CN104945629A - 还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物,其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一组还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其制备方法及应用。本发明采用脂肪烃基对聚乙烯亚胺进行疏水改性，并进一步二硫键交联，从而得到一组具有一定疏水性、还原敏感性（在肿瘤细胞内二硫键可被还原断裂）、及可生物降解的聚乙烯亚胺衍生物。本发明提供的聚乙烯亚胺衍生物具有的疏水性能提高了材料与生物膜的亲和力，能提高细胞摄取效率；分子内二硫键使材料具有还原环境响应性和生物降解性，核酸递送效率高且安全性好。本发明提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物递送DNA的转染效率和递送siRNA的靶基因沉默效率远远高于lipofectamine2000，毒性大大低于lipofectamine2000，是一种高效低毒的核酸递送载体，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，涉及一种聚合物载体材料，具体涉及还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其制备方法及应用。
背景技术
核酸治疗是治疗多种先天和后天疾病的一种有力工具，但是如何实现核酸药物安全有效的体内递送是核酸治疗的一大技术瓶颈。在众多核酸递送载体中，聚乙烯亚胺（PEI）由于具有较高的电荷密度（有效固缩核酸）和独特的胞内转运机制（胞内溶酶体逃逸）而被广泛研究。分子量为25KDa的分枝状PEI和In vivo jetPEITM(分子量为22KDa的直线型PEI)分别被认为是体外核酸递送和体内核酸递送的金标准。然而，未经化学改性的PEI存在转染活性-毒性的相互制约关系，即PEI分子量越大，转染活性越高，但同时毒性也越大。
为了平衡聚乙烯亚胺的毒性和转染活性，现在多采用结构修饰的方法对聚乙烯亚胺进行化学改性，如采用PLGA、肝素、透明质酸、PEG等对高分子量聚乙烯亚胺进行化学改性（参见Chumakova OV,et al,Cancer Lett.2008;261(2):215-225;Jeon O,et al,J.Control.Release2008;132(3):236-242;Jiang G,et al,Mol.Pharm.2009;6(3):727-737;Merkel OM,et al,Mol.Pharm.2009;6(4):1246-1260），提高其转染活性的同时降低毒性。中国专利号CN101704949A公开了名称为“丙烯酰胺类单体修饰的聚乙烯亚胺、制法和在基因传递中的应用”，该专利对分子量为25K的分枝状PEI修饰后，不仅提高了转染效率，而且大大降低了毒性。中国专利号CN102181053A公开了名称为“一种疏水基团修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其应用”的发明专利，该专利提供了一种酸敏感疏水改性的聚乙烯亚胺（分子量为9.5K-10.5K），该修饰方法增强了PEI与DNA的复合能力，且材料细胞毒性较低。
另外，采用交联剂将无细胞毒性的小分子量PEI交联形成二硫键、酯键、胺酯键、亚胺键连接的可降解PEI，交联后的小分子量PEI具有比母体PEI大大增强的核算递送效能，且交联的化学键在一定条件下水解或酶解，可降解为无细胞毒性的小分子量PEI，安全性高。最早俄亥俄州立大学的Robert J.Lee课题组用交联剂二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）DSP、二硫二丙二亚氨甲基醚（DTBP）分别与小分子量PEI(PEI800Da)交联得到DSP-PEI和DTBP-PEI，DSP-PEI和DTBP-PEI在中国仓鼠卵巢癌细胞（CHO）中具有与市售高分子量b-PEI25K相当的转染活性（参见Gosselin MA,et al,Bioconjug.Chem.2001,12:989-94）。德国的Manfred Ogris同样用DSP、DTBP、1,6己二醇二丙烯酸酯分别与小分子量的聚胺（亚精胺、精胺、三乙撑四胺、四乙撑五胺、五乙撑六胺、PEI800Da）交联，得到二硫键交联的IP-linked、SP-Linked，酯键交联的HD-Linked三类共计37个水溶性聚阳离子，其中酯键交联PEI800的OEI-HD-1的转染活性好于市售直线型PEI22K Da阳性对照（参见KloecknerJ,et al,Eur.J.Pharm.Sci.2006;29:414-25.）。中国专利号CN201110312946.8公开了名称为“一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺”的发明专利，该发明专利提供了一种由1,4-丁二醇氯甲酸酯交联得到的高效、低毒的氨酯键交联的小分子量PEI。中国专利号CN200610097858.X公开了名称为“可生物降解的交联聚乙烯亚胺及其应用”的发明专利，该发明专利采用各种二酸的缩水甘油酯、丙烯酸/甲基丙烯酸缩水甘油酯或各种多元醇或多元缩醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯中的一种或几种复合物为交联剂交联各种分子量的PEI，实现了对C6、MCF-7、3T3、A375、EL4、Hela、F10、A549等细胞高效、低毒的转染。
经专利查询及文献检索，目前国内外还没有将疏水修饰和交联剂交联两种方法同时应用来对聚乙烯亚胺进行改性以平衡其转染活性和毒性的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其在体内外的稳定性要好，转染效率高，且细胞毒性小。
此外，还需要提供一种还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备方法及其作为核酸载体的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其化学组成式为(R1-PEI)x-SS-(PEI-R2)y，化学组成式中两个PEI可以均为直线型PEI，或者均为分枝状PEI，或者一个为直线型PEI，一个为分枝状PEI，-SS-为二硫键，R1和R2各自独立选择为通式为H-(CH2)n-的基团，n选自0-14中的任意整数；其结构式为：
组成式和结构式中，x和y表示重复单元的个数，且x=1-120，y=1-120；R1、R2各自独立选择为通式为H-(CH2)n-的基团，n选自0-14中的任意整数，即R1、R2各自独立选择为氢原子、甲基、乙烷基、丙烷基、丁烷基、戊烷基、己烷基、庚烷基、辛烷基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，且该脂肪烃基来自相应卤代烃，优选的脂肪烃基是癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、和十四烷基；更优选的脂肪烃基是十二烷基；直线型聚乙烯亚胺的重均分子量为200-5000g/mol；分支状聚乙烯亚胺的重均分子量为1250-5000g/mol；优选的，直线型聚乙烯亚胺的重均分子量为800-4400g/mol，分枝状聚乙烯亚胺的重均分子量为1250-4400g/mol。
本发明的另一方面，提供了一种还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（如上所述）的制备方法，包括如下步骤：
（1）将聚乙烯亚胺溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，在30-40℃下搅拌溶解，得到聚乙烯亚胺溶液；
（2）将卤代烃溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，以一定速度（10-50ml/h）滴加至聚乙烯亚胺溶液中，在30-40℃下，避光反应12-48h；
（3）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于5-10ml蒸馏水中，然后用截留分子量为100-1000的透析袋进行透析，冷冻干燥后制得烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺；
（4）称取一定量冷冻干燥的聚乙烯亚胺或烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺，溶解于一定体积的甲醇溶液中，加入一定量的硫化丙烯，在氮气保护条件下60℃，避光反应24-48h；
（5）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入一定体积DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48-72h，然后用截留分子量为100-1000的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物；
当制备的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物中的R1或R2均选择为氢原子时，则省略烷基化修饰步骤1-3。
步骤（1）中，优选的聚乙烯亚胺与混合溶剂的比例为1g聚乙烯亚胺溶解于80-150ml混合溶剂中，二氯甲烷和甲醇混合溶剂的体积比为90:10-99:1；
步骤（2）中，所述加入脂肪烃基量与聚乙烯亚胺的摩尔比为，0:1-25:1；优选是0:1-20:1；更优选是0:1-15:1；最优选是0:1-12:1。
当与卤代烃反应的聚乙烯亚胺为直线型聚乙烯亚胺时，需在反应体系中添加一定量三乙胺；优选的，1g直线型聚乙烯亚胺需加入的三乙胺的体积为1-4ml；
用于第（4）步反应的聚乙烯亚胺的pH值需调节为7.2-7.4。
步骤（4）中，硫化丙烯与聚乙烯亚胺反应的摩尔比为2:1-15:1；优选的，硫化丙烯与聚乙烯亚胺反应的摩尔比为3:1-10:1;更优选的的摩尔比为5:1-8:1。
本发明的再一个方面，提供了上述还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为体内、体外核酸递送载体的应用。作为体内或体外核酸递送载体时，递送的质粒DNA的大小为1-30Kb；优选递送的siRNA的大小为15-30bp。
上述作为体内、体外核酸递送载体应用时，还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与核酸的质量比、脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸复合的孵育介质、体外递送时的血清浓度对转染效率和毒性有显著影响。优选的，脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸的质量比为1-30:1；优选质量比是1-20:1；更优选的质量比为3-10:1。
本发明提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为体外核酸递送载体的应用，其方法和步骤如下：
（1）细胞毒性评价
取对数生长期细胞，胰酶消化后用含血清培养基稀释后以一定密度接种于96孔培养板中，培养24h后，细胞融合度约达到85-90%，将不同浓度的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物材料与细胞在不含血清的培养基中共同培养4h后(每孔总体积为100μl)，吸弃旧培养基，每孔分别加入含0.5mg/ml的MTT的培养基继续培养4h后，吸弃溶液，加入150μl DMSO溶解甲臢结晶，然后用酶标仪测定各孔在570nm处的OD值，以未加聚合物溶液孔的OD值作为对照，计算各聚合物作用条件下细胞的存活率，每组实验设置3个重复孔。
（2）体外转染
取对数生长期细胞，胰酶消化后用含血清培养基稀释后以一定密度接种于96孔培养板中，培养24h后，细胞融合度约达到85-90%，开始转染。转染时，吸弃旧培养基，每孔用PBS洗涤两次后，每孔加入含有基因转染复合颗粒（还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与质粒DNA的复合物）的无血清培养基50μl（含质粒DNA约100ng），培养箱中培养4h后，加入含血清培养基125μl，继续培养20h后取出培养板，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，加入1×细胞裂解液20μl，37℃振摇15min后，取10μl裂解液加入50μl荧光素酶底物，用发光检测仪测定转染效率。
（3）体外基因沉默效率
取对数生长期的能稳定表达报告基因的细胞，胰酶消化后用含血清培养基稀释后以一定密度接种于96孔培养板中，培养24h后，细胞融合度约达到85-90%，开始递送siRNA实施基因沉默。递送siRNA时，吸弃旧培养基，每孔用PBS洗涤两次后，每孔加入含有siRNA与聚合物复合颗粒（还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与siRNA的复合物）的无血清培养基50μl（每孔添加siRNA10pmol），培养箱中培养4h后，吸弃旧培养基，加入新鲜含血清培养基100μl，继续培养20h后取出培养板，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，加入1×细胞裂解液20μl，37℃振摇15min后，取10μl裂解液加入50μl荧光素酶底物，以未添加siRNA聚合物复合颗粒的正常细胞作为阳性对照，用发光检测仪测定聚合物材料递送siRNA实施基因沉默的效率。
本发明提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为体内核酸递送载体的应用，其方法和步骤如下：
（1）取5-6周龄的的Balb/c小鼠，将小鼠随机分为3组，每组3只，3组分别尾静脉注射200μl还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与70μg荧光素酶质粒的复合物溶液、200μl未修饰PEI母体与70μg荧光素酶质粒的复合物溶液、200μl含有70μg裸荧光素酶质粒的生理盐水溶液，注射后24h，将小鼠用异氟烷麻醉，麻醉5min后，向小鼠腹腔注射200μl荧光素酶底物，10min后用小动物活体成像仪观察体内转染效果。
（2）取5-6周龄的的Balb/c小鼠，在第四乳腺垫处皮下接种小鼠来源的乳腺癌4T1细胞，待肿瘤体积达到150mm3时，将小鼠随机分为4组，每组6只，分别瘤内注射靶向survivin基因的siRNAsur与聚合物的复合颗粒、聚合物溶液、裸siRNAsur溶液、生理盐水，siRNA的给药剂量为450pmol/20g小鼠，给药方式为隔天注射一次，连续给药5次，在给药前一天开始称量小鼠体重，并测量肿瘤体积，隔天测定一次；于最后一次给药后的第6天处死小鼠，取肿瘤组织，称量瘤重，分别以监测的肿瘤体积、小鼠体重，和最后的瘤重为指标考察聚合物材料递送治疗性siRNA的体内抗肿瘤效果。
本发明的有益效果是，首先，采用烷基对聚乙烯亚胺进行化学改性可以提高聚乙烯亚胺的疏水性，改善其亲水亲油平衡值，提高材料与核酸固缩形成的复合粒子的稳定性；其次，脂肪烃基疏水改性后的聚乙烯亚胺与生物膜的亲和力大大增强，能提高细胞摄取量，进而提高转染效率；再次，在对小分子量聚乙烯亚胺烷基化疏水修饰聚乙烯亚胺的基础上，进一步巯基化修饰并实施二硫键交联，交联后聚乙烯亚胺的分子量增大，可以对核酸物质实施有效固缩或包裹，能大大提高聚合物与核酸颗粒形成的复合颗粒的稳定性，并且分子内的二硫键具有还原环境响应性，在胞内被谷胱甘肽还原酶降解为几乎无毒性的小分子量聚乙烯亚胺，可以实现核酸物质的胞内有效释放，快速发挥生物学效应。本发明提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物递送质粒DNA的转染效率和递送siRNA的靶基因沉默效率远远高于市售lipofectamine2000，毒性大大低于lipofectamine2000，是一种高效低毒的核酸递送载体，具有较好的应用前景。
为了详细说明本发明及其特点，下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。应当指出的是，这些实施例仅用于具体说明本发明而不是作为本发明专利范围的限制。
附图说明
图1是实施例5的合成路线。
图2是实施例1中制备所得的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（bPEI1800-SS-5）的1H-NMR图谱。
图3是实施例4中制备所得还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（lPEI2200-SS-5）的1H-NMR图谱。
图4是实施例5中制备所得还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（lPEI2200-C12-5.28-SS-5）的1H-NMR图谱。
图5是试验例1的细胞毒性柱状图。
图6是试验例2的体外基因转染效率柱状图。
图7是试验例3的体外基因沉默效率柱状图。
图8是试验例4的体内递送质粒DNA的小动物活体成像图。
具体实施方式：
材料来源：分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺bPEI1800（纯度≥99%，Alfa Aesar天津化学有限公司）；分子量为5000的聚(2-乙基-2-噁唑啉)PEOZs（Alfa Aesar天津化学有限公司）；分子量为50000的聚(2-乙基-2-噁唑啉)PEOZs（Alfa Aesar天津化学有限公司）；1-溴癸烷（纯度≥98%，美国sigma公司）、1-溴十二烷（纯度≥99%，美国sigma公司）、1-溴十四烷（纯度≥97%，美国sigma公司）；硫化丙烯（纯度≥96%，美国sigma公司）
制备例1：分子量为2200的直线型PEI（lPEI2200）的制备
目前，直线型lPEI2200没有市售产品，因此我们以分子量为5000的聚(2‐乙基‐2‐噁唑啉)PEOZ为前体，采用酸水解法脱去其丙酰基得到分子量为2200的lPEI2200，制备方法如下：称取分子量为5000的聚(2‐乙基‐2‐噁唑啉)PEOZ约3g置于250ml圆底烧瓶中，加入24%(wt/vol)的盐酸溶液120ml，110℃油浴回流96h，然后中止反应，待反应体系冷至室温，布氏漏斗减压抽滤该反应体系，得白色滤饼，将白色滤饼室温风干，即得lPEI2200。
制备例2：分子量为22000的直线型PEI（lPEI22000）的制备
我们以分子量为50000的聚(2‐乙基‐2‐噁唑啉)PEOZ为前体，采用酸水解法脱去其丙酰基得到分子量为22000的lPEI22000，制备方法如下：称取分子量为50000的聚(2‐乙基‐2‐噁唑啉)PEOZ约3g置于250ml圆底烧瓶中，加入24%(wt/vol)的盐酸溶液120ml，110℃油浴回流96h，然后中止反应，待反应体系冷至室温，布氏漏斗减压抽滤该反应体系，得白色滤饼，将白色滤饼室温风干，即得lPEI22000。
制备例3：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺（bPEI1800-C12-12.5）的制备
（1）称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI1800）1g，溶于100ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为95:5)的混合溶剂中，在30℃下搅拌溶解；
（2）称取1-溴十二烷0.7245g溶于50ml的二氯甲烷和甲醇(两者体积比为95:5)的混合溶剂中，以10ml/h的速度滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40℃下，避光反应24h；
（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂得到淡黄色半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于6ml蒸馏水中，然后用截留分子量为1000的透析袋先在40%的乙醇溶液中透析6次，再在去离子水中透析24h，将透析后得到的物质冷冻干燥48h后，制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺（bPEI1800-C12-12.5）。
制备例4：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺（bPEI1800-C12-19.72）的制备
（1）称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI1800）1g，溶于100ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为95:5)的混合溶剂中，在30℃下搅拌溶解；
（2）称取1-溴十二烷1.1430g溶于50ml的二氯甲烷和甲醇(两者体积比为95:5)的混合溶剂中，以10ml/h的速度滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40℃下，避光反应24h；
（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂得到淡黄色半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于6ml蒸馏水中，然后用截留分子量为1000的透析袋先在40%的乙醇溶液中透析6次，再在去离子水中透析24h，将透析后得到的物质冷冻干燥48h后，制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺（bPEI1800-C12-19.72）。
制备例5：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺（lPEI2200-C12-5.28）的制备lPEI2200-C12的制备方法与本专利实施例5中的步骤1-3相似，具体如下：
（1）称取分子量为2200的直线型聚乙烯亚胺（lPEI2200）1g，置于100ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中（二氯甲烷与甲醇的体积比为90:10），加入2ml三乙胺，在40℃下搅拌溶解；
（2）称取1-溴十二烷0.306g溶于50ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中（二氯甲烷与甲醇的体积比为90:10），以一定速度（15ml/h）滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40℃下，避光反应36h；
（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂，用截留分子量为1000的透析袋先在50%的乙醇溶液中透析5次，每次透析时间为8h，再在去离子水中透析24h，冷冻干燥48h后制得烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺（lPEI2200-C12-5.28）。
实施例1：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备（bPEI1800-SS-5）
（1）称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI1800）0.56mmol，溶于5ml去离子水中，用0.5mol/L HCl调整pH至7.2，冷冻干燥48h后，全量溶解于30ml甲醇溶液中，加入2.78mmol硫化丙烯，在氮气保护条件下60℃，避光反应24h；
（2）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入30ml DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48h，然后用截留分子量为1000的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，透析时间为36h，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（bPEI1800-SS-5）。
取冻干后的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（bPEI1800-SS-5）约15mg溶解于约0.6ml重水中，采用400MHz的核磁共振氢谱（1H-NMR）进行结构确认，结果见附图2。从附图2中可知，化学位移1.30ppm处的峰归属于硫化丙烯开环产生的（-CH3），与bPEI1800在2.5-2.8ppm出的宽多峰相比，二硫键交联后的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（bPEI1800-SS-5）在低场2.8-3.2ppm处出现的新宽峰归属于与二硫键中的硫原子相近的次亚甲基上的氢，以上峰归属表明硫化丙烯已经成功开环，并通过二硫键将bPEI1800成功交联。
实施例2：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备（bPEI1800-C10-12.5-SS-5）
（1）称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI1800）0.56mmol，溶于100ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂（二氯甲烷与甲醇的体积比为90:10）中，在30-40℃下搅拌溶解；
（2）称取1-溴癸烷2.9mmol溶于50ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂（二氯甲烷与甲醇的体积比为90:10）中，以一定速度（20ml/h）滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在30-40℃下，避光反应24h；
（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂，用截留分子量为1000的透析袋先在50%的乙醇溶液中透析5次，每次8h，再在去离子水中透析24h，冷冻干燥48h后制得烷基化疏水修饰的的聚乙烯亚胺（bPEI1800-C10-12.5）；
（4）称取上述制备的冷冻干燥的烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺（bPEI1800-C10-12.5）0.56mmol，溶于30ml的甲醇溶液中，加入硫化丙烯2.78mmol，在氮气保护条件下60℃，避光反应24h；
（5）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入30ml DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48h，然后用截留分子量为1000的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，透析时间为48h，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（bPEI1800-C10-12.5-SS-5）。
实施例3：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备（bPEI1800-C12-19.72-SS-2.11）
（1）称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI1800）0.56mmol，溶于100ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中（二氯甲烷与甲醇的体积比为95:5），在30-40℃下搅拌溶解；
（2）称取1-溴十二烷4.58mmol溶于50ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中（二氯甲烷与甲醇的体积比为95:5），以一定速度（15ml/h）滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在30-40℃下，避光反应24h；
（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂，用截留分子量为1000的透析袋先在50%的乙醇溶液中透析5次，每次透析时间为8h，再在去离子水中透析24h，冷冻干燥48h后制得烷基化疏水修饰的的聚乙烯亚胺（bPEI1800-C12-19.72）；
（4）称取烷基化疏水修饰的的聚乙烯亚胺（bPEI1800-C12-19.72）1mmol，溶于30ml甲醇溶液中，加入硫化丙烯2.11mmol，在氮气保护条件下60℃，避光反应24h；
（5）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入30ml DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48h，然后用截留分子量为1000的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，透析时间为36h，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（bPEI1800-C12-19.72-SS-2.11）。
实施例4：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备（lPEI2200-SS-5）
（1）称取分子量为2200的直线型聚乙烯亚胺（lPEI2200）1mmol，置于30ml甲醇溶液中，加入2ml三乙胺，振摇溶解，加入硫化丙烯5mmol，在氮气保护条件下60℃，避光反应24h；
（2）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入30ml DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48h，然后用截留分子量为1000的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，透析时间为48h，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（lPEI2200-SS-5）。
取冻干后的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（lPEI2200-SS-5）约15mg溶解于约0.6ml重水中，采用400MHz的核磁共振氢谱（1H-NMR）进行结构确认，结果见附图3。从附图3中可知，化学位移1.20-1.40ppm处的多重峰归属于硫化丙烯开环产生的（-CH3），2.75ppm为lPEI2200母体的单峰，3.1-3.3ppm处的宽多重峰表示与二硫键相近的次亚甲基和甲基上的氢的化学位移，以上峰归属表明硫化丙烯已经成功开环，并通过二硫键将lPEI2200成功交联。
实施例5：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备（lPEI2200-C12-5.28-SS-5）
（1）称取分子量为2200的直线型聚乙烯亚胺（lPEI2200）0.45mmol，置于100ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中（二氯甲烷与甲醇的体积比为90:10），加入2ml三乙胺，在35℃下搅拌溶解；
（2）称取1-溴十二烷1.23mmol溶于50ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中（二氯甲烷与甲醇的体积比为90:10），以一定速度（15ml/h）滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在35℃下，避光反应24h；
（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂，用截留分子量为1000的透析袋先在50%的乙醇溶液中透析5次，每次透析时间为8h，再在去离子水中透析24h，冷冻干燥48h后制得烷基化疏水修饰的的聚乙烯亚胺（lPEI2200-C12-5.28）；
（4）称取烷基化疏水修饰的的聚乙烯亚胺（lPEI2200-C12-5.28）1mmol，溶于30ml甲醇溶液中，加入硫化丙烯5mmol，在氮气保护条件下60℃，避光反应24h；
（5）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入30ml DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48h，然后用截留分子量为1000的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，透析时间为36h，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（lPEI2200-C12-5.28-SS-5）。
取冻干后的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（lPEI2200-C12-5.28-SS-5）约15mg溶解于约0.6CDCl3中，采用400MHz的核磁共振氢谱（1H-NMR）进行结构确认，结果见附图4。从附图4中可知，化学位移0.88ppm处的峰归属于十二烷基中的甲基峰，化学位移1.28ppm处的峰归属于十二烷基中的（-(CH2)11-），化学位移3.04ppm归属于lPEI2200母体中的氢，化学位移3.556ppm处的峰表示与二硫键相近的次亚甲基和甲基上的氢的化学位移，以上峰归属表明依照实施例5成功制备得到了十二烷基疏水化修饰且经二硫键交联的聚乙烯亚胺（lPEI2200-C12-5.28-SS-5）。
实施例6：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备（lPEI2200-C14-15-SS-8）
（1）称取分子量为2200的直线型聚乙烯亚胺（lPEI2200）0.45mmol，置于100ml的混合溶剂中（二氯甲烷与甲醇的体积比为95:5），加入2ml三乙胺，在30-40℃下搅拌溶解；
（2）称取1-溴十四烷3.49mmol溶于50ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中（二氯甲烷与甲醇的体积比为95:5），以一定速度（15ml/h）滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在30-40℃下，避光反应48h；
（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂，用截留分子量为1000的透析袋先在50%的乙醇溶液中透析5次，每次透析时间为8h，再在去离子水中透析24h，冷冻干燥48h后制得烷基化疏水修饰的的聚乙烯亚胺（lPEI2200-C14-15）；
（4）称取烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺（lPEI2200-C14-15）1mmol，溶于30ml甲醇溶液中，加入硫化丙烯8mmol，在氮气保护条件下60℃，避光反应48h；
（5）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入30ml DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48h，然后用截留分子量为1000的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，透析时间为48h，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（lPEI2200-C14-15-SS-8）。
实施例7：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备（(lPEI2200-C12-10)-SS-7-lPEI2200）
（1）称取实施例5步骤（3）中制备得到的烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺（lPEI2200-C12）0.5mmol，另外再称取0.5mmol的lPEI2200，一起溶于60ml甲醇溶液中，加入硫化丙烯7mmol，在氮气保护条件下60℃，避光反应48h；
（2）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入30ml DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48h，然后用截留分子量为1000的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，透析时间为48h，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（(lPEI2200-C12-10)-SS-7-lPEI2200）。
表1总结了实施例1-7及下述生物学实验中所用到的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物制备时各原料的投料量、反应产物代号。
表1制备还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物时各原料的投料量、反应产物代号
注：“#”表示该行的投料比例并未体现在实施例中，但是生物学实验中用到了该产物；“/”表示不添加；*还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的化学组成式为：(PEI-R1)x-SS-(PEI-R2)y，当R1和R2选择为同一基团时，该化学组成式简写为PEI-R1-m-SS-n，其中，m表示C12的理论取代度，即通过反应原料的投料比例计算而得，n表示投料时硫化丙烯与PEI的摩尔比，代表二硫键的交联度。
烷基化试剂名称中：C10表示1-溴癸烷，C12表示1-溴十二烷；C14表示1-溴十四烷。
生物学试验：
试验例1-4中所用的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物均由实施例1-6制备而得，具体投药量见表1。简便起见，下述试验例1-4的附图中所用各还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物均以bPEI1800-C12-m-SS-n或lPEI2200-C12-m-SS-n表示，其中，m表示C12的理论取代度，即通过反应原料的投料比例计算而得，n表示投料时硫化丙烯与PEI的摩尔比，代表二硫键的交联度。以bPEI1800-C12-19.72-SS-2.11为例加以说明，19.72表示bPEI1800-C12中C12的取代度为19.72%；2.11表示巯基化反应时，硫化丙烯与bPEI1800-C12投料时的摩尔比为2.11。
为了全面评价本发明专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的安全性和有效性，我们不仅选择分子量为22000的直线型PEI(lPEI22000，其制备方法见制备例2)和市售转染试剂脂质体2000(lipofectamine2000)作为对照，还把本专利提供的PEI衍生物与之前申报的同类发明专利（发明名称：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺、制备方法及应用；专利号：201310244851.6）提供的烷基化修饰PEI进行比较。烷基化修饰PEI的制备方法详见制备例3-5。
试验例1：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的细胞毒性评价试验
将小鼠黑色素瘤B16细胞以4×103/孔密度接种于96孔板中，培养24h后，吸弃旧培养基，分别加入含系列浓度（4、6.67、13.44、20μg/ml，）的各还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的无血清RPMI1640培养基100μl，继续培养4h后，吸弃旧培养基，每孔分别加入含0.5mg/ml的MTT的培养基继续培养4h后，吸弃溶液，加入150μl DMSO溶解甲臢结晶，然后用酶标仪测定各孔在570nm处的OD值，以未加聚合物溶液孔的OD值作为对照，计算各聚合物作用条件下细胞的存活率，每组实验设置3个重复孔。结果见附图5及表2。
从附图5及表2可以看出，与未修饰的PEI母体（bPEI1800和lPEI2200）相比，修饰后的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物对B16细胞的毒性与未修饰的母体相当，当作用浓度低于13.34μg/ml时，还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物对B16细胞几乎无毒性。并且还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的细胞毒性比同浓度的烷基化修饰的PEI（如bPEI1800-C12-12.5和bPEI1800-C12-19.72）低，说明本专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物在安全性方面比烷基化修饰PEI具有优势。
表2还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的细胞毒性(平均值±S.D.)
注：“4μg/ml、6.67μg/ml、13.34μg/ml”表示各样品作用细胞的终浓度。
试验例2：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的体外基因转染
将B16细胞以4×103/孔的密度接种于96孔中，培养24h后细胞融合度约达到85-90%，开始转染。将各还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与质粒pGL4.50(表达萤火虫荧光素酶，购自Promega公司)以不同质量比（3:1、5:1、10:1、15:1）在HBS缓冲液中等体积混合形成复合物（质粒DNA的浓度固定为20ng/μl），室温孵育30min。吸弃96孔板中的旧培养基，用PBS洗涤2次，每孔加入40μl含10%血清或无血清的RPMI1640培养基，然后每孔加入含有100ng pGL4.50的基因转染复合颗粒溶液10μl，培养4h后，每孔加入125μl含10%血清的RPMI1640培养基，继续培养20h后，取出培养板，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，每孔加入1×细胞裂解液20μl，37℃振摇15min后，每孔取10μl裂解液加入50μl荧光素酶底物，用发光检测仪测定转染效率，计算每孔荧光素酶的表达。分别以lipofectamine2000和分子量为22K的直线型PEI（lPEI22K）作为阳性对照。结果见附图6及表3。
从附图6及表3可知，本发明专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物体外转染荧光素酶质粒DNA的效率均显著高于未修饰PEI母体（bPEI1800和lPEI2200），并且lPEI2200-SS-5与质粒DNA的质量比分别为3:1和5:1时的体外基因转染效率比市售转染试剂脂质体2000（lipofectamine2000）和另一种阳性对照lPEI22000均高；与烷基化修饰的PEI（如bPEI1800-C12-12.5、bPEI1800-C12-19.72、lPEI2200-C12-5.28）相比，lPEI2200-SS-5的转染效率均比同条件下的这三种烷基化修饰的PEI高，说明本专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物是一类高效的体外转染材料，具有很高的应用价值。
表3还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的体外基因转染效率(平均值±S.D.)
注：“3to1、5to1、10to1、15to1”表示各样品与质粒pGL4.50的质量比。
试验例3：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的报告基因沉默效率
将能稳定表达荧光素酶报告基因luciferase的细胞（4T1luc）以4×103/孔的密度接种于96孔中，培养24h后细胞融合度约达到85-90%，开始实施基因沉默。将各还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与靶向luciferase的siRNAluc（购自上海吉玛制药技术有限公司)以不同质量比（2.5:1、3.75:1、5:1）在HBG缓冲液中等体积混合形成复合物，室温孵育30min。吸弃96孔板中的旧培养基，用PBS洗涤2次，每孔加入40μl含10%血清或无血清的RPMI1640培养基，然后每孔加入含有10pmol siRNAluc的复合颗粒溶液10μl，培养4h后，吸弃旧培养基，每孔加入100μl含10%血清的RPMI1640培养基，继续培养20h后，取出培养板，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，每孔加入1×细胞裂解液20μl，37℃振摇15min后，每孔取10μl裂解液加入50μl荧光素酶底物，用发光检测仪测定转染效率，计算每孔荧光素酶的表达。分别以lipofectamine2000和分子量为22K的直线型PEI（lPEI22K）作为阳性对照。结果见附图7及表4。
从附图7及表4可知，与未修饰PEI母体（bPEI1800和lPEI2200）相比，本发明专利提供的一组还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物体外递送siRNA沉默报告基因（靶基因）的效率均大大提高，并且lPEI2200-SS-5体外递送siRNA甚至可以100%抑制靶基因的表达，其靶基因沉默效率显著高于市售试剂脂质体2000（lipofectamine2000），且其靶基因沉默效率比同质量比条件下的烷基化修饰PEI（如bPEI1800-C12-19.72、lPEI2200-C12-5.28）高，说明本专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物是一类高效的体外递送siRNA的材料，具有较高的市场化前景。
表4还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的报告基因沉默效率(平均值±S.D.)
注：“2.5to1、3.75to1、5to1”表示各样品与siRNAluc的质量比。
试验例4：还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物体内递送质粒DNA的效率
取5-6周龄的的Balb/c小鼠，将小鼠随机分为2组，每组3只，各组分别尾静脉注射200μl还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物lPEI2200-SS-5（即通过实施例4制备得到的产物）与70μg荧光素酶质粒的复合物溶液、200μl含有70μg裸荧光素酶质粒的生理盐水溶液，注射后24h，将小鼠用异氟烷麻醉，麻醉5min后，向小鼠腹腔注射200μl荧光素酶底物，10min后用小动物活体成像仪观察体内转染效果。结果见附图8（每组分别选取一只代表性小鼠拍照）。
在附图8中，a1表示尾静脉注射裸荧光素酶质粒组的小鼠，a2表示尾静脉注射还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物lPEI2200-SS-5与荧光素酶质粒复合物组的小鼠。由图8可知，裸荧光素酶质粒只能在注射部位局部表达；而还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物lPEI2200-SS-5可以成功将荧光素酶质粒递送入小鼠体内，并在小鼠体内高效表达。附图8的结果表明本专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物可以成功地实现质粒DNA的体内递送及高效表达，具有较高的体内应用的开发前景。
Claims (10)
1.一种还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，其化学组成式为：(R1-PEI)x-SS-(PEI-R2)y，化学组成式中两个PEI均为直线型PEI，或者均为分枝状PEI，或者一个为直线型PEI，一个为分枝状PEI，-SS-为二硫键，R1和R2各自独立选择为通式为H-(CH2)n-的基团，其中n选自0-14中的任意整数。
其结构式为：
组成式和结构式中，x和y表示重复单元的个数，且x=1-120，y=1-120；R1、R2基团各自独立选择为通式为H-(CH2)n-的基团，n选自0-14中的任意整数；其中直线型聚乙烯亚胺的重均分子量为200-5000g/mol；分支状聚乙烯亚胺的重均分子量为1250-5000g/mol。
2.根据权利要求1所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，R1、R2基团各自独立选择为氢原子、甲基、乙烷基、丙烷基、丁烷基、戊烷基、己烷基、庚烷基、辛烷基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基。
3.根据权利要求1或2所述的的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将聚乙烯亚胺溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，在30-40℃下搅拌溶解，得到聚乙烯亚胺溶液；
（2）将卤代烃溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，以一定速度滴加至聚乙烯亚胺溶液中，在30-40℃下，避光反应12-48h；
（3）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于5-10ml蒸馏水中，然后用一定截留分子量的透析袋进行透析，冷冻干燥后制得烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺；
（4）称取一定量冷冻干燥的聚乙烯亚胺或烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺，溶解于一定体积的甲醇溶液中，加入一定量的硫化丙烯，在氮气保护条件下60℃，避光反应24-48h；
（5）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入一定体积DMSO溶解该膏状物后，室温避光反应48-72h，然后用一定截留分子量的透析袋透析该反应液，透析介质为去离子水，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物；
当制备的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物中的R1或R2均选择为氢原子时，则省略烷基化修饰步骤1-3。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，二氯甲烷和甲醇混合溶剂的体积比为90:10-99:1；脂肪烃基与聚乙烯亚胺的摩尔比为0:1-12:1。
5.根据权利要求3或4中任一项的制备方法，其特征在于，当与卤代烃反应的聚乙烯亚胺为直线型聚乙烯亚胺时，需在反应体系中添加一定量三乙胺；用于第（4）步反应的聚乙烯亚胺的pH值需调节为7.2-7.4。
6.根据权利要求3、4或5所述的制备方法，其特征在于，硫化丙烯与聚乙烯亚胺反应的摩尔比为2:1-15:1。
7.根据权利要求1-2任一项所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的在作为体内或体外核酸递送载体的应用。
8.根据权利要求7的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，递送的质粒DNA的大小为1-30Kb。
9.根据权利要求7的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，递送的siRNA的大小为15-30bp。
10.根据权利要求7的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与核酸的质量比为1-30:1。
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| Van der Ende et al. | “Click” reactions: novel chemistries for forming well-defined polyester nanoparticles | |
| Kronek et al. | In vitro bio-immunological and cytotoxicity studies of poly (2-oxazolines) | |
| Sun et al. | Doxorubicin conjugate of poly (ethylene glycol)‐block‐polyphosphoester for cancer therapy | |
| Mangold et al. | PEG-based multifunctional polyethers with highly reactive vinyl-ether side chains for click-type functionalization | |
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| Linker et al. | Ester functional epoxide monomers for random and gradient poly (ethylene glycol) polyelectrolytes with multiple carboxylic acid moieties | |
| Duan et al. | Synthesis and characterization of a multiarm poly (acrylic acid) star polymer for application in sustained delivery of cisplatin and a nitric oxide prodrug | |
| Li et al. | A pH‐responsive polymer linked with immunomodulatory drugs: synthesis, characteristics and in vitro biocompatibility |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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