CN104945374A - 用于预防或治疗烟碱成瘾的缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明部分地涉及式(III)的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物，其中m、n、W、-(间隔基)-、X*和Y如说明书中所定义。在某些实施方案中，所述烟碱衍生的半抗原-载体缀合物可用于制备用于治疗和/或预防烟碱成瘾的疫苗。

Description

用于预防或治疗烟碱成瘾的缀合物
本申请是2011年6月3日提交的发明名称为“用于预防或治疗烟碱成瘾的缀合物”的第201180027358.8号中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及烟碱衍生的半抗原、半抗原-间隔基缀合物和半抗原-载体缀合物，其作为抗烟碱疫苗中的抗原性组分。本发明也涉及用佐剂配制的含有所述烟碱衍生的半抗原-载体缀合物抗原的疫苗组合物。所述组合物用于提高戒烟和烟草/烟碱依赖性治疗努力的戒烟率或减少复吸率。
背景技术
吸烟对健康有许多严重的不良作用且由于许多减少或防止吸烟的政府倡议，吸烟已经变得越来越不为社会所接受。因此，每年有许多吸烟者希望戒烟，并同时作出尝试，但只有少数完成戒烟者不复吸。非常高的失败率是烟碱成瘾性加上香烟容易取得的结果。
随着吸烟，或使用其他形式的烟碱(例如，窦道、贴片、口香糖)，烟碱进入血流中且之后迅速进入脑中，其在脑中刺激烟碱乙酰胆碱受体，造成多巴胺的释放，其转而活化奖赏中心。随着戒烟尝试，有奖赏(reward)反应的损失，以及包括认知功能下降的戒断症状。复吸的主要原因是奖赏的损失和令人不快的戒断症状可因吸烟而立即解除。
有各种用于戒烟的非疫苗疗法。烟碱替代疗法如含有烟碱的口香糖或皮肤贴片，可以帮助戒除吸烟者隔断香烟，但他们不破坏烟碱导致成瘾周期。另一种方法是使用针对烟碱乙酰胆碱受体的药物，如伐尼克兰。此类药物，降低由吸烟通常遇到的奖赏，已比较成功地帮助戒烟，然而药物治疗结束之后复吸率都很高，因为失效(例如，吸单次烟)可以很容易地转成完全复吸与再活化奖赏中心。
最近的烟碱戒除战略重点在于疫苗，其刺激免疫系统产生结合血液中的烟碱的抗烟碱抗体，从而减少烟碱可以进入脑的量和比率。这转而防止奖赏中心被活化和帮助破坏成瘾周期。因为由疫苗诱发的抗体可长期存活，所以抗烟碱疫苗对于协助戒烟以及预防复吸是有用的。此外，因为抗体作用于周边，所以没有中枢神经系统(CNS)副作用的风险。此类疫苗的实例描述于WO 00/32239、WO 02/49667、WO 03/82329和US 2006/111271中。烟碱衍生物描述于EP-A-421762、WO 01/70730、WO 01/80844和US2005/119480中。此外烟碱衍生物已确认为注册号136400-02-7、250683-10-4、861023-80-5和861025-04-9。烟碱半抗原描述于WO 99/61054、WO 02/58635、WO 03/82329、WO 2005/40338和EP-A-1849780中。
发明内容
本发明涉及烟碱衍生的半抗原、半抗原-间隔基缀合物以及可用于制备免疫原性半抗原-载体缀合物的缀合方法，所述免疫原性半抗原-载体缀合物用于为了提高戒烟治疗努力的戒烟率或降低复吸率而设计的疫苗。本发明也涉及含有上述缀合物以及佐剂或赋形剂的疫苗制剂，其用于免疫接种吸烟者以便引起针对所述半抗原的抗体，其转而识别和特异性结合烟碱。本发明进一步涉及一种在戒烟治疗努力中提高戒烟率或减少复吸率的方法，其包括将半抗原-载体缀合物给予希望戒烟的吸烟者。在其他实施方案中，疫苗可用于非吸烟者，以防止他们对烟碱上瘾，如果他们随后因吸烟或其他手段而暴露于烟中。
本发明烟碱衍生的半抗原-载体缀合物的优点为：它们比本领域中已知的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物更具有免疫原性、更具特异性、更稳定、或具有其他更有用的性质。
本发明烟碱衍生的半抗原-载体缀合物用于抗烟碱疫苗中可以为比其他已知烟碱衍生的半抗原-载体缀合物更具免疫原性的抗原。同样，包含本发明烟碱衍生的半抗原-载体缀合物作为抗原以及佐剂的疫苗制剂可比其他其通常添加佐剂氢氧化铝的抗烟碱疫苗制剂更具免疫原性，且导致依赖于烟碱/烟草和希望戒烟的患者较高戒烟率和较低复吸率。由于抗原内较好的固有免疫原性，以及通过佐剂增强，本发明的疫苗制剂也可更快速和用更少的剂量达成较高的抗烟碱抗体效价，相对于现有技术中已知的疫苗制剂，产生改良的顺应性。
本发明烟碱衍生的半抗原化合物的合成路径的优点为：它们提供增加的总合成收率(优选增加总合成收率多达20倍)，包括合成步骤数的减少、导致所产生的烟碱衍生的半抗原的纯度增加(例如>99％纯度)或具有其他比现有技术中已知的合成路径更有用的性质。
附图说明
图1显示用包含本发明烟碱衍生的半抗原-缀合物与佐剂的疫苗免疫接种小鼠在不同的时间点对血浆中抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4、7、8和12)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG24555(含有免疫刺激CpG基序(motif)的21-元(mer)TLR9激动剂)(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。
图2显示用含有包含本发明半抗原的缀合物抗原的抗烟碱疫苗免疫接种小鼠在不同的时间点对所产生的抗烟碱抗体在血浆中的亲和性的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4、7、8和12)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。亲和性指数对应于从烟碱-BSA涂覆板洗脱50％的抗烟碱抗体所需要的硫氰酸铵的浓度，且较高浓度的要求表示具有较高的亲和性的抗体。
图3显示用含有包含本发明半抗原的缀合物抗原的抗烟碱疫苗免疫接种小鼠对静脉内(IV)给予的3H-烟碱在脑和血液中的分布的影响。通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4、7、8和12)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝6每组)免疫接种。在最后激发(boost)2周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定3H的血浆/脑的比例。
图4显示用得自本发明半抗原的疫苗免疫接种小鼠后与抗烟碱抗体的烟碱的相互作用。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4、7、8和12)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。在最后激发2周之后，以竞争ELISA证明抗烟碱抗体与烟碱之相互作用。
图5显示用含有本发明半抗原的疫苗免疫接种小鼠之后抗烟碱抗体的特异性。通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4和12)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。在最后激发2周之后，抗烟碱抗体对对烟碱、可替宁、乙酰胆碱和伐尼克兰的特异性以竞争ELISA测量。
图6显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中的抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备4；5'氨基丙基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱IgG Ab水平。
图7显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠对血浆中抗烟碱抗体的水平和亲和性及对血浆和脑中3H-烟碱的分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备4；5'氨基丙基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。在第三次免疫接种2周之后，以ELISA测量血浆中的抗烟碱IgG Ab水平及以硫氰酸铵分析测量亲和性。通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱包含3μCi3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定3H的血浆/脑的比例。
图8显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中抗烟碱抗体的水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备12；5'氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。
图9显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠对血浆中抗烟碱抗体的水平和亲和性及对血浆和脑中3H-烟碱的分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备12；5'氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。在第三次免疫接种2周之后，以ELISA测量血浆中的抗烟碱IgG Ab水平及以硫氰酸铵分析测量亲和性。通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定3H之血浆/脑的比例。
图10显示本发明半抗原-载体缀合物的丁二酰化在不同的时间点对血浆中抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)且缀合物使用2种不同条件制备(各为有或没有丁二酸酐步骤)的烟碱衍生的半抗原(制备4；5'氨基丙基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。
图11显示本发明半抗原-载体缀合物的丁二酰化对3H-烟碱在血液和脑中的分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)且缀合物使用2种不同条件制备(各为有或没有丁二酸酐步骤)的烟碱衍生的半抗原(制备4；5'氨基丙基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。在最后激发2周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H在脑和血浆中的水平。
图12显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)或CRM197(10μg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备12；5'氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。
图13显示用抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠对3H-烟碱在小鼠中的分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)或CRM197(10μg)的烟碱衍生的半抗原(制备12；5'氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。在第三次免疫接种二周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定相对于对照组动物的3H-烟碱在脑中的％改变。
图14显示用抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中的抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)或CRM197(10μg)的烟碱衍生的半抗原(制备12；5'氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。评估不同半抗原装载的范围。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。
图15显示用抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠对小鼠中的3H-烟碱分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT；10μg)或CRM197(10μg)的烟碱衍生的半抗原(制备12；5'氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。评估不同半抗原装载的范围。在第三次免疫接种二周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定相对于对照组动物的3H-烟碱在脑中的％改变。
图16-18显示用抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中的抗烟碱抗体水平和亲和性的影响。通过肌肉内接种，用缀合于CRM197(10μg)的烟碱衍生的半抗原(制备12；5'氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下或者在ISCOMATRIX(IMX；0.1-3.0单位)存在下，将BALB/c小鼠(n＝10每组)免疫接种。以ELISA(第21和28天)测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)和以抑制ELISA测量亲和性。图16[i]显示第1次剂量3周后的结果；且[ii]显示示第2次剂量1周后的结果。图17显示在第二次剂量一周后的亲和性(IC50)。图18显示烟碱在血浆中的螯合(上)；烟碱吸收于脑中(下)。
图19和20显示表6的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物的缀合条件对抗烟碱抗体水平和对应IC50值的影响。通过肌肉内接种，用烟碱衍生的半抗原，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝10每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)和以抑制ELISA测量亲和性。
图21和22显示对于表6的半抗原-载体缀合物的3H-烟碱在血液和脑中的分布。通过肌肉内接种，用烟碱衍生的半抗原，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和CpG 24555(50μg)存在下，将BALB/c小鼠(n＝10每组)免疫接种。在第二次免疫接种一周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定相对于对照组动物的3H-烟碱在血液和脑中之％改变。
图23显示测试具有不同百分比单体载体蛋白的半抗原-载体缀合物结合于CpG/Alhydrogel的结果。通过用已知量的半抗原-载体缀合物温育CpG/Alhydrogel，然后测量温育后留在溶液的缀合物浓度来测定结合。缀合物浓度的％减少等同于结合至CpG/Alhydrogel的％缀合物。通过肌肉内注射，用10μg不同缀合物将BALB/c小鼠(n＝10每组)在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85:40μgAl3+)和10μgCpG 24555存在下免疫接种。在第二次免疫接种一周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定相对于对照组动物的3H-烟碱在血液和脑中的％改变。
序列表
SEQ ID NO:1为免疫刺激寡核苷酸ODN CpG 24555的核苷酸序列。
具体实施方式
在一方面中，本发明涉及式(I)的半抗原：
其中W为-CH2-或-O-；且X为-NH2或-SH。
在一实施方案中，W位于吡啶环的位置2、5或6。
在另一实施方案中，W位于吡啶环的位置5。
在另一实施方案中，W为-O-。
在另一实施方案中，W为-O-；且W位于吡啶环的位置5。
在一另外实施方案中，所述半抗原为
在另一实施方案中，所述半抗原为
在一另外实施方案中，所述半抗原为
在一另外实施方案中，所述半抗原为
在第二方面中，本发明涉及式(II)的半抗原-间隔基缀合物：
其中W为-CH2-或-O-；-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、C3-C10环亚烷基或者被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基；且X为-NH2或-SH。
如本文所用，“亚烷基”是指-(CH2)n-基团，其中n为所需的碳原子数。如本文所用，“被1-4个氧原子中断的亚烷基”为，例如-CH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2-或-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。如本文所用，“被1-4个氧原子中断并且被-N(H)C(O)-中断的亚烷基“为，例如-CH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NHCOCH2CH2-。
在一实施方案中，W位于吡啶环的位置2、5或6。
在另一实施方案中，W位于吡啶环的位置5。
在一另外实施方案中，W为-O-。
在另一实施方案中，W为-O-；且W位于吡啶环的位置5。
在一实施方案中，-(间隔基)-为C1-C6亚烷基。
在另一实施方案中，-(间隔基)-为被1-4个氧原子中断的C1-C10亚烷基。
在又另一实施方案中，-(间隔基)-为被3个氧原子中断并且被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基。
在一实施方案中，所述半抗原-间隔基缀合物为
考虑下列进一步实施方案：
(i)如上所述的式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中W为-O-；
(ii)如上所述的式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中W为-CH2-；
(iii)如上所述或实施方案(i)和(ii)中的式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中X为-SH。
(iv)如上所述或实施方案(i)至(iii)中的式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中W位于吡啶环的位置2、5或6；
(v)如上所述或实施方案(i)至(iv)中的式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中W位于吡啶环的5位置；
(vi)如上所述或实施方案(i)至(v)中的式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、C6环亚烷基、或者被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基；及
(vii)如上所述或实施方案(i)至(vi)中的式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中-(间隔基)-为C1-C8亚烷基。
除非另有说明，在下列方案(其描述获得式(I)化合物的一般方法)中，取代基如上述对式(I)化合物或其衍生物所定义：
硼酸酯(ii)可由(S)-(-)-烟碱(i)与适当的铱催化剂(通常为甲氧基(环辛二烯)铱(I)二聚物)、配体(诸如4,4'-二-叔丁基-2,2'-联吡啶)和硼来源(诸如联硼酸频那醇酯(bis(pinacolato)diboron)或4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环)，在适当溶剂(诸如1,4-二噁烷或THF)中，于室温和回流之间的温度下之反应形成。硼酸酯(ii)然后使用溴化铜(II)在适当溶剂系统(诸如甲醇/水或乙醇/水)中，于通常60℃和回流之间的温度下可转化成溴化物(iii)。
溴化物(iii)然后与丙烯腈，在钯偶联条件下，使用适当钯来源(诸如乙酸钯(II)或肆(三苯基膦)钯)、在适当膦配体(诸如三(邻-甲苯基)膦或三呋喃基膦)存在下，在适当碱(诸如碳酸钠、三乙胺或N-二异丙基乙胺)存在下，在适当溶剂(诸如乙腈或1,4-二噁烷)中、通常在回流附近的温度可转化成不饱和氰化物(iv)。
(iv)产生(v)的氢化通常使用适当催化剂(诸如钯碳、氢氧化钯碳或铂活性炭)，在氢气气氛下，在适当溶剂(诸如甲醇、乙醇或乙酸乙酯)中，于通常室温附近的温度下进行。
腈(v)至胺(vi)的还原作用通常使用适当催化剂(诸如雷氏镍)、在氢气气氛(通常约50-100psi压力)下，在适当溶剂(诸如甲醇或乙醇)中。在浓氨存在下，于通常约40-70℃的温度下进行。
(viii)类型的酰胺的形成在标准文献条件下进行。酸(vii)可使用适当氯化剂(诸如草酰氯或亚硫酰氯)，在适当溶剂(诸如二氯甲烷或甲苯)中，任选地在催化DMF存在下，于适当温度(通常0℃和室温之间)而转化成酰氯。酰氯然后可与胺(vi)在碱(诸如三乙胺或二异丙基乙胺)存在下，在适当溶剂(诸如二氯甲烷或甲苯)中、于0℃和室温之间的温度下反应。或者酸(vii)可在适当溶剂(诸如二氯甲烷或DMF)中用偶联试剂(诸如T3P、EDCI.HCl、EDCI.MeI、HBTU、HATU、PyBop、DCC或CDI)转化至适当活化物质。在EDCI.HCl或EDCI.MeI存在下，任选地添加HOBT。也使用适当碱(诸如三乙胺或二异丙基乙胺)且反应通常在室温下进行。
(i)的去质子化可用适当碱(诸如超级碱nBuLi-LiDMAE(通过正丁基锂与二甲基氨基乙醇的反应形成))、在适当溶剂(诸如己烷、甲苯、己烷/甲苯或己烷/THF)中，于适当温度(通常-78℃和0℃之间)下进行。所产生的阴离子可用适当氯来源(诸如六氯乙烷或N-氯丁二酰亚胺)，于-78℃和室温之间的温度下淬灭，以产生二种氯吡啶类似物(ix)和(x)。
氯吡啶类似物(ix)和(x)可使用乙醇胺(优选作为溶剂和反应物)和使用适当强碱(诸如氢化钠或叔丁醇钾)、在通常在50-100℃之间的温度下转化成胺(xi)和(xii)。
溴化物(iii)可与具有保护基的醇(例如苯甲醇或优选的对-甲氧基苯甲醇)使用适当碱(通常为氢化钠)，在适当溶剂(诸如DMF或NMP)中，于通常约90-130℃的温度下反应。除去保护基以产生(xiv)可使用标准文献方法进行(例如，关于对-甲氧基苯甲醇，可使用适当酸诸如三氟乙酸)。
醇(xiv)可使用适当烷化剂(xvi)(诸如卤化物、甲磺酸盐或甲苯磺酸盐)和碱(诸如碳酸钾或碳酸铯)，在适当溶剂(诸如乙腈或DMF)中，于通常80℃和回流之间的温度而转化成被保护的胺(xv)(保护基优选为BOC)。胺的脱保护可使用标准文献方法进行，以产生(xvii)(例如，关于BOC保护基的情形，脱保护可使用适当酸来源(诸如三氟乙酸或盐酸)，在适当溶剂(诸如1,4-二噁烷、THF或二氯甲烷)中进行。
(xviii)类型的酰胺的形成可在标准文献条件下进行。酸(vii)可使用适当氯化剂(诸如草酰氯或亚硫酰氯)，在适当溶剂(诸如二氯甲烷或甲苯)中，任选地在催化DMF存在下，于适当温度(通常0℃和室温之间)转化成酰氯。酰氯然后可与胺(xvii)在碱(诸如三乙胺或二异丙基乙胺)存在下，在适当溶剂(诸如二氯甲烷或甲苯)中、在0℃和室温之间的温度下反应。或者酸(vii)可在适当溶剂(诸如二氯甲烷或DMF)中用偶联试剂(诸如T3P、EDCI.HCl、EDCI.MeI、HBTU、HATU、PyBop、DCC或CDI)转化至适当活化物质。在EDCI.HCl或EDCI.MeI存在下，任选地添加HOBT。也使用适当碱(诸如三乙胺或二异丙基乙胺)且反应通常在室温下进行。或者，胺(xvii)可与酸酐或内酯反应以制备一般结构(xviii)其他衍生物。例如，在此步骤中，g-丁内酯或g-硫代丁内酯可用作酰基来源，或例如酸酐(诸如丁二酸酐或酞酸酐)以提供衍生物(xviii)。
醇(xiv)也可使用适当氧化剂(通常为过氧化氢)和适当酸(诸如乙酸)在适当溶剂(诸如THF或1,4-二噁烷)中经由硼酸酯(ii)制备。
第三个方面中，本发明涉及式(III)的半抗原-载体缀合物：
其中W为-CH2-或-O-；-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基、或C3-C10环亚烷基；m为0或1；X*为-N(H)-或-S-；n为1-1000的整数；且Y为任选地修饰的载体蛋白，所述载体蛋白选自细菌类毒素、免疫原性物质、病毒、病毒样颗粒、蛋白复合物、蛋白、多肽、脂质体及免疫刺激复合物。
在某些实施方案中，Y为白喉类毒素或CRM197。
关于半抗原连接至载体蛋白，示例下列方法。载体蛋白如白喉类毒素(DT)或CRM197，例如，可用酸酐(例如丁二酸酐)处理活化，以产生载体蛋白(xix)的衍生形式。此衍生物然后可在标准偶联试剂存在下，通过例如T3P、EDCI.HCl、EDCI.MeI、HBTU、HATU、PyBop、DCC或CDI，在适当溶剂或缓冲液(诸如Dulbecco磷酸缓冲盐水)中转化至适当活化物质，而偶联于半抗原(xvii)。在EDCI.HCl或EDCI.MeI存在下，任选地加入HOBT或N-羟基丁二酰亚胺(或及其硫酸化形式)且反应通常在室温下进行以提供缀合物(xx)。或者，丁二酰化/衍生化步骤可以省略，并且半抗原直接偶联于载体蛋白上的自由羧基可使用上述方法进行以提供缀合物(xxiv)。或者，载体蛋白可用替代性衍生化试剂(诸如溴乙酸N-羟基丁二酰亚胺)处理以产生衍生的物质(xxi)，其可用含有硫醇的半抗原(xxii)处理以提供缀合物(xxiii)。
考虑下列实施方案：
(i)如上所述的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中W为-O-；
(ii)如上所述的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中W为-CH2-；
(iii)如上所述或实施方案(i)和(ii)中的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中W位于吡啶环的位置2、5或6；
(iv)如上所述或实施方案(i)至(iii)中的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中W位于吡啶环的5位置；
(v)如上所述或实施方案(i)至(iv)中的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、C6环亚烷基或者被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基；
(vi)如上所述或实施方案(i)至(iv)中的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中-(间隔基)-为C1-C8亚烷基；
(vii)如上所述或实施方案(i)至(vi)的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中m为0；
(viii)如上所述或实施方案(i)至(vii)的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中所述载体为任选地修饰的蛋白，所述蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素或其衍生物如无毒突变体白喉类毒素CRM197、匙孔血蓝蛋白(KLH)、血蓝蛋白(hemocyanine)、白蛋白、来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的外膜蛋白复合物(OMPC)、不耐热大肠杆菌毒素的B亚基(Bsubunit of heat-labile Escherichia coli)、来自绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的重组胞外蛋白(exoprotein)A(rEPA)和病毒样颗粒如由噬菌体Qb的重组外壳蛋白组装的病毒样颗粒；
(ix)如上所述或实施方案(i)至(viii)的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中所述载体为任选地修饰的蛋白，所述蛋白选自白喉类毒素和CRM197；
(x)如上所述或实施方案(i)至(ix)的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中所述载体为任选地修饰的CRM197；
(xi)如上所述或实施方案(i)至(x)的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中n为1-40范围内的整数；
(xii)如上所述或实施方案(i)至(x)的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中n为10-18范围内的整数；
(xiii)如上所述或实施方案(i)至(xii)或如上所述的式(III)的半抗原-载体缀合物，其中所述载体蛋白为修饰的丁二酰化的蛋白。
通过在37℃下在甲醛和其他赋形剂存在下温育4-6周将白喉毒素转化成白喉类毒素。此处理产生不均匀分子量的高度交联的蛋白，其使得蛋白无毒但保留其免疫原性。此蛋白作为疫苗载体蛋白的使用是公知的，且已作为猪的抗促性腺激素释放因子(GnRF)疫苗使用，作为替代手术阉割(ImprovacTM,Pfizer)。其也为市售抗白喉的人疫苗的未缀合形式，分别作为治疗白喉、破伤风和无细胞百日咳的DTaP疫苗的一部分。
CRM197为白喉毒素的遗传解毒形式，通过位于位置52的甘氨酸残基单点突变为谷氨酸残基而呈现无毒。突变除去蛋白结合到NAD+的能力，因此，蛋白为无酶促活性的。由于没有交联，该蛋白为比白喉类毒素分子量更均匀的产物，白喉毒素的甲醛失活制品。CRM197也用作市售抗肺炎球菌疫苗治疗的载体蛋白(Pfizer)。
在第四个方面中，本发明涉及制备如上所述的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物的方法，其包括使任选地修饰的载体蛋白与如上所述的式(I)的烟碱衍生的半抗原或式(II)的半抗原-间隔基缀合物偶联。
在某些实施方案中，半抗原连接载体蛋白可以通过使连结在一起的载体蛋白数最小化的方式进行。在某些实施方案中，连结在一起的载体蛋白数小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％或小于30％的载体蛋白总数。
在一优选实施方案中，本发明涉及制备如上所述的式(III)的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物的方法，其中X*为-NH-，其包括用磺基-N-羟基丁二酰亚胺、然后用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐处理任选地修饰的载体蛋白，然后添加如上所述的式(I)的半抗原或式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中X为-NH2。
在一替代性实施方案中，本发明涉及制备如上所述的式(III)的半抗原-载体缀合物的方法，其中X*为-NH-，其包括用丁二酸酐处理载体蛋白以产生修饰的丁二酰化的载体蛋白；用磺基-N-羟基丁二酰亚胺、然后用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐处理修饰的丁二酰化的载体蛋白，然后添加如上所述的式(I)的半抗原或式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中X为-NH2。
在一替代性实施方案中，本发明涉及制备如上所述的式(III)的半抗原-载体缀合物的方法，其中X*为-S-，其包括用溴乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯处理载体蛋白，然后添加如上所述的式(I)的半抗原或式(II)的半抗原-间隔基缀合物，其中X为-SH。
在第五个方面中，本发明涉及疫苗(或疫苗组合物)，其包含多种如上述定义的式(III)的半抗原-载体缀合物以及一种或多种佐剂。
适当佐剂的例子为已知当其偶联于载体分子时，增强对抗原的抗体应答的那些，包括对烟碱半抗原的抗体应答。佐剂为本领域公知(J.C.Aguilar，E.G.Rodriguez,Review:Vaccine Adjuvants Revisited,2007,Vaccine,25,3752-3762)。佐剂可由一种或多种机制发挥作用，包括直接先天免疫活化、产生储库或作为抗原的递送媒介物。通过直接先天免疫活化发挥作用的佐剂可为Toll样受体(TLR)的激动剂，包括但不限于活化TLR3的稳定聚I:C、经由TLR4活化的脂多糖的衍生物如单磷酰基-脂质A(MPL)或吡喃葡糖苷基(glycopyranosyl)脂质佐剂(GLA)、经由TLR5活化的鞭毛蛋白、经由TLR7或TLR8或者TLR7和TLR8二者活化的咪唑并喹啉家族的小分子如咪喹莫特或瑞喹莫德、经由TLR7和/或TLR8活化的寡核糖核苷酸(ORN)以及经由TLR9活化的含有CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)。CpG ODN TLR9激动剂可为A-类、B-类、C-类或P-类，有或无称为E修饰的5'T的卤化，并且可由全磷酸二酯主链、全硫代磷酸酯主链、嵌合主链、除了CpG基序的胞嘧啶和鸟苷之间以外的全硫代磷酸酯的“半软”主链制备。通过直接先天免疫活化发挥作用的佐剂可透过非TLR机制如QS21或其他皂苷发挥作用。
佐剂可为作为储库系统以及经由炎性体(inflammasome)的先天免疫活化剂发挥作用的铝盐。铝盐优选选自氢氧化铝或磷酸铝。氢氧化铝优先为原始Alhydrogel或Alhydrogel'85。
通过免疫活化和递送媒介物发挥作用的佐剂可为免疫刺激复合物(ISCOM)，如ISCOMATRIX。
具有递送媒介物性质的佐剂可为大分子复合物、纳米胶囊、纳米颗粒、微球、微粒或病毒体，并且这些物质在其表面上可具有用于靶向特定细胞类型的部分。佐剂可为基于脂质的系统，包括水包油乳液、油包水乳液、微团、混合微团和脂质体。脂质体可为单层或多层。乳液可基于角鲨烯，如MF-59。
佐剂可为病毒体。
优选的佐剂选自CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、铝盐、QS21和ISCOMS。
优选的CpG ODN为优选地活化B细胞的B类。在本发明的方面中，CpG ODN具有以下核酸序列
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’(SEQ IDNO:1)，其中*表示硫代磷酸酯连结。该序列的CpG ODN已知为CpG 24555。
如本文所用，术语“寡脱氧核苷酸”(ODN)表示多种核苷酸(即，包含连结于磷酸基团和可交换有机碱基的脱氧核糖的分子，其为被取代的嘧啶(例如，胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T))或被取代的嘌呤(例如，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。核酸分子可得自现有核酸来源(例如，基因组或cDNA)，但优选为合成的(例如，通过核酸合成制备)。具有硫代磷酸酯连结的寡核苷酸在体内相对耐降解(例如，经由内切和外切核酸酶)，提供体内增强的活性。
用于合成和化学修饰寡核苷酸的方法为本领域技术人员已知且描述于例如Uhlmann E.等人(1990),Chem Rev.90:543；"Protocols forOligonucleotides and Analogs"Synthesis and Properties&Synthesis andAnalytical Techniques,S.Agrawal,Ed.,Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke,S.T.等人，(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36:107-129；及Hunziker J.等人，(1995),Mod.Synth.Methods 7:331-417中。本发明的寡核苷酸可使用许多本领域技术人员已知的步骤的任一从头合成。例如，b-氰乙基亚磷酰胺(phosphoramidite)方法(Beaucage,S.L.,和Caruthers,M.H.,(1981)Tet.Let.22:1859)；核苷H-膦酸酯方法(Garegg等人，(1986)Tet.Let.27:4051-4054；Froehler等人，(1986)Nucl.Acid Res.14:5399-5407；Garegg等人，(1986)27:4055-4058；Gaffney等人，(1988)Tet.Let.29:2619-2622)。这些化学方法可通过市场上各种自动化核酸合成器进行。这些寡核苷酸称为合成寡核苷酸。修饰的主链如硫代磷酸酯可使用采用氨基磷酸酯(phosphoramidate)或H-膦酸酯化学的自动化技术合成。例如，如美国专利第4,469,863号中所述，可制备芳基-和烷基-膦酸酯，并且烷基磷酸三酯(其中带电氧部分如美国专利第5,023,243号中所述烷基化)可通过使用市售试剂制备的自动化固相合成。已描述制备其他DNA主链修饰和取代的方法(例如Uhlmann,E.和Peyman,A.,Chem.Rev.90:544,1990；Goodchild,J.,Bioconjugate Chem.1:165,1990)。
最优选的佐剂为与氢氧化铝盐如Alhydrogel一起使用的CpG 24555(如共同待决申请号PCT/IB2009/055444中所述，其援引加入本文)。因此，在一实施方案中，提供疫苗(或疫苗组合物)，其包含如上述定义的式(III)的半抗原-载体缀合物，以及CpG 24555。在一另外实施方案中，提供疫苗(或疫苗组合物)，其包含如上所述的式(III)的半抗原-载体缀合物、CpG 24555和氢氧化铝盐。在另一实施方案中，提供疫苗(或疫苗组合物)，其包含CpG24555和多种式(IV)的半抗原-载体缀合物：
其中，Y为白喉类毒素或CRM197，并且n为1-40范围内的整数。
在又另一实施方案中，提供疫苗(或疫苗组合物)，其包含CpG 24555、氢氧化铝盐和多种式(IV)的半抗原-载体缀合物：
其中，Y为白喉类毒素或CRM197，并且n为1-40范围内的整数。
在又另一实施方案中，提供疫苗(或疫苗组合物)，其包含氢氧化铝盐(例如Alhydrogel)以及多种式(IV)的半抗原-载体缀合物：
其中，Y为白喉类毒素或CRM197，并且n为1-40范围内的整数。
在某些实施方案中，n为1-30范围内的整数，包括1和30。在某些实施方案中，n为5-23范围内的整数，包括5和23。在某些实施方案中，n为10-18范围内的整数，包括10和18。在某些实施方案中，n为10。在某些实施方案中，n为11。在某些实施方案中，n为12。在某些实施方案中，n为13。在某些实施方案中，n为14。在某些实施方案中，n为15。在某些实施方案中，n为16。在某些实施方案中，n为17。在某些实施方案中，n为18。
通过改变形成半抗原-载体缀合物的偶联条件，参见下述范例，载体蛋白的交叉偶联可被最小化。当载体蛋白交叉偶联时，所产生的半抗原-载体缀合物包含多种共价或非共价键结合在一起的载体蛋白，并且在本文中称为"高分子量物质"。相比之下，本文中所用的“低分子量物质”指半抗原-载体缀合物，其中在缀合物制备期间损失一部分载体蛋白。在某些实施方案中已观察到，高分子量物质导致有效性较低的疫苗。因此，在某些实施方案中，本发明涉及任何上述疫苗组合物，其中小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％或小于30％的载体蛋白(其为半抗原-载体缀合物的一部分)是交叉偶联的(即是高分子量物质)。
在某些实施方案中，本发明涉及任何上述疫苗组合物，其中至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的载体蛋白(其为半抗原-载体缀合物的一部分)不是交叉偶联的。
在某些实施方案中，大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的任一上述疫苗组合物的抗原性组分为式IV的半抗原-载体缀合物。
在某些实施方案中，本发明涉及任何上述疫苗组合物，其中至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的载体蛋白的分子量为50,000道尔顿-70,000道尔顿。在某些实施方案中，本发明涉及任何上述疫苗组合物，其中至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的载体蛋白的分子量为约58,000道尔顿。
本发明的疫苗组合物可任选地包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。适当的赋形剂包括无菌水、盐溶液和缓冲液。在一实施方案中，半抗原-载体缀合物以药学上可接受的pH溶于盐水溶液。疫苗组合物也可任选地包含至少一种辅助剂，如分散介质、包衣、表面活性剂、防腐剂和稳定剂。本发明的疫苗组合物优选为无菌的。
本发明的疫苗组合物一般对于初始(priming)和激发剂量给药。预期最初系列包括间隔几周的几个剂量，且额外的激发剂量间隔几个月或几年，或者在循环抗体的水平下降至低于期望水平(临床上已显示与提高戒烟率相关)的时间。优选地，本发明的疫苗组合物以在6-24周内给予3-6剂量的最初系列以及随后的每3-12个月给予的激发剂量给药。
本发明的疫苗组合物可通过肠胃外途径给药，例如经由肌肉内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射、或者若使用适当装置，通过局部给予皮肤(经皮)或粘膜表面。
在某些实施方案中，本发明的半抗原-载体缀合物和/或疫苗可通过使用微针装置皮内给药(ID)。在一方面中，本发明提供微针装置，其包含一种或多种涂覆、包含或有效地递送本发明的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物的微针。在某些实施方案中，一种或多种微针可制备成贴剂，其中所述微针允许简单的非侵入性给药于皮肤。本发明的另一方面涵盖使用微针技术以递送本发明的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物。
微针递送技术使用短阵列(例如，长度小于4mm)针可促进包含烟碱衍生的半抗原-载体缀合物的疫苗组合物递送至特定和期望的皮肤深度。这样微针刺穿角质层和表皮下层，本发明的药物直接进入表皮或相邻真皮。由于微针的小尺寸，施用相对不痛，具有最小(如果有的话)出血或施用部位反应。在此，术语“微针”指延长结构，其足够长而可穿透皮肤角质层和进入表皮/真皮层，但足够短而没有由于活化神经末梢所造成的实质疼痛。
促进经皮递送的微针系描述于Prausnitz,Advanced Drug DeliveryReviews 56(2004)581-587；Zahn等人,Biomed.Microdevices 6(2004)183-190；Shirkhandeh J.Materials Sci.16(2005)37-45；Park,J.Controlled Release104(2005)51-66；美国专利第3,964,482、6,503,231、6,745,211；6,611,707；6,334,856号；以及美国专利申请第2005/0209565、2004/0106904、2004/0186419、2002/0193754和2010/0196445号中；上述文献整体援引加入本文。适当的微针由许多材料(包括硅、金属和聚合物)制造。Davis等人描述微针拆入皮肤的机制(Davis等人，J.Biomech.37(2004)1155-1163)。
实心或空心微针可用于本文中所述的实施方案。在一实施方案中，用于本发明的微针为实心的。例如，通道可通过微针阵列穿透皮肤产生，接着去除针和随后施用药物(参见例如，Martanto等人，Pharm.Res.21(2004)和McAllister等人，PNAS 100(2003)13755-13760)。包含本发明治疗剂的制剂可以凝胶、水凝胶、局部乳膏、油膏、软膏或其他局部制剂；和/或通过使用递送装置如绷带、闭塞体、贴剂和/或类似装置施用于微针治疗部位。
在另一实施方案中，实心(无孔)微针在施用于皮肤之前用本发明的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物涂覆。然后用微针穿刺表皮，使其保持与皮肤表面接触足够的时间，从而使半抗原-载体缀合物或疫苗组合物扩散到周围的皮肤组织。(关于以该方式给予治疗剂，参见Prausnitz,Advanced Drug Delivery Reviews 56(2004)581-587)。在另一实施方案中，使用空心(有孔)微针，其包含储存本发明的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物的通道。一旦施用于皮肤，半抗原-载体缀合物或疫苗组合物通过扩散或压力驱动流扩散入皮肤组织。(关于以该方式给予治疗剂，参见参见Zahn等人,Biomed.Microdevices 6(2004)183-190)。
在又另一实施方案中，相对于常规空心针技术，某些本发明的方面涉及可用于递送本发明的疫苗组合物的、由可溶性和/或生物可降解材料的固体基质形成的微针。关于实心微针的实例参见美国专利和公开申请第6,945,952、7,611,481、2002/0082543、2005/0197308和2008/0269685号，其描述由生物可降解聚合物制成的微针阵列，并且整体援引加入本文。
在某些实施方案中，实心微针可包括快速溶解和/或溶胀的材料，包括合成和/或天然衍生的热成形聚合物材料。在某些实施方案中，实心微针可由适当的生物相容、生物可降解聚合物如聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚醚酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚氨基甲酸酯及其共聚物和共混物形成。在其他实施方案中，实心微针可由非生物可降解聚合物如聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯的聚合物和其他酰基取代的乙酸纤维素、非可降解聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸酯聚烯烃、聚环氧乙烷、其共混物和共聚物形成。
微针可单独使用，或以多于一个微针的阵列使用。各种大小的阵列适合用于本发明。在一实施方案中，使用1-10个微针。在其他实施方案中，使用包含10-25、10-50、25-50、25-200、25-100或50-100个针的微针阵列。微针的阵列可根据几个因素(包括但不限于所用微针的长度、直径、针内距离、锐度和总数)而改变。在一示例实施方案中，微针的阵列包含10×10矩阵。在另一实施方案中，微针的阵列包含20×20矩阵。在一些实施方案中，阵列中各微针之间的距离为约100μm-约400μm。在一实施方案中，可根据期望皮肤渗透性的增强选择特定的阵列尺寸。
在一些实施方案中，微针具有20μm-约1000μm的长度，例如约50μm-约150μm，或约150μm-约500μm，或500μm-约1000μm，或600μm-约800μm。在其他实施方案中，微针长度为约50、100、250、500、600、700、800、900或1000μm。在又一其他实施方案中，微针长度为至少50、100、250、500、600、700、800、900或1000μm。在其他实施方案中，微针长度小于50、100、250、500、600、700、800、900或1000μm。在一实施方案中，微针长度为约700μm。在一些实施方案中，微针穿透皮肤的深度为约400μm-约700μm。在一实施方案中，微针穿透皮肤至约相当于角质层底部的深度。在另一实施方案中，微针穿透皮肤至约皮层顶端。又在其他实施方案中，微针穿透皮肤高达约角质层底部和皮层顶端之间的深度。微针可为任何保持效力需要的各种直径。在一些实施方案中，微针的外径可为约20μm-约100μm。在其他实施方案中，微针的外径可为约10μm-约50μm。在一些实施方案中，空心微针的内径可为约5μm-约70μm。此外，微针的外或内径可高达10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μm。如需要时，可使用上述微针尺寸与本文中所述的系统和方法的任何组合。
微针可从各种材料(包括但不限于硅、金属、聚合物和玻璃)制造。在一些实施方案中，使用硅微针。硅微针，无论实心或空心，可从硅片蚀刻。例如，标记各微针的位置并蚀刻掉周围的硅，产生连接到共同基底的微针阵列。在一些实施方案中，硅片的厚度为约300-600μm。
在其他实施方案中，微针由金属(包括但不限于镍、钛和合金如不锈钢)制造。在一些实施方案中，金属微针由环氧树脂模具制造，然后将其用所选择的金属电镀，随后将环氧树脂模具蚀刻掉。所产生的微针可重复使用或一次性使用。微针也可得自商业来源，包括Zosano Pharma,Inc.、Corium和3M。Zosano和3M均已开发含涂覆的微针贴剂。Corium已开发生物可降解微针。3M已开发空心微针(例如)。
半抗原-载体缀合物或疫苗组合物可使用各种方法施加于微针。在一实施方案中，制备包含半抗原-载体缀合物或疫苗组合物的溶液并将溶液沉积在微针上/内，接着干燥溶液。或者，将微阵列浸在包含半抗原-载体缀合物或疫苗组合物的溶液中，将微针用半抗原-载体缀合物或疫苗组合物涂覆。当另外蛋白或组分要涂覆在本发明的微针上或内时，可进行额外的涂覆步骤。或者，将溶液的几种或所有成分混合成一种溶液，然后将其沉积在微针上/内。可使用浸涂、喷涂或现有技术中已的其他技术，例如PCT公开号WO 2006/138719中所述，其整体援引加入本文。涂料可为固体或半固体。
各疫苗剂量中半抗原-缀合的载体蛋白的量选择为在典型疫苗中诱发免疫保护应答而没有显著不良副作用的量。合适的剂量范围为0.01-10mg/剂量，优选0.1至1.0mg/剂量。一般人在单疫苗剂量后需要两周或更多周来产生针对外来抗原的抗体，并且一般需要在数周内给予几个疫苗剂量，以诱发高持续抗体效价，诸如对于抗烟碱疫苗期望的那些以帮助戒烟者。可通过使用本领域技术人员众所周知的技术(诸如ELISA、放射免疫分析、表面等离子共振和蛋白印迹)监测人血液中的抗体的产生。
因此，在第六个方面中，本发明涉及用作药物的如上述定义的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物。
在又一另外方面中，本发明涉及如上述定义的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物，其用于增加希望戒烟的吸烟者的戒烟率和减少复吸率、曾经吸烟者希望避免复吸或者用于预防烟碱成瘾。
在又一另外方面中，本发明涉及如上述定义的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物，其用于制备用于治疗或预防有需要的人的烟碱依赖性的药物。
在又一另外方面中，本发明涉及如上述定义的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物，其用于治疗或预防有需要的人的烟碱成瘾。
在又一另外方面中，本发明涉及用于帮助希望戒烟的吸烟者戒烟、或预防已戒烟的吸烟者复吸、或预防可能暴露于吸烟或来自其他来源的烟碱的人的烟碱成瘾的治疗方法，所述方法包括将有效量的如上述定义的半抗原-载体缀合物或疫苗组合物给予所述人。
在一实施方案中，所述方法还包括将另一非疫苗戒烟产品给予人。合适的产品包括靶向烟碱乙酰胆碱受体的药物产品，如伐尼克兰或安非他酮，任选地以缓释形式。其他可用于本发明方法的产品包括可乐定和去甲替林。另外合适的产品包括烟碱替代疗法(NRT)产品，以例如贴剂(16h和24h)、口香糖、喷鼻剂或吸入器的形式。
在又一另外方面，本发明涉及制备本发明的半抗原-载体缀合物的方法，其包括将任选地修饰的载体蛋白与本发明的半抗原或本发明的半抗原-间隔基缀合物偶联。
在又一另外方面，本发明涉及制备式(III)的半抗原-载体缀合物的方法：
其中W为-CH2-或-O-；-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、C3-C10环亚烷基或者被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基；X*为-NH-；m为0或1；n为1-1000的整数；并且Y为任选地修饰的载体蛋白，所述载体蛋白选自细菌类毒素、免疫原性物质、病毒、病毒样颗粒、蛋白复合物、蛋白、多肽、脂质体及免疫刺激复合物；所述方法包括用磺基-N-羟基丁二酰亚胺、然后用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐处理任选地修饰的载体蛋白，然后添加式(I)的半抗原：
其中W为-CH2-或-O-，且X为-NH2；
或者式(II)的半抗原-间隔基缀合物：
其中W为-CH2-或-O-；-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、C3-C10环亚烷基或者被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基；X为-NH2。
在又一另外方面中，本发明涉及制备式(III)的缀合物的方法：
其中W为-CH2-或-O-；-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、C3-C10环亚烷基或者被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基；X*为-NH-；m为0或1；n为1-1000的整数；并且Y为任选地修饰的载体蛋白，所述载体蛋白选自细菌类毒素、免疫原性物质、病毒、病毒样颗粒、蛋白复合物、蛋白、多肽、脂质体及免疫刺激复合物；所述方法包括用丁二酸酐处理载体蛋白，以产生修饰的丁二酰化的载体蛋白；用磺基-N-羟基丁二酰亚胺、然后用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐处理修饰的丁二酰化的载体蛋白，然后添加式(I)的半抗原：
其中W为-CH2-或-O-，且X为-NH2；
或者式(II)的半抗原-间隔基缀合物：
其中W为-CH2-或-O-；-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、C3-C10环亚烷基或者被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基；且X为-NH2。
生物学分析
抗烟碱抗体ELISA如下使用ELISA分析定量抗烟碱抗体在小鼠血浆中的水平。因为烟碱分子不适合于涂覆于ELISA板，因此将其连结至具有生物粘着性质的较大分子(牛血清白蛋白)。将烟碱衍生物(rac-反式3'-硫甲基烟碱)缀合于牛血清白蛋白且以1μg/mL在碳酸盐缓冲液(Sigma-Aldrich)中的最终浓度将所得的烟碱-BSA缀合物用于涂覆96孔Immuno Maxi-SorpELISA板(VWR)(100μL/孔)，并在4℃下温育过夜。然后将该板吸出并用含有0.05％20(Sigma-Aldrich,P3563)的磷酸缓冲盐水洗涤。将板在37℃下用200μL封闭缓冲液(碳酸盐缓冲液+10％Bovine Calf Serum,Fisher)封闭1小时，然后如上所述洗涤。将样品和参考血浆连续稀释于稀释缓冲液(包含0.05％20的1X PBS+10％BCS)中并加至板(100μL/孔)。将板在37℃下温育2小时。将其再次洗涤，然后用以稀缓冲液(包含0.05％20的1X PBS+10％BCS)稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)在37℃下温育1小时。然后将板再次洗涤并用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物(溶解在磷酸盐柠檬酸缓冲液中的1×5mgOPD片，Sigma-Aldrich)避光在室温下温育30min。通过将50μL 4N硫酸(VWR)加至各孔停止反应并使用自动化平板读数器于450nm读数。将样品以最高血浆稀释定量，其导致抗体吸光度值(OD 450)是非免疫血浆的二倍，截止值为0.05。
抗烟碱抗体的亲和性的测量如下使用硫氰酸铵洗脱的基于ELISA的方法测量抗烟碱抗体的亲和性。用烟碱-BSA抗原溶液以1μg/mL在碳酸盐缓冲液(Sigma-Aldrich)的浓度涂覆(100μL/孔)96孔Immuno Maxi-SorpELISA板(VWR)并在4℃下温育过夜。将板用含有0.05％20(Sigma-Aldrich)的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，然后在37℃下用200μL碳酸盐缓冲液+10％小牛血清(Fisher)封闭1小时。将板再次洗涤。将血浆样品(先前测定包含抗烟碱抗体)稀释于含有0.05％20+10％小牛血清(BCS)的PBS中以达到于450nm下约1.0的最佳抗体吸光度值，然后以100μL/孔加至板。将板在37℃下温育2小时，然后洗涤。然后，通过添加0-2.0M的稀释于PBS/0.05％20的浓度的硫氰酸铵(NH4SCN)(100μL/孔)进行洗脱并在室温下温育15min。然后将板洗涤，并使用以稀释缓冲液(包含0.05％20的1X PBS+10％BCS)稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)在37℃下检测抗体结合，进行1小时。然后将板再次洗涤，并用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物(溶解在磷酸盐柠檬酸缓冲液中的1×5mgOPD片，Sigma-Aldrich)避光在室温下温育30min。通过将50μL 4N硫酸(VWR)加至各孔停止反应并使用自动化平板读数器于450nm读数。然后将结果表示为在NH4SCN存在下抗原-抗体的结合的百分比减少(OD的％减少)并对NH4SCN的浓度摩尔作图。亲和性指数计算为产生结合的50％减少所需的NH4SCN的浓度。
血浆和脑中的烟碱分布的评估免疫接种对血浆和脑中的烟碱分布的影响通过经由尾静脉灌注将100μL PBS中的0.05mg/kg的含有3μCi 3H-烟碱的(-)烟碱酒石酸氢盐在10秒内给予动物(预先用抗烟碱疫苗免疫接种)来确定。5min后经由心脏穿刺获得血液并收集血浆。通过在1-2min内将20mL注入心脏左心室来立即用PBS灌注小鼠，收获脑并称重。将脑在1mL消化缓冲液(100mM氯化钠，25mM Tris，25mM EDTA，0.5％Igepal CA-630和0.3mg/mL蛋白酶K，每100mg组织)中于～50℃下消化72小时。将脑消化物或血浆的100μL等份与5mL液体闪烁液混合并通过液体闪烁计数测定放射性标记烟碱的水平。
测定由抗烟碱疫苗诱发的抗体的特异性的竞争ELISA如下使用竞争ELISA测定抗烟碱抗体的特异性。将96孔Immuno Maxi-Sorp ELISA板(VWR)(100μL/孔)用烟碱-BSA抗原溶液以1μg/mL碳酸盐缓冲液(Sigma-Aldrich)中的浓度涂覆，并在4℃下温育过夜。将板用含有0.05％20(Sigma-Aldrich)的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，用200μL碳酸盐缓冲液+10％小牛血清(Fisher)在37℃下封闭1小时，然后再次洗涤。在温育期间，将血浆样品(先前测定包含抗烟碱抗体)稀释于含有0.05％20+10％小牛血清(BCS)的PBS中以达到450nm下的约1.0-1.5的最佳抗体吸光度值，并将不同抑制剂(烟碱、可替宁、乙酰胆碱、伐尼克兰)以20,000μM开始连续稀释。将等体积(65μL)的稀释的样品和所选的抑制剂加至未涂覆的96孔板的孔中，并在37℃下温育1小时。温育之后，将血浆/抑制剂混合物以100μL/孔加至先前封闭的烟碱-BSA涂覆的板中。将板在37℃下温育30min，然后再次洗涤。使用以稀缓冲液(包含0.05％20的1X PBS+10％BCS)稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)在37℃下检测抗体结合，进行1小时。然后将板再次洗涤，并用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物(溶解在磷酸盐柠檬酸缓冲液中的1×5mgOPD片，Sigma-Aldrich)避光在室温下温育30min。通过将50μL 4N硫酸(VWR)加至各孔停止反应并使用自动化平板读数器于450nm读数。将450nm的OD读数对抑制剂的摩尔浓度作图，并外推每个测试样品的50％抑制。
实施例
本发明以下列制备和实施例说明，但不限制于这些制备和实施例，其中使用下例缩写：
1H NMR谱在所有情况下与提出的结构一致。特征性化学位移(δ)以距离四甲基硅烷的低场的百万分之一给出，使用主峰名称的常规缩写：例如，s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽；brm，宽多重峰；brt，宽三重峰。
除非另有说明，LCMS在下列条件下进行：Waters XBridge C185nm，2.1×30mm柱，0:100至95:5，3.1min，MeCN:(10mM(NH4)2HCO3aq)。
制备
制备1：(S)-3-溴-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶(或5-溴烟碱)
该化合物依照J.Am.Chem.Soc.,2007,50,15434-15435所述方法制备。
将联硼酸频那醇酯(7.16g，28.21mmol)溶解在1,4-二噁烷(60mL)中，然后通过氩气来脱气。添加(S)-(-)-烟碱(6.48mL，40.3mmol)，接着添加4,4'-二-叔丁基-2,2'-联吡啶(650mg，2.42mmol)。继续脱气10min，然后添加甲氧基(环辛二烯)铱(I)二聚体(753mg，1.21mmol)。将反应混合物在回流温度下加热18小时。蒸发溶剂且将残余物溶解在MeOH(100mL)中。添加水(100mL)中的溴化铜(II)(27.0g，120.9mmol)并将反应混合物于80℃下加热3小时。将氨溶液(10％aq.，100mL)加至反应混合物，其然后用乙酸乙酯萃取并经过MgSO4干燥。蒸发溶剂和通过快速色谱法(DCM中的5％MeOH)纯化粗产物以产生橙色油状的标题化合物(6.14g，63％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.68-1.70(m,1H),1.80-1.82(m,1H),1.92-1.94(m,1H),1.99-2.02(m,1H),2.03(s,3H),2.20-2.34(m,1H),3.08(t,1H),3.20(t,1H),7.86(s,1H),8.42(s,1H),8.54(s,1H)。
制备2：(S)-3-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-基)丙烯腈
通过氩气将(S)-3-溴-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶(制备1)(300mg，1.24mmol)、乙酸钯(II)(14mg，0.06mmol)、三(邻甲苯基)膦(75mg，0.25mmol)和三乙胺(0.35mL，2.48mmol)在MeCN(10mL)的混合物脱气。然后添加丙烯腈(0.12mL，1.87mmol)并反应混合物在回流温度下加热18小时。将反应混合物冷却至室温，通过Celite过滤，蒸发溶剂以产生棕色固体。通过快速色谱法(DCM中的2％[MeOH中的20％氨])纯化粗产物以产生红棕色油状的标题化合物(188mg，71％，顺式和反式异构体的混合物)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.60-1.79(m,1H),1.80-1.90(m,1H),1.90-2.04(m,1H),2.17和2.19(2xs,3H),2.16-2.40(m,2H),3.11-3.30(m,2H),5.57和6.00(2xd,1H),7.16和7.40(2xd,1H),7.80和8.26(2xs,1H),8.57(s,1H),8.60和8.71(2xs,1H)。
制备3：(S)-3-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-基)丙腈
将MeOH(5mL)中的(S)-3-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-基)丙烯腈(制备2)(185mg，0.87mmol)和5％Pd/C(50mg)在氢气气氛下搅拌72小时。将反应混合物通过Celite过滤，然后蒸发溶剂。通过快速色谱法(DCM中的5％[MeOH中的20％氨])纯化粗产物以产生淡黄色油状的标题化合物(141mg，75％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.66-1.78(m,1H),1.78-1.89(m,1H),1.89-2.02(m,1H),2.17(s,3H),2.17-2.25(m,1H),2.31(q,1H),2.65(t,2H),2.97(t,2H),3.10(t,1H),3.24(t,1H),7.61(d,1H),8.38(s,1H),8.44(s,1H)。
制备4：(S)-3-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-基)丙-1-胺
将MeOH(50mL)中的(S)-3-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-基)丙腈(制备3)(140mg，0.65mmol)和雷氏镍(50mg)在20％氨中于50psi氢气下在50℃下搅拌4小时。将反应混合物通过Celite过滤，然后蒸发溶剂。通过快速色谱法(DCM中的7％[MeOH中的20％氨])纯化粗产物以产生淡黄色油状的标题化合物(126mg，88％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ＝1.70-1.85(m,3H),1.85-2.03(m,2H),2.15(s,3H),2.35(q,2H),2.59-2.78(m,4H),3.12-3.37(m,2H),7.70(s,1H),8.31(br s,2H).
LCMS:1.91min(97％),m/z＝220.16[M+H]+
制备5和6：(S)-2-氯-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶(或6-氯烟碱)和(S)-2-氯-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶(或2-氯烟碱)
这些化合物依照Eur.J.Org.Chem.,2006,3562-3565所述的方法制备。
于-20℃下，将丁基锂(己烷中2M，83mL，166mmol)加至二甲基氨基乙醇(9.3mL，92.5mmol)在己烷(70mL)中的溶液。添加己烷(30mL)中的(S)-(-)-烟碱(5.0g，30.8mmol)并将反应混合物在-20℃下搅拌1小时。然后将绿色溶液冷却至-78℃并添加六氯乙烷(29.1g，123mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌30min，然后通过添加氯化铵(饱和水溶液)停止反应。添加DCM和2M HCl(aq.)。将水层用DCM洗涤(x2)，然后通过添加冰/氨(aq.)碱化。将水层用DCM萃取(x2)，经过MgSO4干燥和蒸发。通过快速色谱法(己烷中的20％乙酸乙酯)纯化粗产物以产生6-氯烟碱(制备5)(2.2g，36％)和2-氯烟碱(制备6)(120mg，2％)，二者都为黄色油状。
6-氯烟碱：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ＝1.58-2.01(m,3H),2.14(s,3H),2.10-2.23(m,1H),2.28(q,1H),3.05(t,1H),3.19(dt,1H),7.26(d,1H),7.64(dd,1H),8.27(d,1H)。
2-氯烟碱：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ＝1.45-1.60(m,1H),1.76-1.98(m,2H),2.22(s,3H),2.31-2.49(m,2H),3.24(t,1H),3.55(t,1H),7.20-7.29(m,1H),7.93(d,1H),8.24(dd,1H)。
制备7：(S)-2-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-2-基氧基)乙胺
将氢化钠(油中60％，～500mg)加至乙醇胺(3mL)中的6-氯烟碱(制备5)(690mg，3.5mmol)。室温下15min之后，将反应混合物于80℃下加热16小时。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。将水层用乙酸乙酯萃取，经过MgSO4干燥和蒸发。通过快速色谱法(DCM中的5％[在MeOH中的20％氨])纯化粗产物以产生无色油状的标题化合物(44mg，6％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ＝1.71-2.00(m,3H),2.17(s,3H),2.17-2.23(m,1H),2.31(q,1H),2.99(t,2H),3.09(t,1H),3.20(t,1H),4.26(t,2H),6.83(d,1H),7.68(d,1H),8.02(d,1H).
LCMS:2.02min(100％),m/z＝222.1[M+H]+
制备8：(S)-2-(3-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-2-基氧基)乙胺
将氢化钠(油中60％，～200mg)加至在乙醇胺(2mL)中的2-氯烟碱(制备6)(120mg，0.61mmol)。室温下15min之后，将反应混合物于80℃下加热16小时。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。将水层用乙酸乙酯萃取，经过MgSO4干燥和蒸发。通过快速色谱法(DCM中的5％[MeOH中的20％氨])纯化粗产物以产生无色油状的标题化合物(8.5mg，6％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ＝1.60-1.70(m,1H),1.81-1.99(m,2H),2.20(s,3H),2.23-2.40(m,2H),3.03(t,2H),3.19(t,1H),3.53(t,1H),4.27-4.41(m,2H),6.96(d,1H),7.74(d,1H),8.00(d,1H).
LCMS:2.03min(99％),m/z＝222.1[M+H]+
制备9：(S)-3-(4-甲氧基苄氧基)-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶
将氢化钠(油中60％，650mg，32.5mmol)加至DMF(10mL)中的4-甲氧基苯甲醇(1.4g，11.6mmol)。室温下30min之后，添加DMF中(2mL)的5-溴烟碱(制备1)(1.4g，11.6mmol)。将反应混合物于90℃下加热16小时。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。将水层用乙酸乙酯萃取，将有机层合并，经过MgSO4干燥和蒸发。通过快速色谱法(DCM中的2.5％→5％MeOH)纯化粗产物以产生黄色油状的标题化合物，与～30％的另一异构体混合(402mg，23％)。
制备10：(S)-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-醇(或5-羟基烟碱)
制备10a：将(S)-3-(4-甲氧基苄氧基)-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶(制备9)(400mg，1.34mmol)在三氟乙酸(2mL)和DCM(5mL)中搅拌2小时。将反应混合物蒸发，然后与DCM和MeOH中的20％氨共蒸发(x5)。通过快速色谱法(DCM中的10％MeOH)纯化粗产物以产生黄色油状的标题化合物(225mg，94％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝2.20-2.39(m,3H),2.48-2.59(m,1H),2.76(s,3H),3.83(br s,1H),4.38(br s,1H),7.42(d,1H),8.16(s,1H),8.20(s,1H).
LCMS:1.26min(100％),m/z＝179.1[M+H]+
制备10b：将(S)-烟碱(54mL，336.2mmol)和4,4'-二-叔丁基-2,2'-联吡啶(5.41g，20.2mmol)连续添加至联硼酸频那醇酯(59.8g，235.5mmol)在1,4-二噁烷(218mL)中的溶液。将所产生的溶液在真空中于室温下脱气15-20分钟且然后释放于氮气。然后将该步骤再重复两次。
将[Ir(cod)(OMe)]2(6.7g，10.1mmol)进料至反应容器中且将反应混合物在真空中于室温下脱气5分钟，然后释放于氮气。然后将该步骤再重复两次。
将所产生的溶液在85℃下加热16小时，之后分析指示完全反应。将反应混合物冷却至室温并在减压下于50-55℃下浓缩至干。将所产生的橙色残余物溶解在四氢呋喃(740mL)中并将溶液冷却至0-5℃。将乙酸(52.1mL，908.8mmol)进料至容器，接着缓慢添加过氧化氢溶液(30％，43.1mL，454.4mmol)，维持温度为0-10℃。将所产生的混合物在室温下搅拌16小时，之后分析指示完全反应。
然后反应混合物冷却至0-5℃，通过添加焦亚硫酸氢钠水溶液(30％，50mL)停止反应。通过添加浓氢氧化铵溶液(130mL)调节所产生的混合物的pH。分离所产生的双相混合物和用四氢呋喃(300mL)再萃取水层。浓缩合并的有机层以产生橙色胶状的粗化合物。将其通过柱色谱在硅胶(DCM中的MeOH，5-20％)上纯化以除去大多数杂质，接着进行进一步柱色谱(100％THF)以除去异构体杂质。分离黄色固体状的纯5-羟基烟碱(26g，48％收率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.70-2.05(m,4H),2.21(s,3H),2.31(m,1H),3.11(t,1H),3.25(m,1H),7.32(d,1H),8.01(s,1H),8.05(s,1H)。
制备11：(S)-2-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-基氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯
将DMF(7mL)中的(S)-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-醇(制备10)(175mg，0.98mmol)、2-溴乙基氨基甲酸叔丁酯(550mg，2.45mmol)和碳酸钾(676mg，4.9mmol)在90℃下加热16小时。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。将水层用乙酸乙酯萃取，经过MgSO4干燥和蒸发。通过快速色谱法(DCM中的5％→10％MeOH)纯化粗产物以产生黄色油状的标题化合物(108mg，34％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.42(s,9H),1.70-2.00(m,3H),2.17(s,3H),2.09-2.20(m,1H),2.20-2.30(q,1H),3.15-3.26(m,2H),3.45(t,2H),4.08(t,2H),7.43(d,1H),8.07(s,1H),8.13(s,1H).
LCMS:2.62min(100％),m/z＝322.15[M+H]+
制备12：(S)-2-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-基氧基)乙胺
制备12a：将(S)-2-(5-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶-3-基氧基)乙基氨基甲酸-叔丁酯(制备11)(105mg，0.33mmol)在三氟乙酸(1mL)和DCM(5mL)中搅拌1.5h。将反应混合物蒸发，然后与DCM(x5)和MeOH中的20％氨共蒸发。通过快速色谱法(DCM中的5％[在MeOH中的20％氨])纯化粗产物以产生黄色油状的标题化合物(62mg，85％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.70-2.01(m,3H),2.17(s,3H),2.18-2.30(m,1H),2.30-2.40(m,1H),3.03(t,2H),3.14-3.28(m,2H),4.08(t,2H),7.44(d,1H),8.08(s,1H),8.16(s,1H).
LCMS:1.87min(100％),m/z＝222.12[M+H]+
制备12b：在0-5℃下，将甲醇(40mL)中d甲醇钾(3.37g，46.2mmol)进料至5-羟基烟碱(制备10b)(8.0g，44.0mmol)在甲醇(40mL)中的溶液。将所产生的混合物搅拌90分钟，然后在减压下于45℃浓缩至干。
将在二甲基甲酰胺(80mL)中的Boc-1-氨基-2-溴乙烷(14.8g，66.0mmol)在氮气下加热至50℃，此时将先前制备的5-羟基烟碱的钾盐进料至容器，紧随其后加入碳酸钾(6.7g，48.4mmol)。
将所产生的溶液在85℃下加热4小时，然后冷却至室温。将其在减压下于50℃下浓缩，将所产生的橙色混合物在1,4-二噁烷(50mL)中搅拌15分钟。然后将溶液过滤，并将液体冷却至0-5℃，然后用1,4-二噁烷中的4MHCl(65mL)酸化。将混合物在减压下于50℃浓缩，并将所产生的残余物溶解在四氢呋喃(30mL)中。然后将该混合物冷却至0-5℃，并用氢氧化钠溶液(10M，45mL)调节pH。将所产生的双相混合物的层分离并用四氢呋喃(2×50mL)再萃取水层。浓缩合并的有机层以产生红色油状的粗化合物。将粗产物溶解在DCM中并搅拌10分钟，然后过滤，将液体装载在二氧化硅柱上并用乙酸乙酯中的5-30％甲醇(包含20％氢氧化铵)通过洗脱纯化。获得黄色油状的标题化合物，7.15g(73％收率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.65-1.80(m,3H),1.85(m,1H),1.95(m,1H),2.19(s,3H),2.21(m,1H),2.35(q,1H),3.12(m,3H),3.28(t,1H),4.08(t,2H),7.28(s,1H),8.15(s,1H),8.23(s,1H)。
制备13：{反式-4-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基甲酰基]环己基}氨基甲酸叔丁酯
将3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙-1-胺(制备4)(100mg，0.45mmol)在2-甲基四氢呋喃(2mL)中的溶液用反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸(132mg，0.502mmol)接着用T3P(580μL，0.91mmol)、然后用Et3N(118μL，0.91mmol)处理并搅拌。搅拌3小时之后，用T3P(240μL，0.38mmol)处理。搅拌18小时之后，在真空下浓缩溶液并将残余物加入MeOH中并装至SCX-2筒，将其用MeOH、接着用MeOH中的氨(～2M)洗脱。将包含产物的部分在真空下浓缩并通过柱色谱在硅胶上用EtOAc:MeOH:NH3(梯度1:0:0-90:10:1)洗脱来纯化残余物以产生胶状的标题化合物(130mg，64％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.04-1.14(m,2H),1.42(s,9H),1.48-1.59(m,2H),1.65-1.74(m,H),1.79-2.02(m,7H),2.05-2.09(brm,2H),2.13-2.22(m,4H),2.26-2.33(m,H),2.60-2.64(t,2H),3.04-3.08(t,H),3.20-3.30(m,3H),3.40(brm,H),4.39(brm,H),5.56(brt,H),7.50(t,H),8.30-8.31(d,H),8.34-8.35(d,H).
MS,m/z＝568ES+[M+H]+,567CI[M+H]+
制备14：(19-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用3-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(180mg，70％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.41(s,9H),1.65-1.76(m,H),1.78-1.86(m,3H),1.88-2.01(m,H),2.13-2.21(m,4H),2.25-2.32(m,H),2.44-2.47(t,2H),2.61-2.65(t,2H),3.03-3.07(t,H),3.19-3.29(m,6H),3.49-3.52(t,2H),3.57-3.62(m,11H),3.70-3.73(t,2H),5.21(brm,H),6.66(brm,H),7.51(t,H),8.30-8.31(d,H),]8.33(d,H).
MS,m/z＝445ES+[M+H]+,445CI[M+H]+
制备15：{2-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-乙酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(133mg，77％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.45(s,9H),1.66-1.77(m,H),1.79-1.90(m,3H),1.91-2.02(m,H),2.14-2.23(m,4H),2.27-2.34(q,H),2.62-2.66(m,2H),3.04-3.09(t,H),3.21-3.26(m,H),3.28-3.34(m,2H),3.75-3.76(d,2H),5.21(brm,H),6.29(brm,H),7.52(t,H),8.31-8.32(d,H),8.34-8.35(d,H).
MS,m/z＝377ES+[M+H]+,377CI[M+H]+
制备16：{3-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基]-3-氧代丙基}氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-丙酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(130mg，73％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.41(s,9H),1.67-1.75(m,H),1.79-1.88(m,3H),1.91-2.00(m,H),2.14-2.23(m,4H),2.27-2.33(q,H),2.37-2.40(t,2H),2.62-2.66(m,2H),3.04-3.08(t,H),3.20-3.30(m,3H),3.37-3.41(q,2H),5.26(brm,H),6.00(brm,H),7.52(t,H),8.31-8.32(d,H),8.34(d,H).
MS,m/z＝391ES+[M+H]+,391CI[M+H]+
制备17：{4-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基]-4-氧代丁基}氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-丁酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(140mg，76％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.40(s,9H),1.64-1.72(m,H),1.74-1.87(m,5H),1.87-1.89(m,H),2.12-2.20(m,6H),2.24-2.31(q,H),2.62-2.66(m,2H),3.02-3.06(t,H),3.11-3.16(q,2H),3.18-3.29(m,3H),4.91(brm,H),6.57(brm,H),7.51(t,H),8.30(d,H),8.32(d,H).
MS,m/z＝405ES+[M+H]+,405CI[M+H]+
制备18：[2-(2-{2-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基]-2-氧代乙氧基}乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酸(如Angew.Chemie Int.Ed.(2006),45(30),4936-4940中所述制备)替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生无色胶(60mg，28％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.42(s,9H),1.67-1.98(m,7H),2.14-2.23(m,4H),2.27-2.33(q,H),2.64-2.68(m,2H),3.04-3.09(t,H),3.21-3.26(m,H),3.29-3.37(m,3H),3.53-3.56(t,2H),3.62-3.68(m,4H),3.98(s,2H),4.99(brm,H),6.88(brm,H),7.53(t,H),8.33(d,H),8.35(d,H).
MS,m/z＝465ES+[M+H]+,465CI[M+H]+
制备19：(2-{2-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基]-2-氧代乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(105mg，55％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.43(s,9H),2.16-2.24(m,5H),2.31(q,4H),2.66(t,1H),3.07(t,2H),3.24(t,1H),m,1H),3.32-3.37(m,4H),3.56(t,2H),3.94(s,2H),4.98(br,1H),6.69(br,1H),7.54(t,1H),8.33-8.36(m,2H).
MS m/z＝421ES+[M+H]+
制备20：{5-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基]-5-氧代戊基}氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-戊酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(191mg，64％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.43(s,9H),1.47-1.53(m,2H),1.63-1.75(m,3H),1.80-1.89(m,4H),1.94-2.05(m,H),2.16(s,3H),2.16-2.23(m,2H),2.31(q,H),2.65(t,2H),3.07(t,H),3.14-31.6(m,2H),3.22-3.30(m,3H),5.30(br,H),5.80(br,H),7.53(t,H),8.33(m,H),8.35(m,H).
MS m/z＝420ES+[M+H]+
制备21：{6-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-己酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(197mg，50％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.32-1.37(m,2H),1.43(s,9H),1.46-1.54(m,2H),1.61-1.69(m,2H),1.69-1.77(m,H),1.81-1.89(m,5H),1.95-2.00(m,H),2.14-2.22(m,5H),2.30(q,H),2.65(t,2H),3.05-3.13(m,3H),3.22-3.33(m,3H),4.62(br,H),5.63(br,H),7.53(t,H),8.33(m,H),8.35(m,H).
MS m/z＝434ES+[M+H]+
制备22：{7-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基]-7-氧代庚基}氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-庚酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(204mg，55％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.31-1.35(m,4H),1.44(s,9H),1.44-1.49(m,2H),1.60-1.67(m,2H),1.70-1.77(m,H),1.81-1.89(m,5H),1.94-1.99(m,H),2.13-2.23(m,5H),2.30(q,H),2.65(t,2H),3.05-3.12(m,3H),3.22-3.33(m,3H),4.37(br,H),5.68(br,H),7.53(t,H),8.33(m,H),8.35(m,H).
MS m/z＝448ES+[M+H]+
制备23：(22-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14,19-二氮杂二十二烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备13的一般方法，使用N-(3-{2-[2-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙基)-丁酰胺酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(284mg，53％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.43(s,9H),1.71-1.77(m,9H),1.87-2.02(m,4H),2.16-2.22(m,4H),2.30(q,H),2.63(t,2H),3.06(t,H),3.19-3.28(m,5H),3.33-3.37(m,2H),3.51-3.65(m,12H),5.09(br,H),6.59(br,H),6.64(br,H),7.52(t,H),8.32(m,H),8.35(m,H).
MS m/z＝622ES+[M+H]+
制备24：反式-4-氨基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)环己烷甲酰胺
将{反式-4-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)氨基甲酰基]环己基}氨基甲酸叔丁酯(制备13)(130mg，0.29mmol)在DCM(3mL)中的溶液用三氟乙酸(1mL)处理。将所产生的溶液在环境温度下搅拌2小时，之后将其在真空中浓缩。将残余物溶解在MeOH中，并加至SCX-2筒，并用MeOH、接着用MeOH中的氨(2M)洗脱。将包含产物的部分在真空下浓缩以产生无色胶状的标题化合物(98mg，97％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.02-1.12(m,2H),1.45-1.76(m,5H),1.77-2.03(m,9H),2.12-2.21(m,4H),2.25-2.32(q,H),2.59-2.68(m,3H),3.02-3.06(t,H),3.19-3.29(m,3H),5.66(br,H),7.49(t,H),8.29(d,H),8.33(d,H).
MS,m/z＝345和367ES+[M+H]+和[M+Na]+,345CI[M+H]+
制备25：1-氨基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备14开始，以产生无色胶(149mg，100％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.64-1.75(m,H),1.77-1.99(m,7H),2.12-2.21(m,4H),2.25-2.32(q,H),2.44-2.46(t,2H),2.60-2.64(t,2H),2.82-2.85(t,2H),3.02-3.06(t,H),3.19-3.29(m,3H),3.47-3.50(t,2H),3.59-3.61(m,11H),3.69-3.72(t,2H),6.76(brm,H),7.50(t,H),8.30-8.31(d,H),8.33(d,H).
MS,m/z＝467和489ES+[M+H]+和[M+Na]+,467CI[M+H]+
制备26：N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)甘氨酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备15开始，以产生无色胶(99mg，100％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.66-2.01(m,7H),2.13-2.22(m,4H),2.27-2.33(q,H),2.62-2.66(t,2H),3.05-3.09(t,H),3.21-3.26(t,H),3.29-3.34(m,4H),7.35(brm,H),7.53(t,H),8.32(d,H),8.33-8.34(d,H).
MS,m/z＝277和291ES+[M+H]+和[M+Na]+,277CI[M+H]+
制备27：N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)-β-丙氨酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备16开始，以产生无色胶(99mg，100％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.65-1.76(m,H),1.77-2.00(m,6H),2.13-2.22(m,4H),2.26-2.32(m,3H),2.62-2.66(t,2H),2.98-3.01(t,2H),3.03-3.08(t,2H)3.20-3.31(m,3H),7.26(brm,H),7.51(t,H)8.31-8.32(d,H),8.33-8.34(d,H).
MS,m/z＝291和313ES+[M+H]+和[M+Na]+,291CI[M+H]+
制备28：4-氨基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)丁酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备17开始，以产生无色胶(104mg，99％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.65-2.00(m,9H),2.13-2.32(m,7H),2.61-2.65(t,2H),2.72-2.76(t,2H)3.03-3.07(t,H)3.20-3.30(m,3H),6.22(brm,H),7.50(t,H),8.30-8.31(d,H)8.33-8.34(d,H).
MS,m/z＝305和327ES+[M+H]+和[M+Na]+,305CI[M+H]+
制备29：2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)乙酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备18开始，以产生无色胶(49mg，100％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.67-1.78(m,H),1.79-2.02(m,4H),2.15-2.34(m,7H),2.64-2.67(t,2H),2.88-2.91(t,2H),3.06-3.10(t,1H),3.22-3.27(t,1H),3.31-3.36(q,2H),3.54-3.57(t,2H),3.63-3.70(m,4H),3.99(s,2H),7.02(dm,2H),7.54(t,H),8.33-8.34(d,H),8.35(d,H).
MS,m/z＝365和387ES+[M+H]+和[M+Na]+,365CI[M+H]+
制备30：2-(2-氨基乙氧基)-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)乙酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备19开始，产生淡黄色胶(87mg，100％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.70-1.97(m,6H),2.17(s,3H),2.18-2.23(m,H),2.31(q,H),2.67(t,2H),2.94(m,2H),3.08(t,H),3.26(m,H),3.35(q,2H),3.56(t,2H),3.98(s,2H),7.35(br,H),7.55(t,H),8.34(d,H),8.35(d,H).
MS,m/z＝321ES+[M+H]+
制备31：5-氨基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)戊酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备20开始，产生淡黄色胶(78mg，54％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.46-1.52(m,H),1.64-1.72(m,3H),1.81-2.02(m,7H),2.15-2.24(m,5H),2.31(q,H),2.65(t,2H),2.72(t,H),3.07(t,H),3.20-3.32(m,4H),5.79(br,H),6.25(br,H),7.53(s,H),8.33(m,H),8.35(m,H).
MS,m/z＝319ES+[M+H]+
制备32：6-氨基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)已酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备21开始，产生淡黄色胶(70mg，46％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.32-1.41(m,2H),1.50-1.57(m,H),1.59-1.70(m,4H),1.81-1.85(m,3H),1.87-2.01(m,2H),2.15(s,3H),2.15-23(m,3H),2.30(q,H),2.63(t,2H),2.765(t,H),3.06(t,H),3.19-2.29(m,3H).
MS,m/z＝333ES+[M+H]+
制备33：7-氨基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)庚酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备22开始，产生淡黄色胶(59mg，37％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.32-1.29(m,3H),1.46-1.50(m,H),1.61-1.66(m,2H),1.70-1.74(m,H),1.82-1.89(m,3H),1.94-2.04(m,3H),2.17(s,3H),2.15-2.23(m,3H),2.32(q,H),2.65(t,2H),2.71(t,H),3.08(t,H),3.18-3.33(m,4H),5.58(br,H),5.65(br,H),7.53(d,H),8.34(m,H),8.36(m,H).
MS,m/z＝347ES+[M+H]+
制备34：N-(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)-N'-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}丙基)丁二酰胺
标题化合物通过上述制备24的一般方法，从制备23开始，产生淡黄色胶(120mg，51％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.71-1.87(m,6H),1.90-2.02(m,H),2.16(s,3H),2.17-2.24(m,H),2.30(q,H),2.40-2.51(m,6H),2.61-2.67(m,2H),2.87(t,2H),3.22-3.29(m,3H),3.31(q,2H),3.51-3.65(m,12H),6.85(br,H),6.95(br,H),7.53(s,H),8.33(m,H),8.35(m,H).
MS,m/z＝522ES+[M+H]+
制备35：(反式-4-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基甲酰基}环己基)氨基甲酸叔丁酯
将2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙胺(制备12)(55mg，0.25mmol)在2-甲基四氢呋喃(2mL)中的溶液用反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸(91mg，0.373mmol)、接着用T3P(317μL，0.498mmol)和Et3N(118μL，0.91mmol)处理并搅拌。搅拌3小时之后，将溶液用T3P(69μL，0.498mmol)处理。搅拌18小时之后，在真空下浓缩溶液并将残余物加入MeOH中并加入SCX-2筒，将其用甲醇接着用MeOH中的氨(～2M)洗脱。将包含产物的部分在真空下浓缩，并在硅胶上用EtOAc:MeOH:NH3(梯度1:0:0-90:10:1)洗脱通过柱色谱法纯化残余物。然后将此材料溶解在DCM中并用PS-异氰酸酯树脂处理3小时，然后过滤并在真空中蒸发以产生淡黄色胶状的标题化合物(35mg，35％)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.14-1.25(m,2H),1.42(d,9H),1.47-1.58(m,2H),1.75-1.85(m,3H),1.87-2.06(m,4H),2.09-2.18(m,1H),2.21(s,3H),2.23-2.32(m,1H),2.38-2.45(q,1H),3.24-3.29(m,3H),3.55-3.58(t,2H),4.11-4.14(t,2H),7.45-7.43(m,1H),8.10(d,1H),8.15-8.16(d,1H).
MS m/z＝447ES+[M+H]+,447CI[M+H]+
制备36：{2-[2-(2-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基}-2-氧代乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酸(如Angew.Chemie Int.Ed.(2006),45(30),4936-4940中所述制备)替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(50mg，43％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.41(s,9H),1.72-1.81(m,1H),1.84-2.01(m,2H),2.18(s,3H),2.21-2.30(m,1H),2.33-2.40(q,1H),3.16-3.26(m,4H),3.50-3.52(t,2H),3.62-3.69(m,6H),4.01(s,2H),4.16-4.19(t,2H),7.44-7.45(m,1H),8.10(d,1H),8.15-8.16(d,1H).
MS m/z＝467ES+[M+H]+,467CI[M+H]+
制备37：(2-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-乙酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(50mg，53％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.42(s,9H),1.87-2.09(m,3H),2.30-2.38(m,4H),2.60-2.67(q,1H),3.37-3.43(brt,1H),3.52-3.56(brt,1H),3.61-3.64(t,2H),3.70(s,2H),4.14-4.17(t,2H),7.49-7.50(m,1H),8.14-8.15(d,1H),8.20-8.21(d,1H).
MS m/z＝379ES+[M+H]+,379CI[M+H]+
制备38：(3-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-丙酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(70mg，72％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.39(s,9H),1.75-1.84(m,1H),1.87-2.04(m,2H),2.21(s,3H),2.23-2.31(m,1H),2.37-2.47(m,3H),3.24-3.33(m,4H),3.58-3.61(t,2H),4.12-4.15(t,2H),7.44-7.45(m,1H),8.10-8.11(d,1H),8.16-8.17(d,1H).
MS m/z＝393ES+[M+H]+,393CI[M+H]+
制备39：(4-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基}-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-丁酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(43mg，42％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.41(s,9H),1.70-1.78(m,2H),1.96-2.12(m,3H),2.21-2.24(t,2H),2.33-2.42(m,4H),2.69-2.76(q,1H),3.02-3.07(m,2H),3.43-3.49(brt,1H),3.58-3.61(t,2H),3.64-3.69(brt,1H),4.15-4.18(t,2H),7.51-7.52(m,1H),8.16-8.17(d,1H),8.23-8.24(d,1H).
MS m/z＝407ES+[M+H]+,407CI[M+H]+
制备40：(5-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基}-5-氧代戊基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-戊酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(49mg，47％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.41-1.50(m,11H),1.57-1.65(m,2H),2.01-2.18(m,3H),2.20-2.24(t,2H),2.37-2.44(m,1H),2.46(s,3H),2.78-2.85(q,1H),3.00-3.05(m,2H),3.49-3.55(m,1H),3.58-3.61(t,2H),3.76-3.80(brt,1H),4.15-4.16(t,2H),7.55-7.56(m,1H),8.18-8.19(d,1H),8.25-8.26(d,1H).
MS m/z＝421ES+[M+H]+,421CI[M+H]+
制备41：(6-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基}-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-己酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(65mg，60％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.29-1.35(m,2H),1.42-1.49(m,11H),1.57-1.65(m,2H),2.05-2.15(m,3H),2.19-2.23(t,2H),2.38-2.46(m,1H),2.48(s,3H),2.82-2.89(m,1H),2.96-3.00(t,2H),3.53-3.61(m,3H),3.62-3.66(brt,1H),4.15-4.18(t,2H),7.55-7.56(m,1H),8.19-8.20(d,1H),8.26-8.27(d,1H).
MS m/z＝435ES+[M+H]+,435CI[M+H]+
制备42：(7-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基}-7-氧代庚基)氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用叔丁氧基羰基氨基-庚酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(67mg，60％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.28-1.34(m,4H),1.39-1.45(m,11H),1.55-1.64(m,2H),2.03-2.15(m,3H),2.19-2.22(t,2H),2.38-2.46(m,1H),2.48(s,3H),2.81-2.88(m,1H),2.97-3.00(t,2H),3.51-3.57(m,1H),3.58-3.61(t,2H),3.80-3.84(m,1H),4.15-4.18(t,2H),7.55-7.57(m,1H),8.19(d,1H),8.16(d,1H).
MS m/z＝449ES+[M+H]+,449CI[M+H]+
制备43：[2-(2-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基}-2-氧代乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生淡黄色胶(42mg，42％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.42(s,9H),2.15-2.32(m,3H),2.43-2.52(s,1H),2.61(s,3H),3.03-3.10(m,1H),3.24-3.29(m,2H),3.52-3.55(t,2H),3.66-3.69(m,3H),3.98(s,2H),4.06-4.13(m,1H),4.21-4.24(t,2H),7.62-7.63(m,1H),8.24(d,1H),8.32-8.33(d,1H).
MS m/z＝423ES+[M+H]+,423CI[M+H]+
制备44：[21-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14,19-二氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用N-(3-{2-[2-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙基)-丁酰胺酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生橙色胶(80mg，51％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.42(s,9H),1.68-1.76(m,4H),1.97-2.15(m,3H),2.35-2.52(m,9H),2.71-2.80(m,1H),3.09-3.14(m,2H),3.20-3.26(m,2H),3.48-3.51(t,5H),3.55-3.64(m,10H),3.66-3.76(m,1H),4.14-4.17(t,2H),7.53-7.54(m,1H),8.17-8.18(d,1H),8.24-8.25(d,1H).
MS m/z＝625ES+[M+H]+,625CI[M+H]+
制备45：[18-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯
标题化合物通过上述制备35的一般方法，使用3-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸替代反式-4-叔丁氧基羰基-环己烷羧酸，以产生橙色胶(80mg，56％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.42(s,9H),2.03-2.20(m,3H),2.38-2.50(m,6H),2.85-2.91(m,1H),3.19-3.22(m,2H),3.47-3.50(t,2H),3.53-3.63(m,15H),3.71-3.74(t,2H),3.84-3.92(m,1H),4.17-4.19(t,2H),7.58-7.59(m,1H),8.20-8.21(d,1H),8.28(d,1H).
MS m/z＝570ES+[M+H]+,570CI[M+H]+
制备46：反式-4-氨基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]环己烷甲酰胺
将(反式-4-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]氨基甲酰基}环己基)氨基甲酸叔丁酯(制备35)(35mg，0.078mmol)在DCM(3mL)中的溶液用三氟乙酸(1mL)处理。将所产生的溶液在环境温度下搅拌过夜，之后在真空下将其浓缩。将残余物溶解在MeOH中，并加入SCX-2筒，并用MeOH、接着用MeOH中的氨(2M)洗脱。将包含产物的部分在真空下浓缩以产生橙色胶状的标题化合物(17mg，62％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.16-1.26(m,2H),1.47-1.57(m,2H),1.71-2.01(m,8H),2.13-2.30(m,4H),2.33-2.40(q,1H),2.68-2.76(m,1H),3.18-3.26(m,2H),3.56-3.59(t,2H),4.12-4.14(t,2H),7.43-7.44(m,1H),8.09-8.10(d,1H),8.14-8.15(d,1H).
MS m/z＝347ES+[M+H]+,347CI[M+H]+
制备47：2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]乙酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备36开始，以产生橙色胶(37mg，95％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.72-1.81(m,1H),1.84-2.03(m,2H),2.18(s,3H),2.22-2.30(m,1H),2.34-2.41(q,1H),2.83-2.86(t,2H),3.19-3.26(m,2H),3.54-3.57(t,2H),3.65-3.71(m,6H),4.02(s,2H),4.16-4.19(t,2H),7.44-7.45(m,1H),8.10-8.11(d,1H),8.15(d,1H).
MS m/z＝367ES+[M+H]+,367CI[M+H]+
制备48：N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]甘氨酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备37开始，以产生橙色胶(37mg，100％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.74-1.84(m,1H),1.87-2.05(m,2H),2.20(s,3H),2.23-2.32(m,1H),2.38-2.44(q,1H),3.23-3.28(m,2H),3.37(s,2H),3.63-3.66(t,2H),4.15-4.17(t,2H),7.45-7.47(m,1H),8.10-8.11(d,1H),8.15-8.16(d,1H).
MS m/z＝279ES+[M+H]+,279CI[M+H]+
制备49：N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]-β-丙氨酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备38开始，以产生橙色胶(52mg，100％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.72-1.81(m,1H),1.84-2.03(m,2H),2.18(s,3H),2.21-2.30(m,1H),2.33-2.44(m,3H),2.93-2.96(t,2H),3.16-3.26(m,2H),3.60-3.62(t,2H),4.13-4.16(t,2H),7.43-7.44(m,1H),8.10(d,1H),8.14-8.15(d,1H).
MS m/z＝293ES+[M+H]+,293CI[M+H]+
制备50：4-氨基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]丁酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备39开始，以产生橙色胶(28mg，88％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.73-1.82(m,3H),1.84-2.03(m,2H),2.18(s,3H),2.21-2.30(m,3H),2.33-2.40(q,1H),2.68-2.72(t,2H),3.18-3.26(m,2H),3.58-3.61(t,2H),4.12-4.15(t,2H)7.43-7.44(m,1H),8.10(d,1H),8.14-8.15(d,1H).
MS m/z＝307ES+[M+H]+,307CI[M+H]+制备51：5-氨基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]戊酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备40开始，以产生橙色胶(30mg，81％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.48-1.56(m,2H),1.61-1.68(m,2H),1.71-1.81(m,1H),1.85-2.03(m,2H),2.18(s,3H),2.22-2.30(m,3H),2.33-2.40(q,1H),2.68-2.72(t,2H),3.18-3.26(m,2H),3.58-3.61(t,2H),4.12-4.15(t,2H),7.43-7.44(m,1H),8.10(d,1H),8.14-8.15(d,1H).
MS m/z＝321ES+[M+H]+,321CI[M+H]+
制备52：6-氨基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]已酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备41开始，以产生橙色胶(38mg，76％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.31-1.39(m,2H),1.48-1.55(m,2H),1.59-1.66(m,2H),1.72-1.81(m,1H),1.84-2.03(m,2H),2.18(s,3H),2.21-2.30(m,3H),2.33-2.40(q,1H),2.65-2.69(t,2H),3.18-3.26(m,2H),3.57-3.60(t,2H),4.15-4.12(t,2H),7.43-7.44(m,1H),8.09-8.10(d,1H),8.14-8.15(d,1H).
MS m/z＝335ES+[M+H]+,335CI[M+H]+
制备53：7-氨基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]庚酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备42开始，以产生橙色胶(37mg，72％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.32-1.37(m,4H),1.44-1.51(m,2H),1.57-1.65(m,2H),1.72-1.82(m,1H),1.83-2.03(m,2H),2.18-2.30(m,6H),2.33-2.40(q,1H),2.65-2.68(t,2H),3.18-3.26(m,2H),3.57-3.60(t,2H),4.12-4.15(t,2H),7.43-7.44(m,1H),8.09-8.10(d,1H),8.14-8.15(d,1H).
MS m/z＝349ES+[M+H]+,349CI[M+H]+
制备54：2-(2-氨基乙氧基)-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]乙酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备43开始，以产生橙色胶(27mg，84％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.72-1.82(m,1H),1.84-2.03(m,2H),2.18(s,3H),2.22-2.30(m,1H),2.34-2.40(q,1H),2.86-2.89(t,2H),3.18-3.26(m,2H),3.55-3.58(t,2H),3.66-3.68(t,2H),4.00(s,2H),4.16-4.19(t,2H),7.44-7.45(m,1H),8.10(d,1H),8.15(d,1H).
MS m/z＝323ES+[M+H]+,323CI[M+H]+
制备55：N-(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)-N'-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]丁二酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备44开始，以产生橙色胶(59mg，88％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.70-1.80(m,5H),1.86-2.03(m,2H),2.18(s,3H),2.21-2.30(m,1H),2.33-2.40(q,1H),2.44-2.52(m,4H),2.76-2.80(t,2H),3.18-3.26(m,4H),3.48-3.51(t,2H),3.55-3.63(m,12H),4.11-4.14(t,2H),7.43-7.44(m,1H),8.10(d,1H),8.15(d,1H).
MS m/z＝524ES+[M+H]+,524CI[M+H]+
制备56：1-氨基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
标题化合物通过上述制备46的一般方法，从制备45开始，以产生橙色胶(55mg，85％)而制得。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.71-1.81(m,1H),1.84-2.03(m,2H),2.18(s,3H),2.22-2.30(m,1H),2.33-2.40(q,1H),2.45-2.48(t,2H),2.78-2.80(t,2H),3.18-3.25(m,2H),3.50-3.53(t,2H),3.58-3.62(m,14H),3.71-3.74(t,2H),4.13-4.15(t,2H),7.44-7.45(m,1H),8.10(d,1H),8.15-8.16(d,1H).
MS m/z＝469ES+[M+H]+,469CI[M+H]+
制备57：4-巯基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]丁酰胺
将2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙胺(制备12)(1100mg，4.971mmol)在水(10mL)中的溶液用γ-硫代丁内酯(861μL，9.94mmol)处理并将反应混合物热至60℃过夜。然后在真空中将其蒸发而留下无色胶，将其从MeOH预吸附到二氧化硅上。然后将其在40g ISCO柱上，用EtOAc至EtOAc:MeOH:NH380:20:1洗脱来进行色谱。在真空中蒸发适当部分以产生无色胶状的标题化合物，690mg。收率＝43％。
1H NMR(400Mhz,CD3OD):δ＝1.77-2.06(m,6H),2.22-2.35(m,6H),2.41-2.51(m,3H),3.26-3.32(m,H),3.58-3.61(t,2H),4.13-4.15(t,2H),7.45-7.47(m,H),8.11-8.12(d,H),8.17(d,H).MS m/z＝324ES+[M+H]+和322CI-[M-H]-
实施例
实施例1
使用下列步骤将制备4的半抗原偶联于白喉类毒素蛋白。
a)获得黄色油状的半抗原并储存在2-8℃下直到使用当天(长达一个星期，较长的储存在-20℃)。以每mL溶液50mg半抗原将该油溶解在没有Ca或Mg的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)或去离子水中。结果为黄棕色悬浮液或溶液。
b)分别地，获得浓白喉类毒素(DT)的等份并使用凝胶过滤脱盐柱(Bio-Rad)，将DT的缓冲液变为DPBS。来自柱的洗脱液为4mL溶液，当以使用牛血清白蛋白标准曲线的Bradford分析(Coomassie亮蓝试剂，PierceChemical)测定时为约11mg/mL。将其的等份用另外的DPBS稀释以获得4mL溶液，DPBS中的5mg/mL蛋白。
c)使该DT的等份与丁二酸酐反应以产生修饰的丁二酰化的白喉类毒素。将DPBS中的4mL的DT的等份与80mg固体状丁二酸酐合并，并在室温下放在管辊上温和摇动3h。应指出，使用此方法，终产物不是澄清溶液。在3h反应时间结束时，将等份加入凝胶过滤脱盐柱并洗脱入DPBS，以除去未反应的小分子组分。这将样品的体积总计增加至6mL。
d)将28mg固体状的磺基-N-羟基丁二酰亚胺(s-NHS)加至6mL丁二酰化的DT等份，并通过颠倒试管及温和混合使s-NHS溶解。然后将28mg固体状的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)加至混合物，并通过颠倒试管及温和混合来溶解。将反应混合物(丁二酰化的DT/EDC/s-NHS)在室温下温育10min，添加200μL上述制备的半抗原溶液并使用Vortex将反应混合物稍微搅拌以混合。
e)将混合物在室温下在管辊上温和摇动反应3-4小时。在反应时间结束时，将等份加入凝胶过滤脱盐柱并洗脱入DPBS，以除去未反应的小分子组分。这将缀合物样品的体积总计增加至8mL。然后使用3k MWCO离心超滤器(Millipore)将这8mL洗脱液浓缩至约3.0-3.5mL。
f)使用牛血清白蛋白标准品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮蓝试剂)分析检测最终缀合物的蛋白含量，并且最终浓度测定为2.3mg/mL。使用紫外光谱法在250-270nm区比归一化蛋白含量的未缀合对照分析缀合物的半抗原并入，并发现相对于原始类毒素，在该区中有更强的抗体吸附(antibodiesorb)。还通过SDS-PAGE电泳分析缀合物和使用LAL分析检测内毒素含量。最后，将100μg缀合物样品水解并使用反相HPLC分析以测定每个蛋白分子所并入的半抗原的数目。发现半抗原-DT缀合物每蛋白单体具有19个半抗原。
g)最后将样品通过0.22μm注射滤器过滤灭菌并在无菌条件下再分成0.5mL等份。这些无菌等份分别储存在-80℃直至在干冰上运输到研究位置。
实施例2
使用上述实施例1的一般方法将制备12的半抗原偶联于白喉类毒素蛋白，具有下列改变：在步骤d)中，将186μL半抗原溶液加至反应混合物；且在步骤f)中，最终浓度测定为3.3mg/mL，并且发现半抗原-DT缀合物每个蛋白单体具有13个半抗原。
实施例3
使用上述实施例1的一般方法将制备7的半抗原偶联于白喉类毒素蛋白，在步骤c、e和f中具有下列改变。
在步骤c)中，将3mL部分的等份加入凝胶过滤脱盐柱且洗脱入DPBS，以除去未反应的小分子组分，由此纯化的样品的体积总计增加至4mL；步骤d)如下进行：将80μL半抗原溶液加至4mL丁二酰化的DT等份，并轻轻颠倒以混合。然后，将28mg固体状的磺基-N-羟基丁二酰亚胺(s-NHS)加至混合物，并通过颠倒试管及温和混合来溶解。最后，将28mg固体状的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)加至混合物，并通过颠倒试管及温和混合来溶解。
在步骤e)中，使混合物反应2小时，洗脱之后缀合物样品的体积总计增加至6mL，然后使用10k MWCO离心超滤器(Millipore)将6mL洗脱液浓缩至约2.5-3.0mL。
在步骤f)中，最终浓度测定为2.4mg/mL，并且发现半抗原-DT缀合物每个蛋白单体具有14.5个半抗原。
实施例4
使用上述实施例1的一般方法将制备8的半抗原偶联于白喉类毒素蛋白，具有下列改变：如下进行步骤d)：将120μL半抗原溶液加至6mL丁二酰化的DT等份。用Vortex将反应混合物稍微搅拌。然后添加28mg固体状的磺基-N-羟基丁二酰亚胺(s-NHS)，并通过颠倒试管及温和混合来溶解。最后，将28mg固体状的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)加至混合物，并通过颠倒试管及温和混合来溶解；并且在步骤中f)，最终浓度测定为2.5mg/mL，并且发现半抗原-DT缀合物每个蛋白单体具有19.3个半抗原。
实施例5
如下述方法所述将来自制备24-34和46-56的半抗原-间隔基缀合物偶联于白喉类毒素蛋白。
a)获得黄色油状的半抗原-间隔基缀合物并储存在2-8℃下直到使用当天(长达一个星期，较长的储存在-20℃)。以每mL溶液50mg半抗原将该油溶解在没有Ca或Mg的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)中。结果为黄棕色悬浮液或溶液。制备33不完全溶解在去离子水中，所以进一步溶解在50％甲醇中至每mL溶液25mg半抗原-间隔基缀合物的最终浓度。
b)分别地，获得浓白喉类毒素(DT)的等份并使用凝胶过滤脱盐柱(Bio-Rad)，将DT的缓冲液变为DPBS。来自柱的洗脱液为4mL溶液，当以使用牛血清白蛋白标准曲线的Bradford分析(Coomassie亮蓝试剂，PierceChemical)测定时为约11mg/mL。将其的等份用另外的DPBS稀释以产生2mL溶液，DPBS中的5mg/mL蛋白。
c)将该DT的等份与丁二酸酐反应以产生修饰的丁二酰化的白喉类毒素。将DPBS中的2mL DT的等份与40mg固体状的丁二酸酐合并，并在室温下放在管辊上温和摇动3小时。应指出，使用此方法，终产物不是澄清溶液。在3h反应时间结束时，将等份加入凝胶过滤脱盐柱并洗脱入DPBS，以除去未反应的小分子组分。这将样品的体积总计增加至3mL。
d)将9mg固体状的磺基-N-羟基丁二酰亚胺(s-NHS)加至3mL DT等份，并通过颠倒试管及温和混合使s-NHS溶解。然后将9mg固体状的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)加至混合物，并通过颠倒试管及温和混合来溶解。将50μL的上述制得的半抗原-间隔基缀合物溶液(制备33为100μL)加至反应混合物(丁二酰化的DT/EDC/s-NHS)。
e)将混合物在室温下在管辊上并轻轻摇动反应3-4小时。在反应时间结束时，将等份加入凝胶过滤脱盐柱且洗脱入DPBS，以除去未反应的小分子组分。这将缀合物样品的体积总计增加至4mL。
f)使用牛血清白蛋白标准品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮蓝试剂)分析检测最终缀合物的蛋白含量，并且最终浓度测定如表1所示。使用紫外光谱法在250-270nm区比归一化蛋白含量的未缀合对照分析缀合物的半抗原并入，并发现相对于原始类毒素，在该区中有更强的抗体吸附。还通过SDS-PAGE电泳分析缀合物和使用LAL分析检测内毒素含量。最后，将100μg缀合物样品水解并使用反相HPLC分析以测定每个蛋白分子所并入的半抗原的数目。测试样品的半抗原装载详述于下表1和2中。
g)最后将样品通过0.22μm注射滤器过滤灭菌并在无菌条件下再分成1.0mL等份。这些无菌等份分别储存在-80℃直至在干冰上运输到研究位置。
表1
缀合物 蛋白浓度(mg/ml) 半抗原装载
DT-半抗原-间隔基制备24 1.69 11
DT-半抗原-间隔基制备25 1.82 21
DT-半抗原-间隔基制备26 1.84 22
DT-半抗原-间隔基制备27 2.22 16
DT-半抗原-间隔基制备28 1.91 16
DT-半抗原-间隔基制备29 1.60 19
DT-半抗原-间隔基制备30 1.81 14
DT-半抗原-间隔基制备31 2.18 15
DT-半抗原-间隔基制备32 1.62 15
DT-半抗原-间隔基制备33 1.51 11
DT-半抗原-间隔基制备34 1.78 14
表2
缀合物 蛋白浓度(mg/ml) 半抗原装载
DT-半抗原-间隔基制备46 1.39 3.6
DT-半抗原-间隔基制备47 1.56 23.6
DT-半抗原-间隔基制备48 1.43 22.8
DT-半抗原-间隔基制备49 1.41 19.2
DT-半抗原-间隔基制备50 1.58 19.7
DT-半抗原-间隔基制备51 1.48 14.2
DT-半抗原-间隔基制备52 1.57 11
DT-半抗原-间隔基制备53 1.60 12.1
DT-半抗原-间隔基制备54 1.89 29.3
DT-半抗原-间隔基制备55 1.32 12.6
DT-半抗原-间隔基制备56 1.45 20.9
实施例6
具有反应性胺基团的半抗原也可缀合于白喉类毒素而无需添加丁二酸酐。制备12的半抗原缀合于白喉类毒素的实例描述于下，但也可使用制备4、7、8、24-34和46-56进行。
a)获得黄色油状的半抗原-间隔基缀合物并储存在2-8℃下直到使用当天(长达一个星期，较长的储存在-20℃)。。以每mL溶液50mg半抗原将该油溶解在没有Ca或Mg的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)中。结果为黄棕色悬浮液或溶液。
b)分别地，获得浓白喉类毒素(DT)的等份并使用凝胶过滤脱盐柱(Bio-Rad)，将DT的缓冲液变为DPBS。来自柱的洗脱液为4mL溶液，当以使用牛血清白蛋白标准曲线的Bradford分析(Coomassie亮蓝试剂，PierceChemical)测定时为约11mg/mL。将其的等份用另外的DPBS稀释以产生2mL溶液，DPBS中的5mg/mL蛋白。
c)将9mg固体状的磺基-N-羟基丁二酰亚胺(s-NHS)加至2mL DT等份，并通过颠倒试管及温和混合使s-NHS溶解。然后将9mg固体状的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)加至混合物，并通过颠倒试管及温和混合来溶解。将50μL的上述制得的半抗原溶液加至反应混合物(DT/EDC/s-NHS)。在此阶段以逐滴加入1M HCl将pH降至pH 5.6。
d)将混合物在室温下在管辊上并轻轻摇动反应3-4小时。在反应时间结束时，将等份加入凝胶过滤脱盐柱且洗脱入DPBS，以除去未反应的小分子组分。这将缀合物样品的体积总计增加至3mL。
e)使用牛血清白蛋白标准品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮蓝试剂)分析检测最终缀合物的蛋白含量，并且最终浓度测定为3.01mg/mL。使用紫外光谱法在280nm区比归一化蛋白含量的未缀合对照分析缀合物的半抗原并入，并发现相对于原始类毒素，在该区中有更强的抗体吸附。还通过SDS-PAGE电泳分析缀合物和使用LAL分析检测内毒素含量。最后，将100μg缀合物样品水解并使用反相HPLC分析以测定每个蛋白分子所并入的半抗原的数目。发现半抗原-DT缀合物每蛋白单体具有11.6个半抗原。
g)最后将样品通过0.22μm注射滤器过滤灭菌并在无菌条件下再分成1.0mL等份。这些无菌等份分别储存在-80℃直至在干冰上运输到研究位置。
实施例7
制备12也可偶联于CRM197缀合于白喉类毒素。诸如缀合的实例如下。虽然没有显示，但同样的方法也可以应用于其他含胺的半抗原，如4、7、8、24-34和46-56。
a)获得黄色油状的来自制备12的半抗原并储存在-20℃下。以每mL溶液50mg半抗原将该油溶解在没有Ca或Mg的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)中。结果为黄棕色悬浮液或溶液。
b)分别地，将20mL浓CRM197(5.91mg/mL)的等份从-80℃解冻至2-8℃。取8.62mL的解冻材料的等份并用1.38mL的DPBS稀释以产生10mL溶液，DPBS中的5mg/mL蛋白。
c)将500μL上述制得的半抗原溶液加至10mL CRM197溶液，这缓慢且逐滴加入，然后在管辊上反应5min。
d)在此时间之后，然后将90mg固体状的磺基-N-羟基丁二酰亚胺(s-NHS)加至10mL CRM197溶液。通过颠倒试管及温和混合使s-NHS溶解。然后溶液在管辊上反应5min。
e)5min之后，将90mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)加至CRM197溶液，再次为固体，并通过颠倒试管及温和混合使其溶解。在此阶段以逐滴加入1M HCl将pH调节至pH 5.6。
f)然后将反应混合物转移到冷房(2-8℃)，并在管辊上反应6小时。
g)在反应时间结束时，使用5x NAP25柱将样品脱盐入dPBS以除去过量未反应的试剂(ON：2mL，OFF：3mL)。最终体积增加至15mL。
h)使用牛血清白蛋白标准品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮蓝试剂)分析检测最终缀合物的蛋白含量，并且最终浓度测定为2.88mg/mL。使用紫外光谱法在280nm区比归一化蛋白含量的未缀合对照分析缀合物的半抗原并入，并发现相对于原始类毒素，在该区中有更强的抗体吸附。还通过SDS-PAGE电泳分析缀合物和使用LAL分析检测内毒素含量。最后，将100μg缀合物样品水解并使用反相HPLC分析以测定每个蛋白分子所并入的半抗原的数目。发现半抗原-CRM197缀合物每蛋白单体具有8.0个半抗原。
i)最后将样品通过0.22μm注射滤器过滤灭菌并在无菌条件下再分成1.0mL等份。这些无菌等份分别储存在-80℃直至在干冰上运输到研究位置。
实施例8
发现通过增加反应混合物的sNHS/EDC浓度，可以控制装载于载体蛋白的半抗原的量。制备7缀合于白喉类毒素的实例如下。该方法如实施例6中所述，但在步骤中c和e具有下列改变。
在步骤中c)：在此阶段中，磺基-N-羟基丁二酰亚胺(s-NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)加至2mL脱盐DT的等份的量可以改变。在此实验中，将9mg的sNHS和EDC加至一等份(这称为条件2)和36mg的sNHS和EDC加至另一等份(这称为条件4)。样品没有以逐滴加入1M HCl将pH调节至pH 5.6。
在步骤e)中：对于使用条件2制备的缀合物，最终浓度测定为3.14mg/mL，并且发现半抗原-DT缀合物每个蛋白单体具有8.3个半抗原。对于使用条件4制备的缀合物，最终浓度测定为2.46mg/mL，并且发现半抗原-DT缀合物每个蛋白单体具有13.2个半抗原。
实施例9
经由溴乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯(BAANS)缀合化学制备CRM197和福尔马林失活白喉类毒素(DT)上的巯化半抗原-间隔基缀合物。
a)使用10DG脱盐柱(Pierce)(ON：3mL，OFF：4mL)，将3mL的CRM197(17.73mg，5.91mg/mL)和3mL的DT(24mg，8mg/mL)解冻和脱盐入100mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0。使用相同的缓冲液将浓度调节至4mg/mL。
b)取1mL脱盐的CRM197的等份和DT样品并冷却至2-8℃。
c)将20mg制备57的半抗原-间隔基缀合物溶解在300μL DMSO和700μL dPBS中至20mg/mL的最终浓度。
d)将500μL(10mg)的半抗原-间隔基缀合物溶液加至500μL预洗的TCEP((三(2-羧乙基)膦))凝胶(Pierce)，在室温下温育3小时并搅搅拌。将剩余的半抗原溶液冷冻于-20℃长期贮存。
e)90分钟到步骤(d)，将10mg的BAANS(Sigma)溶解在500μL DMSO中至20mg/mL的最终浓度。
f)将1.5mg(75μL)的BAANS缓慢且逐滴地加至1mL的DT/CRM197(4mg/mL)。使其在<11℃下反应90min。(每mg CRM197/DT添加0.375mgBAANS)。
g)90min之后，仍在<11℃下操作，使用NAP 10柱(1mL on，1.5mL off)将溴乙酰化的CRM197/DT脱盐入冷100mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH9.1。
h)从TCEP凝胶吸出半抗原-间隔基缀合物，再次缓慢且逐滴地将250μL(5mg)半抗原-间隔基缀合物加进活化的CRM197/DT样品，并混合以防止形成浓度梯度。
i)添加半抗原-间隔基缀合物之后，如果需要，检查pH并滴加0.1M氢氧化钠/HCl调节至9.1。
j)将反应混合物保持于无光下(antibodiesence of light)，并搅拌18小时。
k)在此时间之后，将2μL的N-乙酰基半胱胺(NAC)加至各反应混合物，再次在无光下反应3小时并搅拌(每g CRM197/DT 0.5mL)。
l)反应之后，使用10DG脱盐柱(BioRad)(3mLon，4mLoff)将其脱盐入Dulbecco PBS。
m)最后将样品通过0.22μm注射滤器过滤灭菌并在无菌条件下等分。将这些无菌等份储存在2-8℃直至运到研究位置。
n)使用牛血清白蛋白标准品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮蓝试剂)分析检测最终缀合物的蛋白含量，并且最终浓度测定为1.59mg/mL。还通过SDS-PAGE电泳分析缀合物和使用LAL分析检测内毒素含量。最后，将150μg缀合物样品水解并使用反相HPLC分析以测定每个蛋白分子所并入的半抗原的数目。发现半抗原-CRM197缀合物每蛋白单体具有11.6个半抗原。
实施例10
发现通过增加反应混合物的BAANS浓度，可以控制装载于载体蛋白上的半抗原/半抗原-间隔基缀合物的量。制备57缀合于CRM197的实例如下。
a)使用10DG脱盐柱(BioRad)(on：3mL，off：4mL)，将9mL的CRM197(53.19mg，5.91mg/mL)解冻和脱盐入100mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0。使用相同的缓冲液将浓度调节至4mg/mL。
b)将30mg制备57的半抗原-间隔基缀合物溶解在1.5mL DMSO中(最终浓度20mg/mL)。
c)在添加1.5mL含半抗原-间隔基缀合物的溶液之前，通过在dulbeccoPBS中洗涤二次来制备1mL TCEP凝胶(Pierce)。然后将其于2-8℃下在旋转台上温育2小时。
d)TCEP温育1小时之后，将10mL的4mg/mLCRM197溶液分成不同反应容器中的5x2mL等份，并在冷房储存30min以将溶液的温度调节至2-8℃。所有后续步骤在2-8℃下进行。
e)同时，通过将20mg BAANS溶解在1mL DMSO中来制备BAANS的储备溶液。将5个反应容器标记为条件1、2、3、4或5。CRM197等份的温度调节至2-8℃之后，将变化量的BAANS溶液(50μL、100μL、150μL、225μL和300μL)加至5×2mL反应容器，如表2指示。缓慢地(逐滴)添加BAANS溶液并搅拌。
f)使等份在旋转台上于2-8℃下反应30min。
g)30min温育之后，使用NAP25(Gibco)柱(ON：2mL，OFF：3mL)，将5×2mL溴乙酰化的CRM197脱盐入100mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，pH 9.1。
h)将TCEP凝胶从半抗原样品离心出来，并将5.6mg(280μL)的半抗原-间隔基缀合物加至(缓慢地，逐滴)各个脱盐的溴乙酰化的CRM197样品，并混合。将反应容器覆盖铝箔，以使内容物避光。
i)使混合物在旋转台上反应18小时。
j)通过将0.5mL NAC/g CRM197(因此每反应4μL)加至反应混合物淬灭未反应的BrAc基团。使混合物在旋转台上反应3小时(仍覆盖在铝箔中以避光)。
k)最后，使用DG10柱(ON：3mL，OFF：4mL)将各反应脱盐入dulbeccoPBS。最终体积为4mL。
i)最后将样品通过0.22μm注射滤器过滤灭菌并在无菌条件下等分。将这些无菌等份储存在2-8℃直至运到研究位置。
m)使用牛血清白蛋白标准品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮蓝试剂)分析检测最终缀合物的蛋白含量，并且测定的最终浓度示于表3中。还通过SDS-PAGE电泳分析缀合物和使用LAL分析检测内毒素含量。最后，将450μg每种缀合物样品水解并使用反相HPLC(N＝3)分析以测定每个蛋白分子所并入的半抗原的数目(半抗原装载数据示于表5中)。
表3
表4
缀合物 蛋白浓度(mg/ml)
CRM197-制备57条件1 1.76
CRM197-制备57条件2 1.79
CRM197-制备57条件3 1.73
CRM197-制备57条件4 1.57
CRM197-制备57条件5 1.63
表5
实施例11
通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用10μg实施例1-4的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和50μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(Charles River,Montreal,QC.)(n＝12每组)免疫接种。如上所述以ELISA测量血浆中的抗烟碱IgG抗体水平。
结果示于图1中，从其可知，初始注射4周之后，对于各个测试的缀合物，获得强抗烟碱抗体应答，所述应答是持续，或者在各第一和第二激发注射2周之后增加。
实施例12
通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用10μg实施例1-4的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和50μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。如上所述，亲和性指数对应于从烟碱-BSA涂覆的板洗脱50％抗烟碱抗体所需要的硫氰酸铵的浓度。
结果示于图2中，从其可知，初始注射4周之后，通过测试的缀合物，抗体在小鼠中表现出高亲和性，其为持续的，或者在各第一和第二激发注射2周之后增加。
实施例13
通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用10μg实施例1-4的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和50μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝6每组)免疫接种。如上所述，在最后激发2周之后，通过静脉内注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出脑，定量3H水平和测定3H的脑/血浆比例。
结果示于图3中，从其可知，测试的缀合物的血浆/脑比例显著大于对照动物，这表明由测试的缀合物诱发的抗体对烟碱具有特异性，并且螯合血液中的烟碱并防止烟碱摄入脑中。
实施例14
通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用10μg实施例1-4的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和50μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。如上所述，在第二激发2周之后，通过竞争ELISA证实抗烟碱抗体与烟碱的相互作用。
结果示于图4中，从其可知，由测试的缀合物诱发的抗体识别且结合烟碱。
实施例15
通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用10μg实施例1和2的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和50μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。如上所述，在第二激发2周之后，通过竞争ELISA确定抗烟碱抗体对烟碱、可替宁、乙酰胆碱和伐尼克兰的特异性。
结果示于图5中，从其可知，随着添加的烟碱的量增加，存在抗烟碱抗体结合烟碱-涂覆的ELISA板的剂量依赖性抑制。然而，用伐尼克兰、可替宁或乙酰胆碱没有观察到这样的效果，这表明由测试的缀合物诱发的抗体对烟碱有特异性，对可替宁、伐尼克兰或乙酰胆碱没有特异性。
实施例16
通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用10μg实施例5的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和50μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。如上所述，通过ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。
结果示于图6、7、8和9中，从其可知，初始注射4周之后，对于各个测试的缀合物获得非常强的抗烟碱抗体应答，所述应答在激发2周之后后提高。此外，抗烟碱抗体的水平以及抗烟碱抗体的亲和性都非常依赖于所用的间隔基。另外，所有测试的缀合物产生高于对照动物的血浆/脑比例，这表明由测试的缀合物诱发的抗体可螯合血液中的烟碱并防止其摄入脑中至大于对照动物的程度。
实施例17
通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用10μg实施例6和7的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和50μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。通过ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。如上所述，在最后激发2周之后，通过静脉内注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H水平和测定3H水平相对于对照动物的％改变。
结果示于图12(抗烟碱抗体水平)和13(3H水平的％改变)中，从其可知，对于各测试的缀合物获得免疫应答，所述应答以剂量依赖性方式反应增加。这表明DT和CRM197均为烟碱衍生的半抗原的适合载体。此外，所有测试的缀合物使得进入脑的3H-烟碱的水平低于对照动物，这表明由测试的缀合物诱发的抗体可螯合血液中的烟碱并防止其摄入脑中至大于对照动物的程度。
实施例18
通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用10μg实施例6、7和8的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和50μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝12每组)免疫接种。通过ELISA测量血浆中的抗烟碱IgGAb水平。如上所述，在最后激发2周之后，通过iv注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H水平和测定相对于对照动物的3H水平的％改变。
结果示于图14(抗烟碱抗体水平)和15(3H水平的％改变)中，从其可知，对于各测试的缀合物获得免疫应答，所述应答随半抗原装载而增加。此外，所有测试的缀合物使得进入脑中的3H-烟碱水平低于对照动物，这表明由测试的缀合物诱发的抗体可螯合血液中的烟碱并防止其摄入脑中至大于对照动物的程度。
实施例19
通过肌肉内注射，用10μg实施例7的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和10μg CpG 24555存在下或在ISCOMATRIX(IMX；0.1-3.0单位)存在下，将BALB/c小鼠(n＝10每组)免疫接种。通过ELISA测量血浆中的抗烟碱IgG Ab水平(第21和28天)并通过抑制ELISA测量亲和性。结果示于图16和17中，从其可知，使用CpG 24555和氢氧化铝作为组合佐剂或者使用ISCOMATRIX作为唯一佐剂获得免疫应答(Ab水平和亲和性)，所述应答随ISCOMATRIX剂量增加。
在第2免疫接种1周后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H水平和测定相对于对照动物的3H-烟碱在血液和脑中的％改变。结果示于图18中，从其可知，使用CpG 24555和氢氧化铝作为组合佐剂或者使用ISCOMATRIX作为唯一佐剂使得进入脑中的3H-烟碱水平低于对照动物，这表明由测试的缀合物诱发的抗体可螯合血液中的烟碱并防止其摄入脑中至大于未免疫接种的对照动物的程度。
实施例20
如下制备下表6中所述的样品。
a)将冷冻CRM197(200mL，5.9mg/mL)的在4℃下解冻过夜。
b)一旦解冻，通过使用具有10kD分子量截止的Kvick Start聚醚砜(PES)膜的超滤(UF)将CRM197从200mL浓缩至100mL。
c)使用50mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，50mM NaCl，pH 7.2，将浓缩的CRM197渗滤(DF)8TOV(翻转体积)。使用SARTOPORE 2150无菌胶囊滤器将UF/DF后的CRM197过滤。
d)通过使用0.942的消光系数，于A280测量吸光度来测定CRM197的浓度。浓度测定为9.65mg/mL。
f)使用50mM MOPS，50mM NaCl，pH 7.2，将UF/DF后的CRM197从9.65mg/mL稀释至7.18mg/mL。
g)在另外的容器中，将6M HCl溶液(7.46mL)缓慢加至7460mg制备12的半抗原，同时在冰浴中冷却。然后添加50mM MOPS，50mM NaCl,pH7.2缓冲液(2.00mL)并以pH试纸检查pH。PH为约9。以小增加单位添加6M盐酸，直至达pH 7.5(添加1.70mL HCl)。溶液的总体积为18.65mL，获得400mg/mL的制备12的半抗原的浓度。
h)在另外的容器中，将7000mg磺基-N-羟基丁二酰亚胺(sNHS)溶解在50mM MOPS，50mM NaCl，pH 7.2溶液(14mL)中，并以小增加单位添加19.25M NaOH溶液直至达7.13的pH(添加1.44mL的NaOH)。溶液的总体积为18.50mL，获得378mg/mL的sNHS的浓度。
i)在另外的容器中，将8000mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解在5mL的50mM MOPS,50mM NaCl,pH 7.2中。溶液的总体积为12.0mL，获得666mg/mL的EDC的浓度。仅在缀合反应之前最后制造EDC溶液。
j)以产生表6中所列的24个样品的方式组合UF/DF后的CRM197、制备12的半抗原、sNHS和EDC溶液。关于24个样品，将正确计算的量的溶液以下列方式混合在一起：合并UF/DF CRM197、制备12的半抗原和sNHS并检查将混合物的pH。对于样品10和18，使用1N NaOH将pH进一步调节pH至约7.5。最后，将EDC加至样品。将每个反应管稍微振荡并在15℃下于水浴中温育18hr。
k)温育18小时之后，使用具有30kD分子量截止的Amicon超离心浓缩机将样品进行缓冲液交换。所使用的缓冲液为20mM磷酸钾、20mM组胺酸，pH 7.0。使用市售微BCA试剂盒测定蛋白浓度。
l)将200mg/mL蔗糖溶解在水中，并以1:1(体积)比加至24个缀合的样品的每一个。随后添加PS80至0.2mg/mL的最终浓度。将样品短期储存于4℃，长期储存于-20℃。
表6
用于检查样品1-24的分析方法详述如下：
SELDI-MS
表面增强激光解析电离(SELDI)为用于分析蛋白混合物的质谱的电离方法。分析报道通过缀合过程的CRM197支架(scaffold)的净质量增加。质量的改变报道为支架的加合物。在理想的情况下，加合物应当等同于半抗原特异性表位密度分析。加合物＝(质量缀合物-质量支架)/质量半抗原。请注意，超过ED值的加合物水平表示除了半抗原以外的质量加至支架；并且加合物高的样品在HMMS中也高。
尺寸排阻色谱
开发用于解析HMMS(高分子量物质)、二聚体、单体和LMMS(低分子量物质)的尺寸排阻分析以了解影响这些组分的相对丰度的方法参数。该方法报道HMMS峰组、二聚体、单体和LMMS峰组的相对面积百分比。请注意，起始材料的方法化学计量和比例影响HMMS、二聚体、单体和LMMS之间峰面积的表观分布。
表位密度
开发偶联于酸水解样品制备的反向液相色谱分析以测定半抗原缀合于CRM197载体蛋白的量。半抗原分子经由酰胺键缀合于CRM197支架；根据标准水解化学，该键被水解以释放半抗原以及取代基氨基酸。缀合的半抗原7的量为方法一致性、产物质量和效力的量度。
样品1-24的表征结果示于表7中。此数据显示效力和偶联于CRM197的半抗原表位密度之间的密切关系。此外，表明最佳表位密度值与高单体、低HMMS和低加合物有关。
表7
实施例21
通过肌肉内注射，用10μg样品1-24(参见实施例20，表6和7)，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μg Al3+)和10μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝10每组)免疫接种。通过ELISA(在第21和28天)测量血浆中的抗烟碱IgG Ab水平，并通过抑制ELISA测量亲和性。结果示于图19和20中，从其可知，对于各测试的缀合物获得免疫应答，所述应答随％单体增加，并且在每单位载体装载10-18个半抗原时是最佳的。
在第二次免疫接种1周后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi 3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H水平和测定相对于对照动物的3H-烟碱在血液和脑中的％改变。结果示于图21和22中，从其可知，所有测试的缀合物使得进入脑中的3H-烟碱水平低于未免疫接种的对照动物，这表明由测试的缀合物诱发的抗体可螯合血液中的烟碱并防止其摄入脑中至大于对照动物的程度，而且效力随％单体增加(图21)，并且在每单位载体装载10-18个半抗原时是最佳的(图22)。
实施例22
测试样品1-24(参见实施例20，表6和7)结合Alhydrogel。通过肌肉内注射，用10μg这些不同的缀合物，在氢氧化铝(alum；Alhydrogel-85：40μgAl3+)和10μg CpG 24555存在下，将BALB/c小鼠(n＝10每组)免疫接种。在第二次免疫接种1周后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3μCi3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H水平和测定相对于对照动物的3H-烟碱在血液和脑中的％改变。结果示于图23中，从其可知，如通过3H-烟碱在脑中的量较大的减少所证实的，具有较高％单体含量的缀合物具有较高的％结合Alhydrogel，并且这与较高的效力有关。

Claims (7)

1.式(I)的半抗原：
其中
W为-CH2-或-O-；并且
X为-NH2或-SH。
2.权利要求1的半抗原，其中W位于吡啶环的位置2、5或6。
3.权利要求1或2的半抗原，其中所述半抗原选自：
4.式(II)的半抗原-间隔基缀合物：
其中
W为-CH2-或-O-；
-(间隔基)-为C1-C8亚烷基、C3-C10环亚烷基或者被1-4个氧原子中断并且任选地被-N(H)C(O)-中断的C1-C12亚烷基；并且
X为-NH2或-SH。
5.权利要求4的半抗原-间隔基缀合物，其中X为-SH。
6.权利要求4的半抗原-间隔基缀合物，其中X为-NH2。
7.权利要求4-6中任一项的半抗原-间隔基缀合物，其中-(间隔基)-为C1-C8亚烷基。
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