CN104937096B - 包含柠檬酸的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本文描述促进骨生长的方法。在一些实施方案中，本文所述的促进骨生长的方法包括通过向骨细胞群体提供柠檬酸递呈组合物来促进所述骨细胞群体中的细胞分化或表型进展。在一些实施方案中，在所选细胞发育的第一阶段向骨细胞提供柠檬酸递呈组合物以获得第一细胞分化或表型进展。另外，在一些情况下，在所选细胞发育的第二阶段向骨细胞进一步提供第二柠檬酸递呈组合物以获得第二细胞分化或表型进展。

Description

包含柠檬酸的组合物及其应用
相关申请的交叉引用
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2013年1月4日提交的美国临时专利申请序列号61/748,906的优先权，所述临时专利申请据此以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及柠檬酸递呈组合物，并且具体来说，涉及用于骨应用的柠檬酸递呈组合物。
背景技术
天然骨基质是一种包含约60至65重量％的包埋在胶原蛋白基质内的无机材料的复合物。此外，磷灰石纳米晶体薄层包埋在胶原蛋白网状结构内。因此，一些工程化生物材料已组合各种无机材料与合成聚合物以用于骨组织工程应用中。然而，一些现存生物材料未能匹配天然骨组成，提供足够机械支撑，使炎症性反应减至最小限度，快速促进骨再生和/或与周围组织完全整合。
因此，存在对用于各种矫形和骨应用的提供改进的性质的组合物和方法的需要，所述改进的性质包括改进的机械性质和/或改进的骨生长性质。
发明内容
在一个方面，本文描述在一些情况下，相较于用于骨应用的其它组合物，可提供一种或多种优势的组合物。举例来说，在一些实施方案中，本文所述的组合物可提供改进的机械性质、降低的炎症性反应、改进的可生物降解性和与周围组织的优越整合。此外，在一些情况下，本文所述的组合物可以改进的方式促进骨生长，包括通过促进骨细胞群体(如包含干细胞或成骨细胞的群体)中的细胞分化或表型进展。此外，在一些情况下，本文所述的组合物也可抑制包括骨癌的癌的生长。
在一些实施方案中，本文所述的组合物是柠檬酸递呈组合物。举例来说，在一些情况下，本文所述的柠檬酸递呈组合物包含含有柠檬酸部分的聚合物或寡聚物。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含具有下文所述的式(I)结构的第一聚合物或寡聚物和具有下文所述的式(II)结构的第二聚合物或寡聚物，其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或寡聚物掺合。此外，在一些情况下，第一聚合物或寡聚物和第二聚合物或寡聚物彼此交联以形成聚合物网状结构。另外，在一些情况下，组合物进一步包含分散在聚合物网状结构中的颗粒材料。颗粒材料可为羟磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙、生物玻璃、陶瓷、镁粉、镁合金和脱细胞骨组织粒子中的一个或多个。
此外，在一些实施方案中，本文所述的组合物进一步包含粘着于聚合物网状结构的骨组织。在一些情况下，骨组织围绕聚合物网状结构，并且聚合物网状结构整合至骨组织中。
在另一方面，本文描述促进骨生长的方法，其在一些情况下可提供一种或多种超过其它方法的优势。在一些情况下，举例来说，本文所述的方法促进骨细胞群体中的细胞分化或表型进展，所述方法包括向所述骨细胞提供柠檬酸递呈组合物。在一些实施方案中，在所选细胞发育的第一阶段向骨细胞提供柠檬酸递呈组合物以获得第一细胞分化或表型进展。另外，在一些情况下，在所选细胞发育的第二阶段向骨细胞进一步提供第二柠檬酸递呈组合物以获得第二细胞分化或表型进展。根据本文所述的方法处理的骨细胞可在体外或在体内。在一些情况下，骨细胞包括骨干细胞。此外，在一些实施方案中，本文所述的促进骨生长的方法包括将柠檬酸递呈组合物安置在生物环境中。此外，在一些实施方案中，促进骨生长包括上调生物环境中的osterix(OSX)基因表达和/或碱性磷酸酶(ALP)基因表达。在一些情况下，促进骨生长包括改进生物环境中的骨传导性和/或骨诱导性。在一些实施方案中，促进骨生长包括促进生物环境中的矿物化或钙沈积物形成。此外，在一些情况下，本文所述的方法也有效用于至少部分抑制包括骨癌细胞的癌细胞的生长和/或增殖。此外，在一些实施方案中，一种或多种前述作用由柠檬酸递呈组合物以剂量依赖性方式提供。
根据本文所述的方法向骨细胞提供和/或安置在生物环境中的柠檬酸递呈组合物可包括上文所述的任何组合物。举例来说，在一些实施方案中，柠檬酸递呈组合物包含含有柠檬酸部分的聚合物或寡聚物，如具有式(I)或式(II)结构的聚合物或寡聚物。也可使用其它聚合物或寡聚物。此外，在一些所述实施方案中，本文所述的方法进一步包括通过降解聚合物或寡聚物来自聚合物或寡聚物释放柠檬酸盐。在其它情况下，柠檬酸递呈组合物包含柠檬酸、或柠檬酸盐水溶液。在一些实施方案中，柠檬酸递呈组合物构成补充有柠檬酸或柠檬酸盐的培养基。此外，在一些情况下，以组合物的体积计，用于本文所述的方法中的柠檬酸递呈组合物提供在约20μM与约2000μM之间的柠檬酸盐浓度。另外，在一些情况下，本文所述的方法进一步包括向骨细胞提供如BMP-2的生物因子。
在另一方面，本文描述包含柠檬酸递呈组合物的物品。在一些实施方案中，物品包含上文所述的柠檬酸递呈组合物，如由具有式(I)结构的聚合物或寡聚物和/或具有式(II)结构的聚合物或寡聚物形成的交联聚合物网状结构。此外，在一些情况下，本文所述的物品形成生物或手术植入物，如矫形固定装置，如骨螺钉。
这些和其它实施方案在随后详述中更详细地加以描述。
附图说明
图1说明用于形成根据本文所述的一个实施方案的复合网状结构的流程。
图2说明根据本文所述的一些实施方案的一系列组合物的一系列差示扫描量热法(DSC)热分析图。
图3A说明根据本文所述的一些实施方案的一系列组合物的压缩模量。
图3B说明根据本文所述的一些实施方案的一系列组合物的压缩峰值强度。
图4说明根据本文所述的一些实施方案的一系列组合物的体外降解速率。
图5说明根据本文所述的方法的一些实施方案的一系列复合物的矿物化的扫描电子显微术(SEM)图像。
图6A说明根据本文所述的方法的一些实施方案的钙结节形成的光学显微镜图像。
图6B说明根据本文所述的方法的一些实施方案的钙结节形成数据。
图6C说明根据本文所述的方法的一些实施方案的钙结节形成数据。
图7说明根据本文所述的方法的一些实施方案的碱性磷酸酶(ALP)表达。
图8A说明根据本文所述的方法的一些实施方案的ALP表达。
图8B说明根据本文所述的方法的一些实施方案的ALP表达。
图9说明根据本文所述的方法的一些实施方案的骨桥蛋白(OPN)表达。
图10说明根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法的结果的光学显微镜图像。
图11A说明根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法的结果的SEM图像。
图11B说明根据本文所述的方法的一些实施方案的ALP表达。
图11C说明根据本文所述的方法的一些实施方案的osterix(OSX)表达。
图12A说明根据本文所述的一个实施方案的促进骨生长的方法的结果的微型CT图像。
图12B说明根据本文所述的一个实施方案的促进骨生长的方法的结果的微型CT图像。
图13说明根据本文所述的一个实施方案的促进骨生长的方法的结果的两个微型CT图像。
图14说明对应于本文所述的方法的一个实施方案的细胞增殖数据。
图15说明对应于本文所述的方法的一个实施方案的细胞增殖数据。
图16说明对应于本文所述的方法的一个实施方案的细胞增殖数据。
具体实施方式
通过参照以下详述、实施例和图，本文所述的实施方案可更易于理解。然而，本文所述的要素、装置和方法不限于详述、实施例和图中呈现的特定实施方案。应认识到这些实施方案仅说明本发明的原理。在不脱离本发明的精神和范围下，众多修改和改适将易于为本领域技术人员显而易知。
此外，本文公开的所有范围都应理解成涵盖其中包括的任何和所有子范围。举例来说，陈述的范围“1.0至10.0”应视为包括以最小值1.0或大于1.0开始，并且以最大值10.0或小于10.0结束的任何和所有子范围，例如1.0至5.3、或4.7至10.0、或3.6至7.9。
除非另外明确陈述，否则本文公开的所有范围也都应视为包括范围的端点。举例来说，“在5与10之间”的范围通常应视为包括端点5和10。
此外，当短语“多达”与量或数量关联使用时，应了解所述量至少是可检测量或数量。举例来说，以“多达”指定量的量存在的物质可自可检测量并且多达且包括所述指定量存在。
包含柠檬酸的组合物
在一个方面，本文描述包含柠檬酸或递呈柠檬酸的组合物。在一些实施方案中，组合物包含含有柠檬酸部分的聚合物或寡聚物。“柠檬酸部分”在本文中出于参照目的包括具有式(III)结构的部分：
其中R1、R2和R3独立地是-H、-CH3、-CH2CH3、M+或与聚合物或寡聚物的其余部分的连接点；
R4是-H或与聚合物或寡聚物的其余部分的连接点；并且
M+是阳离子，如Na+或K+，前提是R1、R2、R3和R4中的至少一个是与聚合物或寡聚物的其余部分的连接点。
可使用不与本发明的目标不一致的任何聚合物或寡聚物。举例来说，在一些情况下，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物包含(i)柠檬酸、柠檬酸盐或柠檬酸酯(如柠檬酸三乙酯)与(ii)多元醇(如二醇)的反应产物。适用于本文所述的一些实施方案中的多元醇的非限制性实例包括C2-C20α,ω-正烷二醇或C2-C20α,ω-烯二醇。在其它情况下，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物包含(i)柠檬酸、柠檬酸盐或柠檬酸酯与(ii)多元醇，和(iii)胺、酰胺或异氰酸酯的反应产物。在一些情况下，胺包括一种或多种具有2至10个碳原子的伯胺。在其它情况下，胺包括一种或多种具有2至15个碳原子的仲胺或叔胺。在一些实施方案中，异氰酸酯包括单异氰酸酯。在其它情况下，异氰酸酯包括二异氰酸酯，如二异氰酸烷酯。此外，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物也可包含(i)柠檬酸、柠檬酸盐或柠檬酸酯与(ii)多元醇，和(iii)多元羧酸(如二羧酸)或多元羧酸的功能性等效物，如多元羧酸的环酐或酸氯化物的反应产物。此外，多元羧酸或其功能性等效物可为饱和或不饱和的。举例来说，在一些情况下，多元羧酸或其功能性等效物包括顺丁烯二酸、顺丁烯二酸酐、反丁烯二酸或反丁烯二酰氯。在其它实施方案中，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物包含(i)柠檬酸、柠檬酸盐或柠檬酸酯与(ii)多元醇，和(iii)氨基酸，如α-氨基酸的反应产物。在一些实施方案中，α-氨基酸包括L-氨基酸、D-氨基酸或D,L-氨基酸。在一些情况下，α-氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸或其组合。此外，在一些情况下，α-氨基酸包括烷基取代的α-氨基酸，如由22种“标准”或生蛋白氨基酸中的任一个获得的甲基取代的氨基酸，如甲基丝氨酸。另外，在一些情况下，氨基酸形成本文所述的组合物的聚合物或寡聚物的侧挂基或侧基。此外，在一些情况下，本文所述的单体的反应产物是单体的缩合反应产物。在一些情况下，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物是美国专利8,530,611；美国专利8,574,311；或美国专利8,613,944中所述的聚合物或寡聚物。
此外，在一些实施方案中，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物由一个或多个式(A)单体和一个或多个式(B)或(B′)单体形成：
其中R1、R2和R3独立地是-H、-CH3、-CH2CH3或M+；
R4是-H；
R5是-H、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-CH3或-CH2CH3；
R6是-H、-CH3或-CH2CH3；
M+是阳离子，如Na+或K+；并且
n和m独立地是在1至20的范围内的整数。
在一些情况下，举例来说，R1、R2和R3是-H，R5是-OH，并且R6是-H。
在一些实施方案中，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物由一个或多个式(A)单体、一个或多个式(B)或(B′)单体、和一个或多个式(C)单体形成：
其中R1、R2和R3独立地是-H、-CH3、-CH2CH3或M+；
R4是-H；
R5是-H、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-CH3或-CH2CH3；
R6是-H、-CH3或-CH2CH3；
M+是阳离子，如Na+或K+；
n和m独立地是在1至20的范围内的整数；并且
p是在1至10的范围内的整数。
举例来说，在一些情况下，R1、R2和R3是-H或-CH2CH3，R5是-OH，R6是-H，n是2至6，m是2至8，并且p是2至6。
此外，在本文所述的聚合物或寡聚物的一些实施方案中，式(B)或(B′)单体可被不具有式(B)或(B′)的醇替换。举例来说，在一些实施方案中，可使用不饱和醇或不饱和多元醇。此外，在一些实施方案中，式(C)单体或寡聚物可至少部分地被本文所述的氨基酸替换。
另外，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物可在所述聚合物或寡聚物的骨架中具有至少一个酯键。在一些情况下，聚合物或寡聚物在所述聚合物或寡聚物的骨架中具有多个酯键，如至少三个酯键、至少四个酯键或至少五个酯键。在一些实施方案中，本文所述的聚合物或寡聚物在所述聚合物或寡聚物的骨架中具有两个与五十个之间的酯键。
本文所述的聚合物或寡聚物可以不与本发明的目标不一致的任何量存在于组合物中。在一些实施方案中，举例来说，本文所述的组合物包含多达约99重量％、多达约95重量％、多达约90重量％、多达约80重量％、多达约70重量％、多达约50重量％、多达约40重量％、或多达约30重量％聚合物或寡聚物。在一些情况下，本文所述的组合物包含约20与约99重量％之间、约30与约95重量％之间、约30与约90重量％之间、约40与约90重量％之间、约40与约80重量％之间、约50与约95重量％之间、约50与约90重量％之间、约50与约80重量％之间、约50与约70重量％之间、约60与约99重量％之间、或约60与约80重量％之间。
此外，在一些情况下，本文所述的组合物可包含两种或更多种聚合物或寡聚物的混合物、掺合物或组合。在一些情况下，两种或更多种聚合物或寡聚物是本文所述的含柠檬酸聚合物或寡聚物。在其它情况下，混合物、掺合物或组合的至少一种聚合物或寡聚物不包含柠檬酸部分。举例来说，在一些情况下，本文所述的组合物包含本文所述的含柠檬酸聚合物或寡聚物与生物可降解聚合物(如聚酯)的混合物、掺合物或组合。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含本文所述的含柠檬酸聚合物或寡聚物与聚(乳酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚碳酸酯、多糖(如纤维素)或其组合的混合物、掺合物或组合。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含具有式(I)结构的第一聚合物或寡聚物：
(I)，
其中
R1是-H、或
代表具有式(I)结构的重复单元的另一链；并且
m、n、p和q独立地是在2至20的范围内的整数；以及
具有式(II)结构的第二聚合物或寡聚物：
(II)，
其中
R2是-H或
代表具有式(II)结构的重复单元的另一链；并且
m、n和p独立地是在2至20的范围内的整数，并且
其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或寡聚物掺合。
本文所述的混合物、掺合物或组合的聚合物或寡聚物可以不与本发明的目标不一致的任何量存在于所述混合物、掺合物或组合中。在一些情况下，聚合物或寡聚物的混合物、掺合物或组合的第一聚合物或寡聚物与所述混合物、掺合物或组合的第二聚合物或寡聚物的重量比在约99:1与约1:99之间。在一些情况下，第一聚合物或寡聚物与第二聚合物或寡聚物的重量比在约10:1与约1:10之间、在约5:1与约1:5之间、在约3:1与约1:3之间、或在约2:1与约1:2之间。在不意图受理论束缚下，据信包含本文所述的聚合物或寡聚物的混合物的组合物在一些实施方案中可用于形成包含量高于另外可能的量的颗粒材料的复合物。再次在不意图受理论束缚下，进一步据信包含本文所述的聚合物或寡聚物的混合物的组合物可提供由个别聚合物或寡聚物提供的性质的所需组合。举例来说，式(I)聚合物或寡聚物可比式(II)聚合物或寡聚物提供更大机械强度，但较少羟基或羧基用于与如羟磷灰石的颗粒材料相互作用。因此，在一些情况下，基于一种或多种官能团或部分的所需量和/或组合物的所需机械强度来选择包括在本文所述的组合物中的不同聚合物或寡聚物的比率。举例来说，在一些情况下，包含相较于式(I)聚合物或寡聚物的量，相对大量的式(II)聚合物或寡聚物的组合物可比包含相对少量的式(II)聚合物或寡聚物的组合物具有更高量的羧基。
此外，在一些实施方案中，本文所述的聚合物或寡聚物的混合物、掺合物或组合的聚合物或寡聚物可彼此交联以形成聚合物网状结构。第一聚合物或寡聚物与第二聚合物或寡聚物交联可以不与本发明的目标不一致的任何方式达成。举例来说，在一些情况下，交联是包括借助于缩合反应，通过聚合物或寡聚物之间的分子间共价键，如酯键或酰胺键来达成。在其它情况下，交联可通过聚合物或寡聚物中的不饱和部分(如顺丁烯二酸部分的烯键式不饱和部分)的偶联来达成。
此外，在一些实施方案中，包含聚合物网状结构的组合物可进一步包含分散在所述聚合物网状结构中的颗粒材料。可使用不与本发明的目标不一致的任何颗粒材料。在一些情况下，颗粒材料包括羟磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙、生物玻璃、陶瓷、镁粉、镁合金和脱细胞骨组织粒子中的一个或多个。也可使用其它颗粒材料。
此外，本文所述的颗粒材料可具有不与本发明的目标不一致的任何粒子尺寸和/或粒子形状。在一些实施方案中，举例来说，颗粒材料在至少一个维度上具有的平均粒子尺寸小于约1000μm、小于约800μm、小于约500μm、小于约300μm、小于约100μm、小于约50μm、小于约30μm或小于约10μm。在一些情况下，颗粒材料在至少一个维度上具有的平均粒子尺寸小于约1μm、小于约500nm、小于约300nm、小于约100nm、小于约50nm或小于约30nm。在一些情况下，颗粒材料在两个维度或三个维度上具有本文所述的平均粒子尺寸。此外，颗粒材料可由大致上球形粒子、板样粒子、针样粒子或其组合形成。也可使用具有其它形状的颗粒材料。
颗粒材料可以不与本发明的目标不一致的任何量存在于本文所述的组合物中。举例来说，在一些情况下，以组合物的总重量计，组合物包含多达约70重量％、多达约60重量％、多达约50重量％、多达约40重量％、或多达约30重量％颗粒材料。在一些情况下，以组合物的总重量计，组合物包含约1与约70重量％之间、约10与约70重量％之间、约15与约60重量％之间、约25与约65重量％之间、约25与约50重量％之间、约30与约70重量％之间、约30与约50重量％之间、约40与约70重量％之间、或约50与约70重量％之间。举例来说，在一些情况下，包含本文所述的聚合物网状结构的组合物包含多达约65重量％羟磷灰石。在不意图受理论束缚下，据信在本文所述的聚合物网状结构中并入多达约65重量％羟磷灰石可在生物环境中或在体外增强由所述聚合物网状结构提供的骨传导性和/或骨整合。
此外，本文所述的颗粒材料可以不与本发明的目标不一致的任何方式分散在聚合物网状结构中。在一些实施方案中，举例来说，颗粒材料被混合或研磨至聚合物网状结构中。此外，在一些情况下，本文所述的颗粒材料可由聚合物网状结构的一个或多个侧挂官能团螯合或另外结合。举例来说，在一些情况下，组合物包含分散在本文所述的聚合物网状结构中的羟磷灰石粒子，其中所述羟磷灰石由所述聚合物网状结构的一个或多个侧挂官能团螯合。在一些实施方案中，聚合物网状结构的一个或多个羧基部分或一个或多个柠檬酸部分螯合羟磷灰石的一个或多个含钙部分。在不意图受理论束缚下，据信所述螯合可允许相较于一些其它聚合物基质，在本文所述的聚合物网状结构内并入更大量的羟磷灰石(或另一无机材料)。
在一些实施方案中，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物或交联聚合物网状结构可展现一种或多种可合乎生物医学或组织工程应用需要的性质。举例来说，在一些情况下，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物或交联聚合物网状结构是生物可降解的。“生物可降解”聚合物或寡聚物或交联聚合物网状结构在本文中出于参照目的在体内降解成可由普通生物过程自身体清除的无毒组分。在一些实施方案中，本文所述的生物可降解聚合物或寡聚物或交联聚合物网状结构在体内历经约4周或小于4周的过程完全或大致上完全降解。此外，在一些实施方案中，本文所述的聚合物或寡聚物或交联聚合物网状结构是生物可相容的或细胞可相容的。“生物可相容或细胞可相容”聚合物或寡聚物或交联聚合物网状结构在本文中出于参照目的是无毒的，并且不导致实质性组织炎症，其中炎症可通过纤维囊形成量来度量。
此外，在一些实施方案中，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物或交联聚合物网状结构展现高机械强度。在一些情况下，举例来说，当如下文在实施例2中所述进行测量时，本文所述的组合物的聚合物或寡聚物或交联聚合物网状结构展现下表I中所述的一种或多种性质。
表I.机械性质。
此外，在一些实施方案中，本文所述的组合物可进一步包含骨组织。可使用不与本发明的目标不一致的任何骨组织。在一些实施方案中，举例来说，骨组织包括密质骨组织。在其它情况下，骨组织包括松质骨组织。此外，在一些实施方案中，骨组织粘着于组合物的聚合物网状结构，包括本文所述的聚合物网状结构。另外，在一些情况下，骨组织围绕聚合物网状结构，并且聚合物网状结构整合至骨组织中。在一些情况下，所述组合物可展现较高的骨与植入物接触(BIC)，其中“骨”是指骨组织，并且“植入物”是指聚合物网状结构。在一些实施方案中，当如本文所述进行测量时，本文所述的组合物展现至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的骨与植入物接触。在一些实施方案中，当如本文所述进行测量时，本文所述的组合物展现在约70与约99％之间、在约75与约95％之间、在约80与约95％之间、或在约80与约90％之间的骨与植入物接触。此外，在一些情况下，本文所述的组合物在体内六周之后不展现纤维组织囊封或大致上不展现纤维组织囊封。“大致上无纤维组织囊封”在本文中出于参照目的是指小于约5重量％或小于约1重量％的组合物囊封纤维组织。
应了解本文所述的组合物可具有不与本发明的目标不一致的本文所述的性质或特征的任何组合。举例来说，本文所述的任何聚合物或寡聚物可与任何量或类型的本文所述的颗粒材料组合使用。在一些实施方案中，举例来说，组合物可包含具有式(I)和/或式(II)结构的聚合物或寡聚物，其中一种或多种聚合物或寡聚物交联以形成聚合物网状结构，并且包括羟磷灰石的颗粒材料分散在所述聚合物网状结构内。其它组合也是可能的。
II.促进骨生长的方法
在另一方面，本文描述促进骨生长的方法。在一些实施方案中，促进骨生长的方法包括向骨细胞群体提供柠檬酸递呈组合物。此外，在一些情况下，促进骨生长包括促进骨细胞群体中的细胞分化和/或表型进展。举例来说，在一些情况下，向骨细胞群体提供柠檬酸递呈组合物促进所述骨细胞群体中的成骨细胞表型进展。此外，在一些所述实施方案中，在所选细胞发育的第一阶段向骨细胞提供柠檬酸递呈组合物以获得第一细胞分化或表型进展。另外，在一些情况下，可在所选细胞发育的第二阶段向骨细胞进一步提供第二柠檬酸递呈组合物以获得第二细胞分化或表型进展。在其它实施方案中，本文所述的促进骨生长的方法包括将柠檬酸递呈组合物安置在生物环境中。“生物环境”在本文中出于参照目的包括活生物体内的环境，如骨部位或创伤或损伤部位。在一些情况下，促进骨生长包括上调生物环境中的osterix基因表达和/或碱性磷酸酶基因表达。另外，在一些实施方案中，本文所述的促进骨生长的方法进一步包括自柠檬酸递呈组合物释放游离柠檬酸或柠檬酸盐。
现在转向方法的步骤，本文所述的促进骨生长的方法包括向骨细胞群体提供柠檬酸递呈组合物和/或将柠檬酸递呈组合物安置在生物环境中。“柠檬酸递呈组合物”在本文中出于参照目的是包括柠檬酸、柠檬酸盐、柠檬酸酯(如柠檬酸三乙酯)或包含具有式(IV)结构的部分的化学物质的组合物：
其中R1、R2和R3独立地是-H、-CH3、-CH2CH3、M+或与化学物质的其余部分的连接点；
R4是-H或与化学物质的其余部分的连接点；并且
M+是阳离子，如Na+或K+。在一些实施方案中，化学物质是聚合物或寡聚物。因此，本文所述的“柠檬酸递呈组合物”的“柠檬酸”可指柠檬酸的小分子或“单体”形式，如柠檬酸、柠檬酸盐或柠檬酸酯，如上文所述。
不与本发明的目标不一致的任何柠檬酸递呈组合物都可用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，举例来说，柠檬酸递呈组合物包括柠檬酸和/或柠檬酸盐(如柠檬酸钠或柠檬酸钾)的水溶液。在其它情况下，柠檬酸递呈组合物包含上文在章节I中所述的聚合物或寡聚物或上文在章节I中所述的聚合物或寡聚物的混合物、掺合物或组合。举例来说，在一些实施方案中，柠檬酸递呈组合物包含含有柠檬酸部分的聚合物或寡聚物，如具有式(I)或式(II)结构的聚合物或寡聚物。本文所述的方法的柠檬酸递呈组合物也可包含具有式(I)结构的聚合物或寡聚物和具有式(II)结构的聚合物或寡聚物的混合物、掺合物或组合。也可使用其它聚合物或寡聚物，如上文所述。
此外，可以不与本发明的目标不一致的任何方式向骨细胞群体提供本文所述的柠檬酸递呈组合物。举例来说，在一些情况下，在体外以包括补充有柠檬酸盐的培养基的水性混合物或溶液形式向骨细胞提供柠檬酸递呈组合物。可使用不与本发明的目标不一致的任何培养基。在一些实施方案中，举例来说，培养基包括α最低必需培养基(αMEM)、依格氏最低必需培养基(Eagle’sminimal essential medium，EMEM)、杜贝卡氏改良依格氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)、胎牛血清(FBS)或一种或多种前述培养基的混合物。此外，在其中柠檬酸递呈组合物构成补充有柠檬酸盐的培养基的一些情况下，培养基不含或大致上不含除由本文所述的柠檬酸递呈组合物提供的柠檬酸盐以外的其它骨生长因子。在一些实施方案中，培养基不含或大致上不含锌。“大致上不含”其它骨生长因子或其它组分的培养基在本文中出于参照目的包含小于约10μM或小于约1μM其它骨生长因子。或者，在其它情况下，具有本文所述的柠檬酸递呈组合物的培养基进一步包含一种或多种骨生长因子。举例来说，在一些情况下，培养基是成骨培养基。在其它情况下，在体内以水性混合物或溶液形式或以固体植入物或装置(如骨螺钉或骨板)形式向骨细胞提供柠檬酸递呈组合物。此外，应了解在一些实施方案中，根据本文所述的方法向骨细胞提供的柠檬酸递呈组合物对于骨细胞而言可为外源性的。
此外，在本文所述的一些方法中，可在一个或多个表型进展或细胞分化阶段向骨细胞提供一种或多种柠檬酸递呈组合物。本文所述的柠檬酸递呈组合物可在不与本发明的目标不一致的任何阶段或阶段的组合向骨细胞提供。在一些情况下，举例来说，在矿物化阶段或之前，包括在骨细胞已至少部分分化之后，向骨细胞提供柠檬酸递呈组合物。也可在一个或多个其它表型进展或分化阶段向骨细胞提供柠檬酸递呈组合物。此外，可在一个或多个阶段提供相同或不同的本文所述的柠檬酸递呈组合物。
在一些实施方案中，本文所述的促进骨生长的方法进一步包括自柠檬酸递呈组合物释放游离柠檬酸或柠檬酸盐。“游离”柠檬酸或柠檬酸盐在本文中出于参照目的包括不共价结合于另一物质(如本文所述的聚合物或寡聚物)的柠檬酸或柠檬酸盐。可以不与本发明的目标不一致的任何方式使柠檬酸或柠檬酸盐自本文所述的柠檬酸递呈组合物释放。另外，柠檬酸或柠檬酸盐可释放至任何所需环境中。举例来说，在一些情况下，可通过降解安置在生物环境中的含柠檬酸聚合物或寡聚物来使柠檬酸或柠檬酸盐释放至生物环境中。此外，可以不与本发明的目标不一致的任何方式使聚合物或寡聚物降解。在一些实施方案中，降解聚合物或寡聚物包括水解聚合物或寡聚物的酯键，如聚合物或寡聚物的骨架中的酯键。在其它情况下，自柠檬酸递呈组合物释放柠檬酸或柠檬酸盐不需要水解、裂解化学键或对组合物的其它降解。举例来说，在包括使用柠檬酸或柠檬酸盐水溶液的一些实施方案中，可仅通过向环境提供柠檬酸递呈组合物来使游离柠檬酸或柠檬酸盐释放至所需环境中。
此外，在一些情况下，本文所述的方法的柠檬酸递呈组合物可提供所需量的柠檬酸盐。在一些实施方案中，举例来说，以组合物的体积计，本文所述的柠檬酸递呈组合物提供在约20μM与约2000μM之间的柠檬酸盐浓度。惊人地，已发现提供在约20μM与约2000μM之间的柠檬酸盐量可以本文所述的方式促进骨生长，同时也使可能不需要的其它作用得以避免或减至最小限度，如下文进一步所述。也可提供其它柠檬酸盐量或浓度。举例来说，在一些情况下，本文所述的柠檬酸递呈组合物提供在约20μM与约200μM之间、在约20μM与约150μM之间、在约100μM与约2000μM之间、在约100μM与约1500μM之间、在约200μM与约2000μM之间、在约200μM与约1500μM之间、在约300μM与约1800μM之间、在约500μM与约2000μM之间、在约500μM与约1500μM之间、在约800μM与约2000μM之间、在约800μM与约1400μM之间、在约1000μM与约2000μM之间、或在约1000μM与约1500μM之间的柠檬酸盐浓度。在一些实施方案中，本文所述的柠檬酸递呈组合物提供大于约800μM或大于约2000μM的柠檬酸盐浓度。
此外，在一些实施方案中，本文所述的方法提供基于提供的柠檬酸盐的量以剂量依赖性方式达成的生物作用。举例来说，在一些情况下，本文所述的方法包括向骨细胞群体提供柠檬酸递呈组合物来以剂量依赖性方式上调细胞中的ALP和/或OSX基因表达，其中提供的柠檬酸盐的量在约20μM与约2000μM之间。
此外，可向不与本发明的目标不一致的任何骨细胞群体提供本文所述的柠檬酸递呈组合物。举例来说，在一些情况下，骨细胞包括成骨细胞。在其它情况下，骨细胞包括骨髓细胞，如骨髓基质细胞。在一些实施方案中，骨细胞包括干细胞。在一些情况下，干细胞可为成体干细胞。在一些情况下，骨细胞群体包含多能、寡能或单能干细胞。在一些实施方案中，干细胞包括间质干细胞，如C2C12细胞或人间质干细胞(hMSC)。此外，骨细胞可在体外，在体内，是内源性或外源性的。
在一些实施方案中，本文所述的促进骨生长的方法进一步包括向骨细胞群体提供生物因子。“生物因子”在本文中出于参照目的包括在特定生物化学路径或身体过程中起作用的物质，如生长因子。可使用不与本发明的目标不一致的任何生物因子。举例来说，在一些实施方案中，生物因子包括骨形态发生蛋白(BMP)。在一些情况下，BMP包括BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6和BMP-7中的一个或多个。也可使用其它生物因子。
在一些实施方案中，本文所述的促进骨生长的方法包括上调osterix(OSX)基因表达和/或碱性磷酸酶(ALP)基因表达。在一些情况下，上调OSX基因表达包括相较于单纯玻璃对照，在培养48小时之后，使基因表达增加多达约300％。在一些情况下，OSX基因表达量增加多达约200％、多达约100％、多达约50％或多达约40％。在一些实施方案中，相较于单纯玻璃对照，在培养48小时之后，OSX基因表达量增加在约30％与约300％之间、在约35％与约250％之间、在约35％与约200％之间、或在约200％与约300％之间。
在一些情况下，相较于单纯玻璃对照，在培养48小时之后，ALP基因表达量增加的量多达约400％。在一些情况下，ALP基因表达量增加多达约360％、多达约250％、多达约150％、多达约100％、多达约50％或多达约40％。在一些实施方案中，相较于单纯玻璃对照，在培养48小时之后，ALP基因表达量增加在约30％与约400％之间、在约35％与约360％之间、在约35％与约300％之间、在约35％与约250％之间、在约300％与约400％之间、或在约300％与约360％之间。
另外，在一些实施方案中，本文所述的方法包括提供至少部分抑制癌细胞(如骨肉瘤细胞或其它骨癌细胞)的生长和/或增殖的柠檬酸递呈组合物。在一些实施方案中，癌细胞的生长和/或增殖被完全抑制或遏止，如当通过方法杀死癌细胞时。在其它情况下，相较于不包括向细胞群体提供柠檬酸递呈组合物的对照方法，癌细胞的生长和/或增殖被抑制多达约90％、多达约80％、多达约70％、多达约50％、多达约30％或多达约20％。此外，在一些实施方案中，本文所述的柠檬酸递呈组合物的作用是剂量依赖性的。此外，在一些情况下，抑制癌细胞的生长和/或增殖包括在大于约800μM的浓度，如在约800μM与约20,000μM之间的量或在约800μM与约2000μM之间的量下向细胞提供柠檬酸盐。
此外，在一些实施方案中，本文所述的方法包括提供杀死如骨癌细胞的癌细胞的柠檬酸递呈组合物。在一些情况下，所有癌细胞都被杀死。在其它情况下，相较于不包括向细胞群体提供柠檬酸递呈组合物的对照方法，至少约90％、至少约80％、至少约70％或至少约50％的癌细胞被杀死。另外，在一些实施方案中，本文所述的柠檬酸递呈组合物的抗癌作用是剂量依赖性的。此外，在一些情况下，杀死癌细胞包括在大于约2000μM的浓度，如大于约2000μM并且多达约20,000μM的浓度下向细胞提供柠檬酸盐。
应了解本文所述的促进骨生长的方法可包括不与本发明的目标不一致的任何步骤组合或使用不与本发明的目标不一致的本文所述的组合物的任何组合。在一些实施方案中，举例来说，本文所述的促进骨生长的方法可包括使用上文在章节I中所述的柠檬酸递呈组合物以出于促进细胞分化和/或表型进展的目的或出于上调osterix基因表达和/或碱性磷酸酶基因表达的目的向骨细胞群体或向上文所述的生物环境提供上文所述的柠檬酸盐浓度。
III.包含柠檬酸递呈组合物的物品
在另一方面，本文描述包含柠檬酸递呈组合物的物品。在一些实施方案中，物品包含上文在章节I中所述的柠檬酸递呈组合物或由其形成，所述组合物如由具有式(I)结构的聚合物或寡聚物和/或具有式(II)结构的聚合物或寡聚物形成的交联聚合物网状结构。在一些实施方案中，本文所述的物品包含上文在章节I中所述的包含分散在聚合物网状结构中的颗粒材料的交联聚合物网状结构或由其形成。举例来说，在一些情况下，本文所述的物品包含具有式(I)结构的第一聚合物或寡聚物与具有式(II)结构的聚合物或寡聚物交联以形成的聚合物网状结构或由其形成，所述聚合物网状结构进一步包含分散在整个所述聚合物网状结构中的多达约70重量％羟磷灰石。
在一些实施方案中，本文所述的物品是生物或手术植入物，如矫形固定装置，如骨螺钉或骨板。因此，在一些情况下，本文所述的物品可用于通过提供机械支撑来促进骨折或其它创伤或损伤的愈合或修补。此外，在一些实施方案中，本文所述的物品也可促进如骨折的创伤或损伤的部位处的骨生长。以这个方式，本文所述的物品可用于提供对骨折、骨生长病症和/或骨退化病状的改进治疗。本文所述的物品也可在如骨的生物区室中抑制癌生长或杀死癌细胞。
本文所述的物品可具有不与本发明的目标不一致的任何尺寸和形状。在一些实施方案中，本文所述的物品具有圆柱形、球形或多面形。在其它情况下，本文所述的物品具有适用作矫形固定装置的形状，如螺钉形或板形。
此外，本文所述的物品可展现一种或多种合乎需要的性质，如一种或多种合乎需要的生物医学或机械性质。在一些情况下，举例来说，本文所述的物品展现或促进上文在章节I或章节II中所述的生物作用，如基因表达作用或骨诱导性作用增加。在其它情况下，本文所述的物品展现上文在章节I中所述的压缩模量。
此外，本文所述的物品可以不与本发明的目标不一致的任何方式制备。举例来说，在一些情况下，本文所述的物品是使用挤压方法、拉挤成型方法或模制方法，包括但不限于注射模制方法，由本文所述的组合物制得。
本文所述的一些实施方案进一步说明于以下非限制性实施例中。除非另外指示，否则下述所有实验都一式两份进行并重复三次(n＝6)，并且统计结果是基于由三次实验组成的各组。当适当时，数据被表示为平均值±一个标准偏差。使用双尾学生t检验(Student’s t-test)计算两组数据之间的统计显著性。当获得P值<0.05时，差异被视为是显著的。
实施例1
POC和CUPE聚合物或寡聚物
如下制备根据本文所述的一些实施方案的柠檬酸递呈聚合物或寡聚物。第一聚合物或寡聚物鉴定为聚(辛二醇柠檬酸酯)(POC)，并且第二聚合物或寡聚物鉴定为交联氨基甲酸酯惨杂的聚酯(CUPE)。
为合成POC，添加等摩尔量的1,8-辛二醇(98％，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和柠檬酸(99.5％，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)至100mL圆底烧瓶中，并且暴露于恒定氮气流。使混合物在剧烈搅拌下在160-165℃下熔融。一旦组分熔融，即使混合物在140℃下反应1小时以产生未纯化的POC聚合物或寡聚物。接着，逐滴添加未纯化的聚合物或寡聚物至去离子水中，收集并冻干过夜以获得纯化的POC聚合物或寡聚物。
为合成CUPE，首先通过使柠檬酸和1,8-辛二醇以分别1:1.1摩尔比反应，并且如上所述进一步处理反应产物来合成POC聚合物或寡聚物。接着，通过以下方式来达成POC聚合物或寡聚物的链延伸：将纯化的POC聚合物或寡聚物溶解于1,4-二噁烷中以形成3重量％POC溶液，随后与二异氰酸1,6-六甲酯(HDI)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)以POC与HDI摩尔比1:1.5在55℃下在恒定搅拌下反应。当傅里叶变换红外(FT-IR)分析显示在2267cm-1处的异氰酸酯峰消失时，终止反应。
实施例2
CBPB掺合物和CBPBHA复合物
如下制备根据本文所述的一些实施方案的聚合物网状结构和包含分散在网状结构内的颗粒材料的聚合物网状结构。聚合物网状结构包括第一聚合物或寡聚物和第二聚合物或寡聚物的各种掺合物，并且指定为基于柠檬酸的聚合物掺合物(CBPB)。包含颗粒材料的聚合物网状结构指定为基于柠檬酸的聚合物掺合物/羟磷灰石(CBPBHA)复合物。以三步制造CBPBHA复合物。首先，最初通过将POC聚合物或寡聚物溶解于1,4-二噁烷或四氢呋喃(THF)中，并且混合POC溶液与各种重量比的CUPE聚合物或寡聚物于1,4-二噁烷或THF中的溶液以形成均质基于柠檬酸的聚合物或寡聚物掺合物来制备CUPE和POC的混合物，指定为CBPB-X，其中X定义为CBPB掺合物中的CUPE的重量比。其次，以组合物的总重量计，使各CBPB与65重量％羟磷灰石(HA，[MW：502.32；测定：>90％(以Ca3(PO4)2计)；粒子尺寸：>75μm(0.5％)，45-75μm(1.4％)，<45μm(98.1％)]，Fluka,St.Louis,MO,USA)混合，并且在预升温至50℃的特氟隆盘中搅拌以有助于溶剂蒸发。在溶剂蒸发之后，将粘土样混合物插入机制圆柱形金属模中，并且压制成杆状样本。最后，使所得圆柱形复合物在80℃下进行后聚合5天，随后在120℃下在2Pa真空下加热1天以形成交联CBPBHA-X复合物，其中X再次定义为CBPB中的CUPE的重量比。结果显示于表II中。包括除HA以外的颗粒材料的复合物也可以相同方式制备。这个过程示意性说明于图1中。如图1中所描绘，CUPE聚合物或寡聚物骨架表示为基本上垂直安置，并且POC聚合物或寡聚物骨架表示为基本上水平安置。然而，这个描绘仅出于说明目的。如本领域普通技术人员所了解，CUPE和POC骨架的定向可为随机的。此外，如图1中所描绘，复合物网状结构中的较大圆圈代表HA粒子，较小圆圈代表酯或氨基甲酸酯键联，并且虚线指示侧挂羧基。
表II. CBPB聚合物掺合物和CBPBHA复合物
使用差示扫描量热法(DSC)表征CBPB掺合物和CBPBHA复合物。具体来说，使用DSCQ2000差示扫描量热计(TA Instruments,New Castle,DE,USA)进行测量以表征CBPB聚合物掺合物(CBPB-100、CBPB-90、CBPB-50和CBPB-0)的热性质和均质性。最初在每分钟10℃的加热速率下在氮气下自室温至150℃来扫描样本，随后在每分钟-40℃的速率下冷却直至达成-75℃的温度。接着再次在每分钟10℃的加热速率下自-75℃至150℃来扫描样本。由自第二次加热操作记录的热容量阶跃变化的中间来确定玻璃态转变温度(Tg)。为测定CBPB掺合物中两种聚合物或寡聚物的可混溶性，由等式(2)(Fox等式)表示掺合物的玻璃态转变温度：
1/Tg＝W1/Tg,1+W2/Tg,2 (2)，
其中Wi是组分i的重量分数，并且温度是以开尔文计。结果显示于图2中。图2说明各种CBPB掺合物的DSC热分析图。值被报道为平均值±一个标准偏差，其中n＝6。CBPB掺合物展现单一玻璃态转变温度，其在相同聚合条件(5天，80℃)下随CUPE含量增加而增加。基于个别组分CBPB-100和CBPB-0的Tg值，CBPB-90和CBPB-50的Tg值被分别计算为0.41℃和-9.13℃。
使用电机通用测试机Q Test-150(MTS,Eden Prairie,MN,USA)对CBPBHA复合物进行无侧限压缩测试。简而言之，在每分钟2mm的速率下将6mm×9mm(直径×高度)圆柱形试样压缩直至破裂。通过测量应力-应变曲线的在10％压缩下的斜率来计算初始模量。结果显示于表III以及图3A和3B中。图3A说明CBPBHA复合物的压缩模量。图3B说明CBPBHA复合物的压缩峰值强度。x轴值代表CBPB掺合物中的CUPE百分比。
表III.机械性质。
通过重量随时间的损失来评估CBPBHA复合物的盘样本(6mm直径×2mm厚)的体外降解速率。在37℃下在静态条件下将样本安置在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中多达24周。每周更换PBS以确保pH不下降至低于7。在称重之前，用去电离(DI)水充分冲洗样本并冻干。通过比较初始重量(W0)与在1、2、4、8、12和24周测量的重量(Wt)来计算重量损失，如等式(1)中所示：
重量损失＝(W0-Wt)/W0x100％ (1)。
结果以平均值±一个标准偏差(n＝6)形式显示于图4中。
使用由以下(mmol)组成的4×改进模拟体液(SBF)溶液评估CBPBHA复合物的体外矿物化：Na+(142.0)、K+(5.0)、Mg2+(1.5)、Ca2+(2.5)、Cl-(103)、HCO3 -(10.0)、HPO4 2-(1.0)和SO4 2-(0.5)，其中使用1.0MNaOH调整pH至7.0以加速结果。简而言之，在37℃下使复合物盘(6mm直径×2mm高度)浸渍在10mL SBF中多达15天。每隔一天更新SBF以维持矿物化期间的离子浓度和pH。在孵育各种时期之后，用DI水仔细洗涤试样以移除任何可溶性无机离子，并且在空气中干燥。接着用银涂布样本，并且在扫描电子显微镜(SEM)(Hitachi,Pleasanton,CA,USA)下观察。通过能量分散x射线(EDX)分析来分析化学计量Ca/P摩尔比，并且测定为1.39±0.25。如图5中所说明，所有CBPBHA复合物都诱导快速矿物化。图5中标记为A-1、A-2和A-3的图像分别对应于在0、3和15天时的CBPBHA-0。类似标记流程用于图5中的其它复合物。
实施例3
促进骨生长的方法
如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在6孔板中，在2×105个细胞/孔(第0天)的密度下，在生长培养基中培养源于6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓基质细胞(BMSC)，所述生长培养基含有补充有10％(V/V)胎牛血清(FBS)、0.25μg/mL两性霉素B以及1％(V/V)青霉素和链霉素的α最低必需培养基(αMEM)。在第3天，将生长培养基更换成由以下组成的成骨培养基：补充有10％胎牛血清、10-7M地塞米松、50μg/mL抗坏血酸(Sigma)、5mMβ-甘油磷酸酯(Sigma)、0.25μg/mL两性霉素B、1％青霉素和链霉素、以及各种浓度的柠檬酸(0μM、2μM、20μM、200μM、1mM和5mM)的αMEM。在成骨诱导12天之后，BMSC培养物用Von Kossa染色进行染色，并且通过光学显微术来成像。以倒置显微镜对每孔的钙结节的数目计数。也计算钙结节的总面积。结果显示于图6A-6C中。图6A说明Von Kossa染色的显微镜图像。图6B说明观察到的钙结节的数目。图6C说明钙结节的总面积。发现所有补充有柠檬酸盐的培养基都以剂量依赖性方式促进钙结节形成。20μM的柠檬酸盐浓度诱导最高数目的具有较大尺寸的钙结节(图6A中黑色)，而对照培养基不促进可见钙结节形成。
实施例4
促进骨生长的方法
如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在补充有10％FBS以及1％青霉素和链霉素的EMEM(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中培养MG-63细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)。在50％汇合时将MG-63细胞接种在6孔板中，并且用含有不同浓度的柠檬酸(0μM、10μM、20μM、50μM、100μM和200μM)的EMEM培养。在4天时，溶解细胞，并且使用ALP底物试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测定碱性磷酸酶(ALP)的存在。相对于样本中存在的如通过picogreen测定(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)测定的总DNA量使ALP水平标准化。结果显示于图7中。
在其它实验中，如上所述培养和接种MG-63细胞或MSC细胞，其中培养基含有0μM、20μM、100μM、200μM、1000μM或2000μM柠檬酸。在各种时间点，如第3天、第7天、第10天、第14天和第21天，测定细胞的ALP的存在。结果显示于图8A和8B中。
实施例5
促进骨生长的方法
如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在补充有10％FBS以及1％青霉素和链霉素的杜贝卡氏改良依格氏培养基(DMEM)中培养人间质干细胞(hMSC)(Lonza Walkersville Inc.,USA)。对于分化，将hMSC转换至成骨培养基(OGM)中，所述成骨培养基包括进一步补充有10-7Mβ-甘油磷酸酯和50μM抗坏血酸-2-磷酸酯的先前基于DMEM的培养基。在80-90％汇合之后，将hMSC细胞在104个细胞/毫升的密度下接种于96孔板中。在调整pH至7.4之后，添加以柠檬酸形式计算的体积的柠檬酸盐至生长培养基中以获得生长培养基中最终柠檬酸盐浓度20μM、200μM或2000μM。在37℃下在5％CO2下用补充有柠檬酸盐的培养基孵育hMSC。每隔一天更换培养基。在预定时间点(添加柠檬酸盐后7天和14天)时，遵循制造商方案(Bio-rad Laboratory,USA)，通过蛋白质印迹测定来测定并比较骨桥蛋白(OPN)水平。结果显示于图9中。如图9中所说明，柠檬酸盐和OPN表达以剂量依赖性关系密切相关。
实施例6
促进骨生长的方法
如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在补充有10％FBS以及1％青霉素和链霉素的杜贝卡氏改良依格氏培养基(DMEM)中培养人间质干细胞(hMSC)(Lonza Walkersville Inc.,USA)。对于分化，将hMSC转换至成骨培养基(OGM)中，所述成骨培养基包括进一步补充有10-7M地塞米松、10-2Mβ-甘油磷酸酯和50μM抗坏血酸-2-磷酸酯的先前基于DMEM的培养基。在80-90％汇合之后，将hMSC细胞在104个细胞/毫升的密度下接种于96孔板中。在调整pH至7.4之后，添加以柠檬酸形式计算的体积的柠檬酸盐至生长培养基中以获得生长培养基中最终柠檬酸盐浓度20μM。在37℃下在5％CO2下用补充有柠檬酸盐的培养基孵育hMSC。每隔一天更换培养基。在预定时间点(添加柠檬酸盐后7天、14天和21天)时，通过Von Kossa染色来染色培养物，接着通过光学显微镜来检查以检测钙沈积物的形成。结果显示于图10中。如图10中所说明，补充外源性柠檬酸盐能够促进在分化hMSC培养物中形成钙沈积物。
实施例7
促进骨生长的方法
如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在95％空气和5％CO2下，在24孔板中在高葡萄糖杜贝卡氏改良依格氏培养基(GIBCO,Grand Island,NY,USA)中于CBPB-100、CBPBHA-100、CBPBHA-90和对照玻璃上培养C2C12细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)，所述培养基补充有10％胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100μg/mL链霉素。使用RNeasy小型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA)纯化来自C2C12细胞的总RNA。使用TaqManOne-Step RT-PCR MasterMix试剂(Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)，使RNA经受定量实时RT-PCR。通过ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)来分析相对转录物水平。相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)水平使转录物水平标准化。所有实验都一式两份进行，并且重复三次。通过用BMP-2(R&D,Minneapolis,MN,USA)处理来诱导成骨细胞自C2C12细胞分化。在达到60-80％汇合之后，细胞用300ng/mLBMP-2处理0、6、12、36和48小时。如先前所述分析Osterix(OSX)和碱性磷酸酶(ALP)基因表达水平。使用扫描电子显微术观察C2C12细胞的形态。结果显示于图11A-C中。
在24小时之后，细胞于探究的所有CBPBHA复合物上都形成单层(图11A)。此外，相较于单纯玻璃对照，在培养48小时之后，CBPB-100上的ALP和OSX基因表达水平分别增加35％和37％。在将HA并入CBPB掺合物中的情况下，ALP和OSX基因表达水平进一步增加。相较于单纯玻璃对照，在培养48小时之后，用CBPBHA-90复合物涂布的板上的ALP和OSX基因表达分别增加362％和191％，并且用CBPBHA-100涂布的板上的表达水平分别增加336％和290％。当相较于CBPB-100涂布的板时，在48小时之后，CBPBHA-90复合物上的ALP和OSX表达分别增加243％和113％，而CBPBHA-100复合物上的ALP和OSX表达分别增加224％和185％(图11B和11C)。
实施例8
促进骨生长的方法
如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。12只称重在2.3与2.7kg之间的新西兰白兔用于评估CBPBHA-100和CBPBHA-90复合物的生物相容性和骨整合性质。将圆柱形样本植入兔膝的侧向股骨髁中。在植入6周之后，微型CT图像显示植入物和周围新骨组织完全融合，如图12A和12B中所见。图12A对应于CBPBHA-100，而图12B对应于CBPBHA-90。另外，观察到新形成的骨在最初不存在骨的骨髓腔中与植入物接触。此外，在植入物周围不存在慢性炎症(纤维囊形成)或退行性变化的迹象。根据总体组织学检查，植入物看起来与周围骨良好整合。未检测到植入物松弛，如对周围骨组织的甲苯胺染色和vonKossa染色中所示。骨与植入物接触(BIC)结果指示骨接触植入物(骨整合)高达94.74％，如图13中所见。图13说明在植入后6周时，CBPBHA-90植入物与侧向股骨髁的周围骨的2-D微型CT图像。此外，在未脱钙骨的界面处未观察到骨再吸收。此外，在植入物和周围组织的界面处未发现阳性染色的巨噬细胞。
所有动物实验都依照由南方医科大学的动物护理和使用委员会(Guangzhou,CHINA)核准的方案进行。将动物随机分成2组，并且通过氯胺酮(40mg/kg IM)和甲苯噻嗪(5-7mg/kg IM)，补充以异氟烷(1-2％吸入)来进行麻醉。接着，在侧膝上产生1.5cm内侧切口以暴露侧向股骨髁。使用镶嵌式成形术收集器(Smith&Nephew,Memphis,TN,USA)，在CBPBHA-100组和CBPBHA-90组的右侧侧向股骨髁与左侧侧向股骨髁两者中分别钻凿4×3mm(直径×深度)骨缺损。根据分组通过按压配合来插入由CBPBHA-100和CBPBHA-90复合物形成，并且匹配缺损的尺寸的植入物。在所有手术程序之后，将兔保持在笼中，并且用定期实验室饮食供养。在植入后6周时收集膝，并且储存在10％中性缓冲福尔马林中。用数字照相机记录总体检查。使用微型CT成像系统(ZKKS-MCT-Sharp-III扫描器，Caskaisheng,CHINA)进行计算机断层摄影术分析。将扫描系统设置成70kV、30W和429μA。目标体积规定为植入物周围的骨组织，其包括自植入物的纵轴开始延伸8mm的整个小梁区室。植入物骨整合的程度通常由它的骨与植入物接触(BIC)测量结果反映。基于微型CT图像，BIC被计算为历经总植入物周界所新形成的骨长度的百分比。
对于组织学分析，将石蜡包埋的脱钙组织切割成4μm切片，其接着被脱石蜡，水化，并且用苏木精-曙红(H&E)染色。对于免疫组织化学染色，通过一系列等级的醇将石蜡包埋的切片脱石蜡并水化。内源性过氧化物酶活性用含0.3％过氧化氢的PBS阻断。接着用牛血清白蛋白(1:100稀释度)阻断切片，并且在4℃下与CD68和CD163的初级抗体(Auragene,Changsha,China，1:50稀释度)一起孵育过夜。切片用PBS洗涤三次，并且与二级抗小鼠IgG一起在37℃下孵育1小时。在DAB溶液中显色，并且用苏木精复染。由两名个别病理学家以盲法以及随机化方式根据H&E染色的切片和IHC染色来评估植入物周围的炎症性反应。在割腱术后1周，自大鼠的跟腱的愈合中组织收集阳性对照组的来源，所述愈合中组织的特征已在于起炎症性反应。针对CD163和CD68进行IHC染色以检测巨噬细胞。在核被苏木精染色的细胞中，巨噬细胞看起来是棕色的。
实施例9
抑制癌生长的方法
如下执行根据本文所述的一些实施方案的抑制癌生长的方法。首先，探究柠檬酸盐对细胞增殖的影响。在由补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的杜贝卡氏改良依格氏培养基(DMEM)组成的生长培养基中培养人间质干细胞(hMSC)(Lonza Walkersville Inc.,USA)，接着在80-90％汇合之后在104个细胞/毫升的密度下接种于96孔板中。在调整pH至7.4之后，添加以柠檬酸形式计算的体积的柠檬酸盐至生长培养基中以获得生长培养基中最终柠檬酸盐浓度20μM、200μM、400μM、800μM、1000μM、2000μM、10,000μM或20,000μM。在37℃下在5％CO2下用补充有柠檬酸盐的培养基孵育hMSC。每隔一天更换培养基。在预定时间点(添加柠檬酸盐后1天、4天和7天)时，遵循制造商方案(Sigma,USA)，通过MTT(溴化甲基噻唑基二苯基-四唑鎓)测定来测定hMSC的增殖。在37℃下于MTT工作溶液中孵育4小时之后，在黑暗条件下在轨道振荡器上使hMSC于96孔板中浸没在二甲亚砜(DMSO)中15分钟。接着将96孔板放置在微板读取器上以获得在595nm下的吸光度值。此外，在预定时间点(1天、4天和7天)时进行活/死染色。hMSC用活/死工作溶液(Life Technologies Inc.,USA)染色30分钟，接着在Nikon倒置荧光显微镜下观察以测定细胞活力。结果显示于图14和15中。如图14和15所指示，发现柠檬酸盐在20-2000μM的浓度窗中不影响hMSC增殖，但在更高浓度(高于2000μM并且多达20,000μM)下遏制hMSC增殖。
在另一实验中，在柠檬酸盐存在下培养hMSC和骨肉瘤细胞(Saos-2细胞)(ATCCInc.,USA)。如上所述培养hMSC。在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的麦考伊氏5A培养基(McCoy’s 5A medium)(Lonza Walkersville Inc.,USA)中培养Saos-2细胞。在80-90％汇合之后，在104个细胞/毫升的密度下将hMSC与Saos-2细胞两者接种于96孔板中。在调整pH至7.4之后，添加以柠檬酸形式计算的体积的柠檬酸盐至生长培养基中以获得生长培养基中最终柠檬酸盐浓度20μM、200μM、400μM、800μM、1000μM、2000μM、10,000μM或20,000μM。在37℃下在5％CO2下用补充有柠檬酸盐的培养基孵育hMSC和Saos-2细胞。每隔一天更换培养基。在预定时间点(添加柠檬酸盐后1天和4天)时，如上所述测定hMSC和Saos-2细胞的增殖。结果显示于图15和16中。如图15和16中所指示，发现柠檬酸盐在高于800μM的浓度下抑制Saos-2细胞增殖。此外，在高于2000μM的浓度下，大多数Saos-2细胞被杀死。
已为了实现本发明的各种目标而描述本发明的各种实施方案。应认识到这些实施方案仅说明本发明的原理。在不脱离本发明的精神和范围下，其众多修改和改适将易于为本领域技术人员显而易知。

Claims (22)

1.柠檬酸递呈组合物在制备用于促进骨生长的药物中的应用，其中所述柠檬酸递呈组合物包含具有式(II)结构的聚合物或寡聚物：
其中
R2是-H或
代表具有式(II)结构的重复单元的另一链；并且
m、n和p各自是8；或者
所述柠檬酸递呈组合物包含具有式(I)结构的聚合物或寡聚物与具有式(II)结构的聚合物或寡聚物的共混物：
其中
R1是-H、
代表具有式(I)结构的重复单元的另一链；并且
m、n和p各自是8，和q是6；
其中所述柠檬酸递呈组合物提供以所述组合物的体积计在20μM与1000μM之间的柠檬酸盐浓度。
2.如权利要求1所述的应用，其中所述药物进一步包括骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。
3.如权利要求1所述的应用，其中所述柠檬酸递呈组合物包含：
具有式(I)结构的第一聚合物或寡聚物：
其中
R1是-H、
代表具有式(I)结构的重复单元的另一链；并且
m、n和p各自是8，和q是6；以及
具有式(II)结构的第二聚合物或寡聚物：
其中
R2是-H或
代表具有式(II)结构的重复单元的另一链；并且
m、n和p各自是8，并且
其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或寡聚物掺合，以及
所述第一聚合物或寡聚物和所述第二聚合物或寡聚物彼此交联以形成聚合物网状结构。
4.如权利要求3所述的应用，其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或寡聚物的重量比在99:1与1:99之间。
5.如权利要求3所述的应用，其中所述组合物进一步包含分散在所述聚合物网状结构中的颗粒材料。
6.如权利要求5所述的应用，其中所述颗粒材料包括羟磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙、生物玻璃、陶瓷、镁粉、镁合金和脱细胞骨组织粒子中的一个或多个。
7.如权利要求6所述的应用，其中所述组合物包含多达65重量％羟磷灰石。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述羟磷灰石由所述聚合物网状结构的一个或多个侧挂官能团螯合。
9.如权利要求3所述的应用，其中所述组合物进一步包含粘着于所述聚合物网状结构的骨组织。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述骨组织围绕所述聚合物网状结构，并且所述聚合物网状结构整合至所述骨组织中。
11.如权利要求10所述的应用，其中所述组合物展现至少80％的骨与植入物接触。
12.一种柠檬酸递呈组合物，其包含：
具有式(I)结构的第一聚合物或寡聚物：
其中
R1是-H、
代表具有式(I)结构的重复单元的另一链；并且
m、n和p各自是8，和q是6；以及
具有式(II)结构的第二聚合物或寡聚物：
其中
R2是-H或
代表具有式(II)结构的重复单元的另一链；并且
m、n和p各自是8，并且
其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或寡聚物掺合，以及
所述第一聚合物或寡聚物和所述第二聚合物或寡聚物彼此交联以形成聚合物网状结构；
其中所述柠檬酸递呈组合物提供以所述组合物的体积计在20μM与1000μM之间的柠檬酸盐浓度。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或寡聚物的重量比在99:1与1:99之间。
14.如权利要求12所述的组合物，其进一步包含分散在所述聚合物网状结构中的颗粒材料。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述颗粒材料包括羟磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙、生物玻璃、陶瓷、镁粉、镁合金和脱细胞骨组织粒子中的一个或多个。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物包含多达65重量％羟磷灰石。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述羟磷灰石由所述聚合物网状结构的一个或多个侧挂官能团螯合。
18.如权利要求12所述的组合物，其进一步包含粘着于所述聚合物网状结构的骨组织。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述骨组织围绕所述聚合物网状结构，并且所述聚合物网状结构整合至所述骨组织中。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述组合物展现至少80％的骨与植入物接触。
21.如权利要求1所述的应用，其中，以组合物的体积计，所述柠檬酸递呈组合物提供选自20μM、200μM、或1000μM的柠檬酸盐浓度。
22.如权利要求12所述的应用，其中，以组合物的体积计，所述柠檬酸递呈组合物提供选自20μM、200μM、或1000μM的柠檬酸盐浓度。
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