CN104937411B - 用于管理透析治疗的门户和方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于通过使用微流体系统来护理点检测腹膜透析液样本中的中性粒细胞的系统和方法。基于免疫分析的芯片被配置成在使中性粒细胞结合至微流体通道表面，同时使辅助的细胞和微粒独立并悬浮在样本中并且可采用洗涤缓冲液冲洗。处理表示由(可任选地无透镜的)成像系统形成的中性粒细胞的图像的数据以基于包括微流体通道的特性在内的统计参数来确定中性粒细胞的计数。

Description

用于管理透析治疗的门户和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月24日提交并且标题为“Portal for Management ofPeritoneal Dialysis Therapy(用于管理腹膜透析治疗的门户和方法)”的美国临时专利申请序列号61/704,692的权益和优先权。上述临时专利申请的公开内容通过引用整体结合于此。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明是在政府支持下基于资助号码R01AI081534、W81XWH-10-1-1050、和R21AI087107作出的。政府拥有本发明中的特定权利。
技术领域
本发明涉及一种适合于基于体液样本的护理点(point-of-care)测量来加快所需治疗的确定的系统和方法。
背景技术
在医疗保险计划(Medicare program)下可用的基金的很大部分–在2009年超过8％-是针对终末期肾病(ESRD)患者的治疗和药物，这强调了该领域的医学治疗的重要性。然而，如相关统计数据所证实的，所寻求的治疗的成功基本保持很低。例如，根据1999－2004国家健康和营养检验调查(NHANES)，美国成年群体中慢性肾脏疾病(CKD)的患病率为总体美国20岁及以上群体的约16.8％，这表明与1988年确定的数字相比显著增加。对于具有ESRD的CKD患者，通常要求肾脏移植或透析以保留任何残余肾功能。全世界数百万人正在接受肾脏移植治疗，并且这个数字以每年8％的速度增长。用于ESRD的治疗在公共和私人支出两者方面共计达395亿美元。
到目前为止，体液样本的检查提供对患者护理的支持。例如，血液透析(HD)和腹膜透析(PD)是目前用于治疗晚期和永久肾衰竭所使用的方法。在美国，PD患者共计达全部透析患者的约7％，与之相比，在美国以外(加拿大、墨西哥、欧洲、亚洲)的地区相比这个数字高得多(在35％和80％之间)。PD治疗被认为比HD治疗每年每患者要显著便宜得多。正在涌现多项鼓励以使患者保持PD治疗。例如，患者可立即获得PD承保范围(coverage)的资格，而HD承保范围是在90天宽限期之后才开始。因此，HD可被许多患者认为不方便的，这些患者将发现每周去几次HD中心是困难的并且每次访问在HD过程上花费3到5小时，该HD过程需要来自保健团队的支持。不过，HD和PD过程两者都被发现是十分有用的。
包括家庭血液透析和PD在内的以家庭为基础的治疗，由于较低花费和较高患者满意度，将提供对现有HD和PD的实现方式的有利替代。以家庭为基础的PD实现方式的障碍部分在于复发腹膜炎或腹膜炎症的风险，这会降低腹膜的过滤性并潜在地减少可用于肾脏移植的时间窗口。腹膜炎临床上被定义为在透析液中出现混浊流出物，其包含每微升超过100个白血细胞(WBC)，其中超过50％的白血细胞是中性粒细胞。PD患者每天交换PD流体2-5次。当PD过程被实现为以家庭为基础的过程时，预期患者会在每次交换时观察他们的透析液的混浊性(cloundiness/混浊度(turbidity)并且如果他们在流体中观察到混浊性)则发起对他们的看护人的呼叫。然而，基于透析液的混浊性的解释不提供精确的方法来预测腹膜炎。
因此，存在对克服上述缺点的实用方式的需要。
发明内容
本发明的实施例提供一种用于对体液样本中的目标细胞进行标识和计数的至少其中一项的系统，该系统包括具有微流体通道的网络的元件、光源、毗邻该元件定位的光学检测器、和非瞬态计算机可读介质，其中在该元件和光学检测器之间没有光学部件，以使得光学检测器适合于接收穿过元件的光，该非瞬态计算机可读介质具有用于计数流体透析液样本中的目标细胞的计算机可读程序代码。透析液样本可包括，但不限于，血液透析或腹膜透析样本。该程序代码包括一系列计算机可读程序步骤以实现(i)在已穿过微流体通道的网络的光中，获取表示形成于光学检测器的表面上的所述网络的灰度级图像(或彩色图像，或多光谱或高光谱图像)的数据，和(ii)使用现有技术的图像增强技术来处理所获取的数据以获得视觉上增强的图像，从而标准化输入图像，以及完成特征检测以标识其中包含透析液样本的载体的结构特征，以及使用形状检测和形态学标识算法来执行透析液样本中的细胞标识和计数。在一个示例中，数据的处理可包括(iia)将所获取的数据转换成表示通道的网络的灰度级图像的数据；(iib)以下的至少其中一项：在频域中过滤过滤所转换的数据和在空间域中过滤所转换的数据；以及(iic)当网络的通道包含具有所标识出的生物细胞的流体样本时，相关于通道参数和预定义的阈值来计数细胞以确定计数值。
本发明的实施例还提供用于对体液样本中的目标细胞进行标识和计数的至少其中一项的系统，该系统包括多个微流体通道；定位成将光传输穿过该多个通道的光源；光学检测器，该光学检测器毗邻多个通道定位以接收来自光源的穿过多个通道之后的光以便在光学检测器处形成表示包含在多个通道的至少一个中的样本的辐照度(irradiance)分布；以及一个或多个处理器，该一个或多个处理器具有在其上的操作计算机代码，该计算机代码配置成执行用于对样本中的目标细胞进行标识和计数的至少其中一项的方法的一个或多个步骤。这种方法包括(i)在已穿过通道的光中，获取表示形成于光学检测器的表面上的多个通道的初始图像的数据；(ii)将所获取的数据转换为表示多个微流体通道的单色图像数据；以及(iii)通过在频域和空间域的至少一个中过滤数据来处理单色图像数据。该方法可进一步包括从经处理的单色图像数据标识目标细胞和任选地计数所标识的目标细胞的步骤。
本发明的实施例附加地提供一种制品，其包括微处理器和计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于计数包含在微流体系统的通道中的流体腹膜透析液样本中的目标细胞的计算机可读编程代码。该系统包括具有一个或多个通道的微流体芯片；毗邻微流体芯片的光学检测器；和光源，该光源适合于将光穿过通道传输至光学检测器上以便在不存在成像光学部件的情况下在检测器处形成在流体腹膜透析液中样本的图像。计算机可读程序代码包括一系列的程序步骤以至少部分地基于表示所形成图像的数据从彩色级到灰度级的转换来实现目标细胞的计数。作为附加或替代，计算机可读程序代码进一步包括用于基于目标细胞位于通道的表面附近的概率和在如此定位的细胞和受体之间的键形成(bondformation)的可能性来实现细胞的计数的步骤。
本发明的实施例附加地提供一种用于标识和计数体液样本中的目标细胞中的至少一个的系统。该系统包括一个或多个计算机处理器和计算机可读介质，该计算机可读介质包括计算机代码，该计算机代码被配置成，当用于操作一个或多个计算机处理器时，执行用于对体液样本中的目标细胞进行标识和计数的至少其中一项的方法的一个或多个步骤。该系统包括具有一个或多个微流体通道的微流体芯片；毗邻微流体芯片的光学检测器；以及光源，该光源适合于将光穿过微流体通道传输到光学检测器上，以便在不存在在检测器处形成流体样本的光学共轭(optical conjugate)的光学部件的情况下在光学检测器处形成表示体液样本的辐照度分布。在这个系统中，至少部分地基于表示所形成的辐照度分布的数据到单色级的转换来完成方法的步骤(多个步骤)。
实施例附加地提供用于标识包含在流体腹膜透析液样本中的细胞的方法。这种方法包括(i)在不使用光学成像部件的情况下接收表示在已穿过包含所述流体样本的微流体通道的光中形成的中性粒细胞的图像的数据；以及(ii)基于细胞位于微流体通道的表面附加的概率和在如此定位的细胞和受体之间的键形成的可能性来处理所接收的数据以确定中性粒细胞的计数。方法可进一步包括确定中性粒稳态粘附至微流体通道的表面的概率。作为替代或附加，该方法可包括当所确定的计数超过基于用户输入可调节的阈值时生成视觉可感知的触发指示器。
实施例附加地提供用于标识和计数体液样本中的目标细胞中的至少一个的方法，该方法包括(i)提供一系统，该系统包括多个微流体通道、配置成将光传输穿过这多个通道的光源，和光学检测器，该光学检测器配置成从穿过多个通道之后的光源的光以便在检测器处形成表示流体样本的辐照度分布；(ii)将体液样本安排在多个通道的至少一个中；(iii)采用光源照射多个通道；(iv)在光传输穿过至少一个通道时在检测器处获取表示多个通道的初始图像的数据；(iv)将所获取的数据转换成单色图像数据；(v)通过在频域和空间域的至少一个中过滤这些数据来处理单色图像数据；(vi)从经处理的单色图像数据标识目标细胞；以及任选地计数所标识的目标细胞。
实施例附加地提供一种非瞬态有形计算机可读介质，其具有存储在其上的计算机代码，该计算机代码在计算机系统的一个或多个处理器上操作以执行用于对包含在体液样本中的目标细胞进行标识和计数的至少其中一项的方法，该方法包括在来自光源的已穿过多个通道中的至少一个的光中，获取表示在光学检测器的表面上的多个微流体样本中的至少一个的初始图像的数据。该方法附加地包括将所获取的数据转换成单色图像数据并通过在频域和空间域的至少一个中过滤这些数据来处理单色图像数据。该方法进一步包括从经处理的单色图像数据标识目标细胞并且，任选地，计数所标识的目标细胞。
附图说明
将通过参照结合附图的以下具体实施方式更全面地理解本发明，其中：
图1提供了示出通过采用本发明的微芯片的护理点实施例的对腹膜透析(PD)患者的感染监测的示意图A到E。
图2呈现了示出本发明的计算机程序产品和方法的操作的图像A到I。示意图J显示了在宽中性粒细胞浓度范围上通过采用芯片的实施例的中性粒细胞捕获特异性的标绘图。
图3在立体图中显示了根据本发明的实施例的适合于成像的检测器和芯片。
图4包括根据一个实施例的PD微流体芯片的图像A和B。
图5A为示出本发明的图像恢复算法的实施例的示意图。
图5B为示出将高频提升滤波的图像转换到频域的示意图。
图5C提供了描述与图5A的实施例一起使用的带通滤波器的滤波特性的等高线图和曲面图。
图6提供了与图5A的实施例的过程一起使用的盘的图像(在左边)和圆形细胞的高频提升的图像的二进制版本。
图7A和7B分别是根据本发明的实施例的表示频域滤波和空间域滤波的输出的灰度图像和黑白图像。
图8是示出图像数据处理算法的实施例的流程图。
图9呈现了示出根据本发明的实施例的CD66b+中性粒细胞捕获的建模的结果的示意图A到E。
图10是示出在针对FITC-CD66b抗体染色时中性粒细胞到芯片的表面的边界的示意图。
图11示出分别表示在注射混浊PD样本之后的芯片的通道和在PBS冲洗过程之后的相同通道的图像A和B。
图12A到12F是表示PD样本的分析的示例的FCS标绘图。
图13A到13F为示出本发明的实施例的可操作性的验证结果的标绘图。
详细描述
血液透析(hemodialysis)(也称为血液透析(haemodialysis)，或HD)是一种用于实现代谢废物(waste product)(诸如，当肾脏在肾功能衰竭的状态时来自血液的肌酸酐和尿素和游离水)的体外去除的方法。腹膜透析被用作对HD的替代，尽管它远不太常用。虽然与传统HD相比，PD提供更高的护理质量，但这两个过程都是可用的，且对于患者而言是易于实施的。可以理解，虽然在以下公开内容中，以PD作为参考，但此类参考仅用于使公开内容简洁，并且可以理解，使用HD流体或任何其他体液作为用于以下讨论的分析的样本被认为是在本发明的范围内。
腹膜透析中公认的临床障碍是腹膜炎的风险，即，腹膜的炎症。腹膜炎临床上被定义为出现了混浊透析液，其包含每微升超过100个白血细胞(WBC)的，其中超过50％的白血细胞是中性粒细胞。随着感染进展，WBC的显著增加导致更高程度的腹膜透析液的不透明性。然而，在感染的早期，混浊度的变化不是视觉上可检测的。
关于是否已发生感染的决策目前是基于患者自己对体液(诸如，透析液)的不透明性程度和视觉感知的混浊性的评估，该评估可理解是主观性的并且至少由于该原因，不足以监测腹膜炎。临床上，WBC和中性粒细胞计数用于评估腹膜炎的发生。另一方面，由于细胞计数平台在护理点(POC)处是不可访问的，当体液或透析液看起来混浊时，它可被认为是潜在感染的指示，并且预期患者会发起对他们的看护人的呼叫并随后立即访问医生的办公室或急诊室。参照表1，由患者执行的观察可能总体上是误导性的，造成不必要的急诊室访问，住院、和随后的医生办公室访问，这本可采用可靠的床边测试而加以避免。
表1：使用实施例与当前临床实践的比较结果
上述情况通过以下事实而加剧：(i)体液或透析液的混浊性(混浊度)可能由不一定指示腹膜炎的其他原因(例如，诸如马尼地平盐酸盐，二氢吡啶型钙通道阻断剂之类的药物)导致，以及(ii)缺乏合适的量化监测技术使HD/PD患者的健康状况的监测复杂化。总的来说，存在尚未解决的、未满足的用于快速且量化地监测透析液以确定感染的风险的临床需要。
为了解决该临床需要，本发明的实施例提供一次性(disposable)体液微芯片(例如，HD/PD微芯片)和用于操作这种微芯片的相应方法以能够快速量化透析液中的中性粒细胞，从而监测HD/PD患者的健康状况。在试点研究中，在达190天的时间周期上获得20个HD/PD患者的透析液中的中性粒微芯片计数(范围是从每微升16±2到微升842±29中性粒细胞)。HD/PD微芯片能用于成功地确定患者的状况。所提出的实施例广泛地可适用于在床边/护理点位置处快速量化分析体液，覆盖了要求连续或重复监测的广泛范围的疾病。在本说明书通篇中对“一个实施例”、“实施例”、“相关实施例”、或类似语言的引用意味着结合所援引的“实施例”描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施例中。因此，在本说明书通篇中的短语“在一个实施例中”或“在实施例中”的出现不一定全部指的是同一实施例。将可以理解，单独应用的和可能与附图结合的公开内容的部分不旨在提供对本发明的所有特征的完整描述。
此外，以下公开内容可参考对应的附图描述本发明的特征，其中只要有可能，相同的附图标记表示相同或相似的元件。在附图中，所描绘的结构要素一般不是按比例的，并且，出于强调和理解的目的，某些部件相对于其他部件放大。应理解的是，没有任何单个附图旨在支持对本发明的所有特征的完整描述。换句话说，给定附图一般性地描述本发明的仅一些特征，且一般不是所有特征。出于简化给定附图和讨论的目的，并且使讨论针对在该附图中突出的特定元件，给定附图及包含参照该附图的描述的本公开相关部分一般不包含特定视图的所有元件或可在该视图中呈现的所有特征。本领域技术人员将认识到，本发明可能在没有一个或多个特定特征、元件、部件、结构、细节或特性的情况下，或通过采用其他方法、部件、材料等实现。因此，虽然本发明的实施例的特定细节可能不一定在描述这个实施例的每个附图中示出，但可隐含了附图中该细节的存在，除非本说明书的上下文另有要求。在其他实例中，公知的结构、细节、材料、或操作可能没有在给定附图中示出或详细描述以避免混淆本发明被讨论的实施例的多个方面。而且，所描述的单独的特征、结构、或特性可按照任何合适的方式在一个或多个进一步的实施例中组合。
此外，如果包括示意流程图，则其一般被陈述为逻辑流程图。同样地，逻辑流程的所描述的顺序或标记的步骤所指示的是所呈现的方法的一个实施例。可构想到在功能、逻辑或效果上与所说明方法的一个或一个以上步骤或其部分等效的其它步骤和方法。此外，所采用的格式和符号被提供用于说明该方法的逻辑步骤，且应理解为不是限制该方法的范围。虽然可在流程图中采用多种箭头类型和直线类型，但应理解它们不是为了限制相应方法的范围。实际上，一些箭头或其它连接线可被用于仅指示该方法的逻辑流程。例如，箭头可指示所描绘方法的所列步骤之间的未指定时段的等待或监测周期。在不失一般性的情况下，处理步骤或特定方法所发生的顺序可以或可以不严格遵守所示的相应步骤的顺序。
如附加到本公开内容的权利要求所述的本发明旨在根据本公开的整体(包括在现有技术中公开，且被引用的特征)来进行评估。
如以上已经提到的，虽然在以下讨论的示例中仅参考PD，但这种参考仅作出为了保持描述简洁和简化，并且使用HD过程和HD流体样本或任何其它体液作为用于分析的样本旨在位于本发明的范围内。
参照图1，示意图A至E用于示出使用护理点实施例来监测PD患者的感染的原理。PD微芯片100使用来自患者流出物(effluent)的小体积废弃透析液(waste dialysate)114来高特异性和高效率地在芯片100的通道的表面上捕获CD66b+中性粒细胞。拍摄微芯片的图像118，并且采用自动化软件量化所捕获的中性粒细胞，120。如在124处所示，所确定的透析液中性粒细胞计数被任选地发送至存储(诸如，电子记录)，例如，该存储可然后由看护人评估以监测在PD治疗期间感染的风险。示意图B示出了将PD患者透析液样本注射到微芯片100的通道100a中以选择性地在通道表面处捕获中性粒细胞。示意图C提供功能化通道表面130的示意图，该功能化通道表面130带有来自透析液中的一片白血细胞的CD66抗体和所捕获的中性粒细胞。虽然在通道100a上选择性地捕获CD66+中性粒细胞，但其它细胞流动且离开通道而不被捕获，基本不减弱。示意图D示意性地示出了用于成像、检测、和量化在芯片100的通道100a中捕获的中性粒细胞的装置。装置140包括适合于照明芯片100和所捕获的细胞146的光源144，使得所捕获的细胞146的阴影148被投射到电荷耦合器件(CCD)传感器150的表面上。装置140被配置成使得CCD 150能够在不需要物镜的情况下并且通过使用加载到计算机系统上的自动化细胞识别和量化计算机程序产品来检测对应于所捕获的细胞146的阴影148的光强度分布。示意图E以俯视图呈现了PD微流体芯片100的实施例的图像。
在参照图2至8的本公开的以下部分中，更详细地讨论了用于获取和处理中性粒细胞的图像的系统和方法的非限制示例实施例。
图2和图3的示意图A示出了特定实施例100在CCD150顶部上的定位，其中在特定实施例100和CCD150之间没有光部件。图2的示意图B示出了采用CCD 150产生的实施例100的图像200。图2的示意图C提供了在通道100a的表面上捕获的细胞146的阴影图像210，该阴影图像210稍后由本发明的计算机程序产品的实施例标记以产生总细胞计数。图2的示意图D中显示了采用绿色标记的细胞246。在该过程之后，通过修改这些图像的对比度来标识出单独细胞的图像，在图2的示意图E的细胞256的图像中示出了单独细胞的图像的示例。在图2的示意图F和G中分别示出了说明与成像数据的处理和频域变换过程相关联的噪声降低以及通过使用3D带通滤波器进行数据滤波的示意图。
算法的实施例
为了补充本发明的算法(在本文中称为所述HVC方法)，本发明的计算机程序产品的实施例包括程序代码，该程序代码用于在图像恢复的初始阶段之后通过使用频域(FD)操作来处理由电子数据处理计算机电路(也被简称为处理器)接收的图像数据。在FD处理之后，使用空间域(SD)操作重新处理数据以基于两个输出的交叉点产生最终结果。计算机程序产品可包括程序代码，这些程序代码用于完成以下步骤：
i.自动和/或手动选择芯片上的多个通道
ii.图像恢复以改善图像对比度
iii.频域带通滤波
iv.使用匹配滤波的圆形对象检测
v.微调由(iii)和/或(iv)所发现的匹配，以及
vi.合并用户反馈以更新指定哪些对象应当被计数为细胞的阈值。
以下描述本发明的图像处理算法的实施例的上述步骤。
自动和/或手动选择芯片上的多个通道。可能要求单独地计数图1的芯片100的每个通道100a中的细胞。在这样做时，由于在通道的边界附近的细胞的图像的光学“拖尾效应”(该光学“拖尾效应”是每个CCD图像独特的成像缺点)，并非通道的边界内的所有区域都应被考虑。本发明的实施例通过为用户提供以下选项来解决该问题。
全自动模式。该模式被内置以用于批量处理在特定芯片上拍摄的图像。进一步参考图1和2，可在芯片100的每个角上刻有/压印若干预定的标识标记(例如，诸如在图2的示意图的图像中的正方形标记260)，以用于使用形态学数据处理算法(例如，诸如Matlab的图像处理工具箱中的命中-丢失变换(hit-miss transform))采取等同于标记的二进制掩模的结构元素(structural element)来定位和定向通道100a。对于携载这些标记的每个芯片，用户能够生成用于标识标记260(如所示的正方形)和通道100a内的应在其中执行计数的区域的‘模板’。图4显示了图像A和B，其中四个正方形260的内部采用品红星号予以标记。采用红色(410R)、绿色(410G)和蓝色(410B)突出应当执行细胞计数的(图像A的)三个通道100a内的区域。可以容忍芯片100在CCD 150下方的放置的小变化(例如，诸如芯片和CCD的表面之间的平行程度)。对于没有标识标记的芯片，只要芯片以与模板一致的方式放置在CCD下面，该选项就起作用。一旦计算机系统标识或识别芯片的通道的存在和位置/取向，形态学数据处理算法就自动地执行细胞计数而不等待进一步的用户输入。
半自动模式。在该模式中，并且参考图4的图像A，用户为每个芯片生成一个‘模板’，并且自动地对每个新图像中的通道进行染色(例如，如上所讨论的，采用红色、绿色、和蓝色阴影突出)。程序代码空闲并等待表示通道的边界的标识、微调和通道选择完成的用户输入。
全手动模式。在该模式中，计算机程序产品能够使处理器允许用户可调整大小且可移动地标记图像中的可小于通道的长度的任何区域(例如，无论是长方形还是正方形，诸如，图4的图像B的区域430)，然后仅在标记隔离区430中执行细胞计数。
图像恢复。如果所获取的图像具有低对比度，则执行归一化和/或标准化过程以确保细胞的图像在背景反衬下显得醒目。参照图5A的图像510，例如，一些所获取的图像包括彩色图像。可以理解，颜色信息并不将实际值添加至或修改细胞计数任务。在根据本发明的实施例的图像恢复过程的一个具体实现中的第一步骤是将图像510转换至灰度图像512。灰度图像512仍可由低对比度表征；在这种情况下，如514处所示，使图像直方图伸展开(例如，通过使用Matlab的adapthisteq功能)。在这之后，在516处，使用高频提升(high-boost)滤波，在保持低频分量的同时，增强了图像中的高频分量以形成高频提升的图像518。该图像是用于频域滤波的输入图像。
频域带通滤波。作为图像514的高频特性的提升的结果，高频提升滤波的图像518的2D傅立叶变换524可呈现图5B中所示的“光环”528。可看到光环528围绕着处于低频(在频域图像的中央处)的高能量区域。该光环的存在是由于细胞的存在和性质。将专门设计的带通滤波器530应用于图像518的傅立叶变换524的程序代码将转换524回复到空间域(未示出)并且通过移除对光环没有贡献的空间频率分量产生在视觉上强调空间图像中的细胞的效果。在图5C中以俯视和立体图示出了该定制滤波器的实施例的频率特性。
虽然频域带通滤波强调了细胞并使图像的其他不需要的元素减弱，但细胞不是“光环”的唯一贡献者，且残存一些量的噪声。噪声产生元素可包括，例如，来自样本的不是细胞的气泡、纤维和微细结构。代替尝试处理对图象噪声的每个贡献，本发明的HCC方法的实施例有利地利用如下事实：(i)感兴趣的细胞几乎始终是圆的并且具有基本相同的直径；(ii)采用相同的系统进行成像；(iii)芯片始终位于离CCD基本相同的距离处。如以下进一步讨论的，这使得能够使用感兴趣的细胞的形态学并标识某一直径的圆形对象。
使用匹配滤波检测圆形对象。在这个阶段，表示高频提升滤波的图像518的成像数据被再次用作输入。图像518首先被转换成二进制图像，然后与“盘(disk)”的模板进行卷积。图6示出了图5的图像518的二进制版本618，以及作为圆形细胞的二进制版本的模板620，计算机程序产品的实施例的程序代码然后将图像618与该模板620进行卷积。
微调匹配。图7A和7B显示了表示频域滤波和空间域滤波的输出的灰度图像710和黑白图像720。通过查找来自频域滤波的阈值处理的(thresholded)黑白图像720和来自匹配滤波输出的黑白图像的结果的交叉点来计算细胞的最终计数。在该二进制交叉点图像中，三个像素内的匹配记录被彼此重叠成一个。这是确保没有重复并且不高估细胞计数。
合并用户反馈以更新指定哪些对象应当被计数为细胞的阈值。最终结果取决于曾被指定的阈值的值。一旦完成细胞的计数，每个有效细胞在原始图像上被标记并且显示给用户以用于可视确认。在此刻，用户具有调节阈值的值的能力，并因此具有调节结果的能力。细胞的数量在图形窗口上被显示并被动态地更新。阈值越高，则越少数量的点被标识为细胞但这具有更高的实际上是细胞的可能性。阈值越低，则越多的点被标识为细胞但通常增加了假阳性的数量。
在图8的流程图中总结了以上描述的整体图像处理算法。
在本公开的以下部分中，参考图9并进一步参考图1，更详细地讨论了与所提出的芯片的微通道的结构相关的用于优化细胞捕获(诸如，例如，CD66b+细胞)的实施例。如图9的示意图A中所示的，通过白血细胞(CD66b+中性粒细胞)和血小板的多体(multibody)相互作用来表征CD66b+中性粒细胞向微芯片表面的流体动力学和迁移。在低剪切速率下，已在微血管中观察到越来越迟钝的速度剖面和增强的CD66b+中性粒细胞边集(margination)。为了本公开的目的，采用两个不同的高度(深度)h＝50和80μm产生具有长方形截面的微通道100a。由于体积流速在两种情况下被设置成等于Q＝2μl/min，对应的雷诺数Re＝ρuh/μ＝ρQ/μw在这两种情况下是相等的并且等于Re≌0.01。这里，ρ是流体的密度，Q是体积流速，μ是流体的速度，以及w是通道的宽度。可以观察到，微通道100a的雷诺数为低，并且与粘性力相比，惯性力很小，并由此流可被表征为Re<<1的蠕动流。由于低Re流的公知的时间可逆性，蠕动流本身不能解决用于使中性粒细胞迁移至微通道的周边的基本机制。时间可逆性促进浓CD66b+中性粒细胞边集至微芯片壁。CD66b+中性粒细胞的表面上的小曲率变化可理论上导致反对称，并由此通过跨越流线运送这些细胞。然而，这将预期缓慢地将CD66b+中性粒细胞带到微通道中央，而不是朝向壁。
为了设计图1的实施例100的微通道100a以从患者透析液样本有效捕获CD66b+中性粒细胞，在图9的示意图B至E中所示意性示出的本文的理论模型假设基于吸引力的细胞捕获过程包括两个概率性周期(probabilistic period)。
这些概率包括(1)如示意图B的曲线图所示的，所讨论的细胞在微通道100a的表面附近和细胞朝向平衡区域边集(如果存在)(可潜在地将在细胞群馈送到通道表面附近)的概率，以及(2)如图9的示意图C的曲线图所示的，在位于通道表面附近的细胞和受体之间的键形成的可能性。为了确定后者，可使用概率动力学公式。为了评估边集(即，CD66b+中性粒细胞朝向平衡区域迁移)的重要性，我们首先计算边集速度(在图9的示意图的曲线图所示)：
当边集和流的时间标度比＞＞1(t*～100)时，中性粒细胞的初始分布将是确定因素。此处，我们简单地假设细胞将在流上正态地分布为：
其中μ是平均位置以及σ2是细胞分布的方差。进一步参照图9的示意图B，细胞位于通道表面和阈值h0(最大距离)之间的薄区域中(在此区域可形成配体－受体结合)的概率为：
中性粒细胞粘附至微通道的底部表面。由F＝6πalμSFs和M＝6πa3μSTs给出可潜在地推移(dislodge)中性粒细胞的有效流体动力，其中l是到壁的分隔距离，μS是在壁处的剪切应力，Fs和Ts是形状依赖系数。微通道上的剪切应力τw,可被计算为：
τw＝6μQ/(wh2) (4)
此处，对于h＝80μm a剪切应力为0.0078Pa，对于h＝50μm剪切应力为0.02Pa。因此，进一步参考图9的示意图C，稳态粘附概率大约为：
其中，mr和ml分别是受体和配体密度；Ka 0是在配体－受体对的零负载情况下的缔合常数；Ac是接触面积；λ是配体－受体键的特征长度；kb是玻耳兹曼常数；Fdis是作用于每单位配体－受体对的推移力；γ是细胞长宽比；以及T是温度。
最后，且参照图9的示意图E，由表面捕获的中性粒细胞的组合概率被评估为Pt＝PsPa。随着中性粒细胞浓度增加，两种流速的总细胞计数的增加可容易地归因于这些细胞朝向微通道壁的增强扩散和碰撞动力学。对于相同的中性粒细胞浓度，微通道的厚度的减小导致更高的剪切速率和所捕获的细胞的总数量的增加。在相同域中包含更大数量的细胞，或在保持细胞数量恒定的同时减小域的尺寸导致增强的边集和中性粒细胞的捕获的增加。最后，更高的剪切速率导致对于所捕获的中性粒细胞的更大的分离力，以及用于使中性粒细胞自由流动的更长的曝光时间。如果过程通过前者的现象来控制或其效果被放大，则将导致中性粒细胞的(更快地)分离和更低的细胞计数。
微流体芯片的实施例的示例
再次参照图1，在一个实现中，(由乔治亚州，亚特兰大的McMaster Carr提供)通过使用聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)作为芯片的背面来制造实施例100，同时芯片的背面附连至约50μm至80μm厚的双面粘合膜(位于新泽西州的Scotch Plains的iTapstore)以提供通道的高度。两个部件都被切割成约24x 40mm。在PMMA中切割宽度相等的六个孔，其中三个孔在表示入口的一端处和三个孔在标识出口的相对端处。在DSA中切割多个通道，每个通道为4.3mm x 25mm长；在组装期间，这些通道与每组入口和出口孔对齐并固定到PMMA表面上。一旦等离子体处理过的玻璃载片居中并固定在DSA的其余侧上，微流体芯片就被形成并准备用于硅烷化。通道100a的长度被选择成约30mm，因为这个长度提供足够的CD66b相互作用以用于中性粒细胞固定化。约4mm的通道宽度提供用于约100μL PD样本的细胞捕获的足够量的表面积。在PX-250室(马萨诸塞州，Concord，March Instruments)中采用氧等离子体(在约100mW和1％氧气下)等离子体处理玻璃载片(马萨诸塞州，Lowell，Corning)达约1分钟并且玻璃载片被用作芯片100的盖以提供对通道100a的紧密密封。
微流体芯片的功能化的示例
用于通道功能化的材料。用于稀释和清洗通道的200标准强度的乙醇(EtOH)和用于GMBS储备液的溶剂二甲亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich化学公司(密苏里州，圣路易斯)。3-巯基丙基三甲氧基硅烷(3-MPS)，一种硅烷化剂，也购自Sigma-Aldrich化学公司(密苏里州，圣路易斯)。马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(N-y-maleimidobutyryloxysuccinimide ester)(GMBS)、一种偶联剂，购自皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology)(伊利诺斯州，罗克福德)。用于稀释水试剂和清洗的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液，购自Gibco(纽约州，Grand Island)。中性亲和素NeutrAvidin，用于生物素结合的功能性蛋白，购自飞世尔科技(Fisher Scientific)(新泽西州，Fair Lawn)。用于阻断非特异性结合/相互作用的来自牛血清(BSA)的冻干白蛋白购自Sigma-Aldrich化学公司(密苏里州，圣路易斯)。用于临床的PD样本中中性粒细胞的捕获的生物素化的抗人类癌胚抗原相关的细胞粘附分子8(CEACAM-8)抗体购自R&D Systems(明尼苏达州，Minneapolis)。
用于中性粒捕获和分析的材料。用于使PD样本通过微流体芯片的注射器泵购自SyringePump.com(纽约州，Farmingdale)。用于使PD流体注射通过微流体芯片的1毫升鲁尔锁(Luer Lock)注射器购自BD生物科学(新泽西州，富兰克林湖)。用将注射器连接到微流体芯片的0.01”内径尼龙管购自科尔－帕默(Cole-Parmer)(伊利诺州，Vernon Hills)。微流体芯片采用蔡司镜头清洁剂清洗，蔡司镜头清洁剂清洗购自卡尔蔡司光学公司(俄亥俄州，克利夫兰)。用于芯片的成像以量化中性粒细胞捕获的电荷耦合器件(CCD)购自Imperx公司(佛罗里达州，Boca Raton)，并与具有86.9kΩ电阻和2.3V电源的LED光源一起纳入“黑盒子”中。
溶液配制。一旦微流体芯片被组装，如表2和3所概括的，执行功能化微流体通道所需的过程。
首先，硅烷化溶液被吸取通过每个通道并培养30分钟。硅烷化溶液是200mM 3-MPS在EtOH中的稀释。GMBS溶液是2mM GMBS溶液在EtOH的稀释。NeutrAvidin溶液是PBS中的100μg/mL的NeutrAvidin溶液。1％BSA溶液是PBS中的1mg/mL的BSA溶液。抗体溶液是PBS中的200ng/mL的CEACAM-8抗体溶液(从储备液稀释1000倍)。
采用EtOH从通道冲洗任何未结合的3-MPS。接着，GMBS溶液被吸取通过每个通道并培养30分钟。采用EtOH从通道冲洗未反应的GMBS。然后采用PBS清洗通道以去除有机溶剂。NeutrAvidin溶液被吸取通过每个通道并(由于感光性)在黑暗中培养60分钟以固定到GMBS上。采用PBS从通道清洗未结合的NeutrAvidin。接着，1％BSA溶液被吸取通过每个通道并培养30分钟以用于表面钝化。采用PBS从通道清洗未结合的BSA。抗体溶液被吸取通过每个通道，被培养30分钟，再次被吸取通过每个通道，并培养30多分钟。
表2用于微流体芯片制造和初始功能化的操作过程的示例(所有步骤都在室温下进行)
PBS:磷酸盐缓冲盐水 EtOH:100％乙醇
表3用于应用微流体通道内的表面化学的操作过程的示例。
在微流体通道内捕获中性粒细胞的示例
参考表4，设置注射器和注射器泵。采用200μL临床PD样本填充每个注射器(每个样本三个注射器)。30号，鲁尔锁(Luer Lock)，钝针被附连至注射器；尼龙管被固定到每个针的尖端。然后将注射器装载到注射器泵中。泵运行直到所有柱塞在相同水平并且流体流入尼龙管。然后，每件尼龙管的自由端被环氧树脂粘合到微流体芯片中的每个相应的入口端。200μL吸液管尖端置于每个出口端以用于收集耗尽的(depleted)样本。注射器泵运行直到100μL穿过每个微流体通道。然后从微流体芯片入口移除管和吸液管尖端，使用蔡司镜头清洁剂清洗清洗微流控芯片的表面。最后，如上所讨论的，将微流体芯片置于CCD图像传感器上，并且将图像保存在计算机上以用于量化。
表4用于采用功能化的表面化学测试临床腹膜透析液(PD)样本的操作过程的示例。
在混浊PD透析液样本的分析中的微流体芯片的实施例的稳健性能的示范
即使当从PD患者样本获得的样本包含附加的微粒(诸如，纤维或RBC)时，所提出的PD微流体芯片的实施例仍具有提供精确结果的能力。具体而言，参照图10，微芯片的一个实现包括基于免疫分析的芯片，其中任何结合的中性粒细胞保留在表面上，而其他微粒通过洗涤缓冲液去除。
还解决了流体样本的不透明性的程度对于光学成像的质量的影响。可以确定，当在采用洗涤缓冲液冲洗之后，具有高微粒浓度的PD流体对CCD图像没有影响。然而，如果在样本被冲洗之前对PD芯片成像，则CCD图像中的噪声将是显著的。如图11A和11B所示，例如，具有高不透明性程度(混浊度)的PD样本被注射到PD芯片的实施例100中并且在此之后立即被成像以产生图11A的图像。在PBS冲洗步骤之后附加地对相同的样本成像以产生图11B的图像。混浊度增加是纤维在PD透析液中累积的结果。图11A和11B的图像之间的比较显示了当增加洗涤缓冲液时出现的噪声降低。尽管流体的高混浊度，CCD 150仍能够提供在表面上的全部捕获的清晰图像。
FACS结果还受到PD流体中的各种微粒的影响。死细胞常常导致FACS图像中的噪声，从而使得难以选中(gate)目标细胞(诸如，中性粒细胞)。随着整个微粒数量的增加，确定细胞浓度值的所需的时间也增加。图12A和12B提供了表征包括淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的典型样本的FACS标绘图。采用FITC-CD66b染色的中性粒细胞被选中并且在相应的FSC与SSC区域中显示。图12C和12D提供表示表征从患者获得的混浊PD样本的结果的FACS标绘图。死细胞以及附加的微粒导致FSC与SSC中的噪声水平增加，由此使细胞的选中(gating)复杂化(例如，如从图12的选中的R2区域的左侧标绘区域可以看出的)。在这种噪声水平下，变得难以确定具体细胞计数和难以精确确定细胞浓度。图12E和12F显示了表征从使用艾考糊精作为他的透析液糖(与传统的葡萄糖透析液相反)的患者获得的样本的FACS标绘图。艾考糊精(Icodextrin)，作为高摩尔质量糖，在流式细胞仪上被识别为事件。作为结果，需要超过100X事件来获得该注意的(considerable)WBC浓度。
图13显示了示出本发明的实施例的可操作性的验证的标绘图A至F。图13A是显示根据本发明的实施例对PD样本中的中性粒细胞进行自动计数和手动细胞计数的统计比较的结果的标绘图。观察到手动和软件细胞计数之间的高相关性(r＝0.96,p<0.01)。图13B是显示通道尺寸和流速对中性粒细胞捕获效率的影响并展示与以上讨论的80μm通道相比采用50μm通道获得的更高的捕获效率的标绘图。而且，与80μm高通道设计(r＝0.74,p<0.01)相比，50μm高设计提供与流式细胞仪中性粒细胞计数的更高的相关性(r＝0.90,p<0.01)。图13C是表示对PD患者样本进行的中性粒细胞计数的标绘图。观察到样本中性粒细胞浓度和PD芯片细胞计数之间的显著相关性(r＝0.90,p<0.01)。图13D是表示因变于表2中描述的样本中的中性粒浓度的PD芯片的实施例的捕获效率的依赖性的标绘图。采用PD患者样本的微芯片计数显示与FACS计数统计学显著相关(r＝0.83，P<0.05)。临床样本的测量(在图13E和13F中示出其结果)指示流式细胞仪结果(黄金标准)和用于在0到300细胞/μl范围内的中性粒细胞计数的微芯片之间的显著相关性(皮尔逊相关：0.90,p<0.01)。这种范围覆盖临床相关检测范围。
根据实施例的示例，提供了用于感染的早期检测和PD卫生依从性的记录的微流体系统和方法。在本公开中讨论的用于改善腹膜透析液治疗的管理的家庭保健门户(portal)适合于帮助临床医生在护理点处监测患者的医疗保健。发明人没有察觉到现存用于在患者的床边处监测PD流体的任何POC快速技术。所设想的实施例利用废弃的PD流体并实现流体中的WBC和中性粒细胞的计数。基于PD的这种测量，系统提供指示器(例如，诸如彩色指示器、红色或绿色LED)，响应于该指示器，发起临床医生和患者之间的沟通，此举导致有关潜在感染的临床决策，从而减少或消除治疗的延时。所记录的数据将被发送至患者、看护人可访问的电子记录。仍通过医生和护士与患者互动来作出诊断决策。所提出的实施例取代不可靠的基于混浊性或混浊度的测量方法以有益于患者避免急性病例，时间延时，并提供比血液透析更为患者友好的PD表征方法。
虽然列举了选择用于这些实施例的具体值，但可以理解，在本发明的范围内，所有参数的值可在广泛范围上变化以适合不同的应用。
可通过使用专门和特别编程成执行所需算法的步骤的处理器来完成以上所描述的本发明的方法的实现和/或本发明的系统的操作的实现。这种处理器可通过存储在有形、计算机可读存储器中的指令控制。本领域技术人员应当容易理解，定义本发明的功能的指令或程序可被以许多形式传递至处理器，包括，但不限于，永久存储在非可写存储介质上的信息、可改变地存储在可写存储介质上的信息、或通过包括有线或无线计算机网络的通信介质传达至计算机的信息。此外，虽然本发明可以软件实现，但实现本发明所需的功能可任选地或替代地使用合适的固件和/或硬件部件(诸如，例如，组合逻辑、专用集成电路、和现场可编程门阵列)部分或整体地实现。
虽然通过上述示例性实施例描述了本发明，但本领域技术人员将理解，可在不背离所公开的发明概念的情况下，作出对所示实施例的修改和变型。因此，本发明应不当被视为限于所公开的实施例。

Claims (10)

1.一种用于对流体腹膜透析液样本中的目标细胞进行计数的系统，所述系统包括：
具有微流体通道的网络的元件，
光学检测器，所述光学检测器毗邻所述元件定位以接收通过所述元件的光，以及
非瞬态计算机可读介质，所述非瞬态计算机可读介质具有设置在其中的计算机可读程序代码，所述计算机可读程序代码用于对流体腹膜透析液样本中的目标细胞进行计数，并且包括一系列的计算机可读程序步骤，所述步骤用于实现：
在已经穿过至少一个通道的光中，获取表示形成于所述光学检测器表面上的、来自所述微流体通道的网络的所述至少一个通道的初始图形的数据；
将所获取的数据转换成表示所述至少一个通道的灰度级图像的数据；
通过在频域和空间域过滤由此转换的数据来对这些数据进行数据处理，以及
当所述微流体通道网络的所述至少一个通道包含具有所标识的生物细胞的流体腹膜透析液样本时，相关于所述至少一个通道的参数和预定义的阈值来标识和计数目标细胞，其中所述计数是通过查找在所述频域中过滤所产生的输出与在所述空间域中过滤所产生的输出的交叉点来进行的，以定义计数值；
将所述计数值提交至与所述计算机可读介质通信的服务器；
接收来自所述服务器的用户的表示对预定阈值的改变的输入并且基于所述输入显示彩色图像，所述彩色图像包含相关于被改变的阈值标识经计数标识的细胞的标记。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，在所述元件和所述光学检测器之间没有光学部件。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，进一步包括与所述非瞬态计算机可读介质可操作地通信的显示器，其中所述计算机可读程序代码进一步包括一系列的计算机可读程序步骤以实现在所述显示器上呈现所述初始图像，所述初始图像包含表示所述经计数的被标识细胞的视觉可感知的标记。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述转换包括处理所获取的表示所述初始图像的数据以改变空间频率的对应频谱，从而在保持所述对应频谱的低频分量的幅度的同时增加所述对应频谱的高频分量的幅度。
5.一种计算机可读介质，所述计算机可读介质包括设置在其中的用于计数包含在微流体系统的通道中的流体腹膜透析液样本中的目标细胞的计算机可读程序代码，所述微流体系统包括：
具有一个或多个微流体通道的微流体芯片；
毗邻所述微流体芯片的光学检测器；以及
光源，所述光源适合于将光穿过所述微流体芯片传输至光学检测器上，以便在没有在光学检测器处形成所述样本的光学共轭的光学部件的情况下，在光学检测器处形成表示流体腹膜透析液样本的辐照度分布；
所述计算机可读程序代码包括一系列的计算机可读程序步骤以实现：
在已经穿过至少一个通道的光中，获取表示形成于所述光学检测器表面上的、来自所述微流体通道的网络的所述至少一个通道的初始图形的数据；
将所获取的数据转换成表示所述至少一个通道的灰度级图像的数据；
通过在频域和空间域过滤由此转换的数据来对这些数据进行数据处理，以及
当所述微流体通道网络的所述至少一个通道包含具有所标识的生物细胞的流体腹膜透析液样本时，相关于所述至少一个通道的参数和预定义的阈值来标识和计数目标细胞，其中所述计数是通过查找在所述频域中过滤所产生的输出与在所述空间域中过滤所产生的输出的交叉点来进行的，以定义计数值；
将所述计数值提交至与所述计算机可读介质通信的服务器；
接收来自所述服务器的用户的表示对预定阈值的改变的输入并且基于所述输入显示彩色图像，所述彩色图像包含相关于被改变的阈值标识经计数标识的细胞的标记。
6.一种用于计数包含在流体腹膜透析液样本中的细胞的方法，所述方法包括：
在已经穿过来自微流体通道的网络的至少一个通道的光中，获取表示形成于光学检测器表面上的、所述至少一个通道的初始图形的数据；
将所获取的数据转换成表示所述至少一个通道的灰度级图像的数据；
通过在频域和空间域过滤由此转换的数据来对这些数据进行数据处理，以及
当所述微流体通道网络的所述至少一个通道包含具有所标识的生物细胞的流体腹膜透析液样本时，相关于所述至少一个通道的参数和预定义的阈值来标识和计数目标细胞，其中所述计数是通过查找在所述频域中过滤所产生的输出与在所述空间域中过滤所产生的输出的交叉点来进行的，以定义计数值；
将所述计数值提交至服务器；
接收来自所述服务器的用户的表示对预定阈值的改变的输入并且基于所述输入显示彩色图像，所述彩色图像包含相关于被改变的阈值标识经计数标识的细胞的标记。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，接收数据包括在不使用被配置为在所述光学检测器处形成所述目标细胞的光学共轭的光学部件的情况下接收表示目标细胞的图像的数据。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括确定目标细胞稳态粘附至所述至少一个通道的表面的概率。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括当所述计数值超过基于用户输入可调节的阈值时生成视觉可感知的触发指示器。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目标细胞包括中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞中的一个或多个。
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