溶剂萃取、酶解提取等，存在的主要问题为破壁效果差导致提取率低、所需设备昂贵，同时采用均质机进行破壁，破壁压力高，容易带来安全隐患，并且所需的超高压力不适宜进行工业化生产。
发明内容
为克服现有技术所存在的缺陷，本发明提供一种雨生红球藻的破壁方法，能够提高雨生红球藻的破壁效果，降低均质机的破壁压力，减少安全隐患。
本发明要解决其技术问题所采用的技术方案是：设计一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于按如下步骤依次进行：
1）在无菌环境中，取微藻样品加入到培养基A中培养18-25天，得到藻液；取上述藻液，按体积百分含量为11%-15%的接种量接种于培养基A中，在温度为22℃-24℃光照下的密闭培养箱中培养9-13天，得到藻液A；
2）将得到的藻液A以无菌水按一定倍数进行稀释，将稀释后的藻液均匀涂布于液体培养基B上，在温度为25℃光照下的密闭培养箱中继续培养8-11天，得到微藻液；
3）将上述微藻液进行沉淀处理，排除上清液；
4）将排除上清液的成熟细胞收集后放置在胶体磨进行一级磨碎；
5）将一级磨碎后的细胞传送至均质机中进行破壁处理，得到破壁的雨生红球藻。
将破壁后的雨生红球藻用有机溶剂在一定温度下搅拌提取，过滤，滤液浓缩，回收溶剂，得到虾青素。
步骤1）中所述的培养基A为NBBM培养基。
步骤2）中所述的液体培养基B按重量份数包括0.2-1.3份硝酸钠、0.02-0.08份硫酸镁、0.03-0.07份磷酸氢二钾、0.01-0.045份氯化钙、0.02-0.05份碳酸钠、0.004-0.0092份柠檬酸、0.004-0.0092份柠檬酸铁铵、0.0006-0.0009份乙二胺四乙酸、0.006-0.009份微量元素、6-50份葡萄糖。
步骤2）中所述的一定倍数是10-1、10-2、10-3、10-4。
所述的有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯或丙酮中的一种或几种。
所述的一定温度为45-55℃。
本发明所具有的有益效果是：
1、本发明通过胶体磨磨细胞，使雨生红球藻细胞壁变薄甚至细胞破碎，导致整个藻液粒
径均匀，降低均质机破壁压力，安全隐患得到降低。
2、通过胶体磨磨细胞能够延长均质机的使用寿命，降低设备耗材，节约成本。
3、通过胶体磨磨细胞不需要添加任何辅料，能够保留产品的原始成分不被破坏，食用更加安全。
4、所述的雨生红球藻的破碎率高，可以达到92%以上，破碎程度高且均匀、处理时间短。并且提取温度温和，有效成分损失率低于5%，提取方法简单，提取率高于95%
5、操作流程简单，操作方法方便，可以实现自动化连续生产，机械化程度高，适宜普及推广和工业化生产。
具体实施方式
实施例一
一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于按如下步骤依次进行：
1）在无菌环境中，取微藻样品加入到NBBM培养基中培养18天，得到藻液；取上述藻液，按体积百分含量为11%的接种量接种于NBBM培养基中，在温度为22℃光照下的密闭培养箱中培养9天，得到藻液A；
2）将得到的藻液A以无菌水按10-1、10-2、10-3、10-4倍数进行稀释，将稀释后的藻液均匀涂布于液体培养基B（按重量份数包括0.2份硝酸钠、0.02份硫酸镁、0.03份磷酸氢二钾、0.01份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.004份柠檬酸、0.004份柠檬酸铁铵、0.0006份乙二胺四乙酸、0.006份微量元素、6份葡萄糖）上，在温度为25℃光照下的密闭培养箱中继续培养8天，得到微藻液；
3）将上述微藻液进行沉淀处理，排除上清液；
4）将排除上清液的成熟细胞收集后放置在胶体磨进行一级磨碎；
5）将一级磨碎后的细胞传送至均质机中进行破壁处理，得到破壁的雨生红球藻，破壁率为92.1%。
将破壁后的雨生红球藻用乙醇在45℃下搅拌提取，过滤，滤液浓缩，回收溶剂，得到虾青素，虾青素的提取率为96.1%。
实施例二
一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于按如下步骤依次进行：
1）在无菌环境中，取微藻样品加入到NBBM培养基中培养22天，得到藻液；取上述藻液，按体积百分含量为13%的接种量接种于NBBM培养基中，在温度为23℃光照下的密闭培养箱中培养11天，得到藻液A；
2）将得到的藻液A以无菌水按10-1、10-2、10-3、10-4倍数进行稀释，将稀释后的藻液均
匀涂布于液体培养基B（按重量份数包括0.8份硝酸钠、0.05份硫酸镁、0.05份磷酸氢二钾、0.025份氯化钙、0.035份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.0007份乙二胺四乙酸、0.007份微量元素、25份葡萄糖）上，在温度为25℃光照下的密闭培养箱中继续培养9天，得到微藻液；
3）将上述微藻液进行沉淀处理，排除上清液；
4）将排除上清液的成熟细胞收集后放置在胶体磨进行一级磨碎；
5）将一级磨碎后的细胞传送至均质机中进行破壁处理，得到破壁的雨生红球藻，破壁率为92.6%。
将破壁后的雨生红球藻用乙酸乙酯在50℃下搅拌提取，过滤，滤液浓缩，回收溶剂，得到虾青素，虾青素的提取率为95.6%。
实施例三
一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于按如下步骤依次进行：
1）在无菌环境中，取微藻样品加入到NBBM培养基中培养25天，得到藻液；取上述藻液，按体积百分含量为15%的接种量接种于NBBM培养基中，在温度为24℃光照下的密闭培养箱中培养13天，得到藻液A；
2）将得到的藻液A以无菌水按10-1、10-2、10-3、10-4倍数进行稀释，将稀释后的藻液均匀涂布于液体培养基B（按重量份数包括1.3份硝酸钠、0.08份硫酸镁、0.07份磷酸氢二钾、0.045份氯化钙、0.05份碳酸钠、0.0092份柠檬酸、0.0092份柠檬酸铁铵、0.0009份乙二胺四乙酸、0.009份微量元素、50份葡萄糖）上，在温度为25℃光照下的密闭培养箱中继续培养8-11天，得到微藻液；
3）将上述微藻液进行沉淀处理，排除上清液；
4）将排除上清液的成熟细胞收集后放置在胶体磨进行一级磨碎；
5）将一级磨碎后的细胞传送至均质机中进行破壁处理，得到破壁的雨生红球藻，破壁率为93%。
将破壁后的雨生红球藻用丙酮在55℃下搅拌提取，过滤，滤液浓缩，回收溶剂，得到虾青素，虾青素的提取率为95.2%。   
    最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述
实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本
发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于按如下步骤依次进行：
1）在无菌环境中，取微藻样品加入到培养基A中培养18-25天，得到藻液；取上述藻液，按体积百分含量为11%-15%的接种量接种于培养基A中，在温度为22℃-24℃光照下的密闭培养箱中培养9-13天，得到藻液A；
2）将得到的藻液A以无菌水按一定倍数进行稀释，将稀释后的藻液均匀涂布于液体培养基B上，在温度为25℃光照下的密闭培养箱中继续培养8-11天，得到微藻液；
3）将上述微藻液进行沉淀处理，排除上清液；
4）将排除上清液的成熟细胞收集后放置在胶体磨进行一级磨碎；
5）将一级磨碎后的细胞传送至均质机中进行破壁处理，得到破壁的雨生红球藻。
2.根据权利要求1所述的一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于：将破壁后的雨生红球藻用有机溶剂在一定温度下搅拌提取，过滤，滤液浓缩，回收溶剂，得到虾青素。
3.根据权利要求2所述的一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于：步骤1）中所述的培养基A为NBBM培养基。
4.根据权利要求3所述的一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于：步骤2）中所述的液体培养基B按重量份数包括0.2-1.3份硝酸钠、0.02-0.08份硫酸镁、0.03-0.07份磷酸氢二钾、0.01-0.045份氯化钙、0.02-0.05份碳酸钠、0.004-0.0092份柠檬酸、0.004-0.0092份柠檬酸铁铵、0.0006-0.0009份乙二胺四乙酸、0.006-0.009份微量元素、6-50份葡萄糖。
5.根据权利要求4所述的一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于：步骤2）中所述的一定倍数是10-1、10-2、10-3、10-4  。
6.根据权利要求2或5所述的一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于：所述的有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯或丙酮中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于：所述的一定温度为45-55℃。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861311A (zh) * 2016-01-13 2016-08-17 浙江海洋学院 一种微量微藻细胞收集和破碎方法
CN113817793A (zh) * 2021-09-14 2021-12-21 国青(浙江)科学研究有限公司 一种叶黄素提高雨生红球藻中虾青素含量的生产工艺

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