CN104928359A - 一种癌干细胞的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种癌干细胞的鉴定方法，用致病和癌变两个癌基因的寡核苷酸，经生物素标记作原位杂交，并将显示双重阳性反应的细胞认定为癌干细胞；癌干细胞的鉴定方法为：在待测骨髓细胞涂片上作原位杂交；所用探针是经过地高辛标记的V-erbB和TS基因寡核苷酸；V-erbB寡核苷酸即为V-erbB发生突变/扩增位置的寡核苷酸。本发明可用于急性白血病完全缓解(AL-CR)病人骨髓正常与否的判断依据，从而决定采集正常骨髓，并低温保存备用。当AL-CR病人发生白血病复发时，即可使用此正常骨髓作有效治疗。结合应用本研究中另一项技术即V-erbB和TS基因PCR基因诊断法对上述标本作检测，其阴性反应结果支持骨髓正常判断。

Description

一种癌干细胞的鉴定方法

技术领域

本发明涉及癌症诊断领域，尤其涉及一种癌干细胞的鉴定方法。

背景技术

目前，对于干细胞的认识停留在其功能上，而非肉眼形态上，这就带来诸多困难。特别是骨髓中白血病干细胞的识别和多寡，对于开展自体骨髓移植治疗AL-CR患者白血病复发尤其重要。医生要在AL-CR阶段，判断患者骨髓是否正常，即含不含或含有多少白血病干细胞，决定是否采集并低温保存之，从而评估未来能不能使用这份骨髓作自体骨髓移植治疗白血病复发。

骨髓移植是治疗急性白血病的有效办法，但骨髓来源十分困难。自体骨髓移植来源无任何困难，但如将含白血病干细胞的骨髓回输入原患者体内则将带来白血病复发的风险。

国内外同行认同这样的观点：癌症是干细胞基因突变所致。我们的研究证明，正常骨髓干细胞是如何发生基因突变/扩增而成为癌前干细胞，而后又如何在骨髓或组织代赏性增生并发生相关基因即EGFR，TS/TK等基因扩增时，此癌前干细胞发生致病基因和癌变基因即两个癌基因双扩增，从而使其发展为癌干细胞。临床随访证明，此类患者可在3-5年内75％以上发展为白血病。说明癌干细胞是癌症发展的更重要原因。

鉴于上述无肉眼可见癌干细胞方法之缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种癌干细胞的鉴定方法，用以克服上述技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种癌干细胞的鉴定方法，用致病和癌变两个癌基因的寡核苷酸，经生物素标记作原位杂交，并将显示双重阳性 反应的细胞认定为癌干细胞；

癌干细胞的鉴定方法为：

在待测骨髓细胞涂片上作原位杂交；所用探针是经过地高辛标记的V-erbB和TS寡核苷酸；前条寡核苷酸即为V-erbB发生突变/扩增位置的寡核苷酸；

其序列如下：V-erbB Oligo：5‘GTT TGC CAG CTC TGC CAT 3’；

TS Oligo：(针对TS基因的编码区随机设计)；

上述基因之寡核苷酸在DNA合成仪上合成，电泳分离，酒精沉淀而成。

进一步地，应用上述两条寡核苷酸，经生物素标记，原位杂交技术，进行癌干细胞的鉴定，分离和应用，包括在自体骨髓移植治疗白血病中的应用。

我们是如何在基本阐明白血病等癌症发病原理和病因，特别是骨髓干细胞发生突变成癌前干细胞，再经过癌变成癌干细胞的过程并发明上述鉴定方法的。现简述如下：

1、发现并吸收国外有关科学成果，即禽类原始红细胞增多症(Avian Erythroblastosis)及其传染性致病病毒(AEV-ES4)癌基因V-erbB和V-erbA。正是它们的协同作用导致禽类红白血病的发生。研究证明，V-erbB产物与EGFR-TK，高度同源且EGFR在大多数肿瘤高表达。针对EGFR的单抗和对TK的小分子抑制剂治疗肿瘤均有效。

2、引进上述病毒癌基因作探针和Southern blot杂交技术，对急性白血病，肿瘤，MDS，特别是家族性白血病和MDS，进行细胞遗传学和一系列分子生物学研究。并最终证明，内源性V-erbB是白血病等癌症共同致病基因。它的缺失或插入等突变并扩增，导致白血病等癌症的发生。

3、应用骨髓细胞姐妹染色单体分染和互换(SCD/SCE)技术证明：1)SCD阴性(细胞周期成倍延长)之MDS，转白血病的机制在于骨髓造血细胞TS基因协同扩增；2)骨髓细胞SCE水平(SCE/Cell)愈高，其原始程度愈高。换言之，干细胞有最高水平SCE，说明它最易于发生突变。鉴于国外认为癌症是干细胞基因突变所致，我们因而认为，上述内源性V-erbB突变最大可能发生于骨髓和组织干细胞。

4、骨髓发生代赏性增生的机制在于骨髓干细胞发生EGFR，TS/TK等基因扩增。此间，已有V-erbB突变/扩增的白前干细胞势必发生上述代赏性扩增，从而形成拥有双重癌基因扩增的癌干细胞。美国NIH证明，TS基因 是个癌基因，我们则认定此基因为癌变基因。因为它强化了癌前干细胞的增殖力，使骨髓原始和早幼粒细胞％增加，同时染色体和细胞周期异常检出率也增加。MDS患者转白血病率也增加。因此，白血病等癌症发生的重大危险在于癌干细胞的生成及其癌克隆形成和随后的发展。

与现有技术相比较本发明的有益效果在于：本发明癌干细胞的鉴定方法，通过双重原位杂交反应来识别癌干细胞；观察AL-CR病人骨髓中残余的癌干细胞的多少，来判断其在未来自体骨髓移植中的可用性和导致白血病复发的风险。

附图说明

图1为本发明的MDS骨髓细胞涂片原位杂交结果；

图2为本发明的ITP骨髓细胞涂片原位杂交结果。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

基于上述研究，本发明癌干细胞的鉴定方法为：

用两个癌基因之寡核苷酸，经生物素标记在骨髓涂片上作原位杂交(ISH)。其具体过程为：

步骤1，骨髓穿刺标本4ml于肝素管中抗凝，经淋巴细胞悬液离心收集于EP管内，然后在涂片机上作涂片；

步骤2，V-erbB Oligo探针标记：杂交前细胞涂片的予处理，予杂交和杂交，杂交后的洗涤和检测等均按试剂盒的要求进行。

1)结果观察：显微镜下计数200个有核细胞。细胞核内出现棕褐色斑点为阳性反应。若阳性反应小于细胞核面积的1/4时计为+；阳性反应大于核细胞面积的1/4而小于或等于细胞核面积的2/4时计为++；而小于或等于细胞核面积的3/4时，计为+++；阳性反应大于细胞核面积的3/4时，计为++++。

对上述病例作V-erbB ISH检测的同时，每例均作骨髓细胞遗传学(包括核型分析和SCD检测)检查，此两项阳性结果将有力支持上述结果。

2)原位杂交检查结果：

对37例MDS(包括转白血病者)，3例可疑MDS和19例对照组(包括 8例ITP，7例AA，3例IDA和1例a-地贫)原位杂交检测结果如下：全部MDS和2例(2/3)可疑MDS呈阳性反应(图1)，对照组仅1例AA有阳性反应。对其中22例MDS和3例可疑MDS同时进行PCR和原位杂交检测，结果17例MDS，2例可疑MDS为两项指标均阳性的病例，阳性率76％，表明两者高度的一致性。

图1为应用致病基因V-erbB寡核苷酸原位杂交技术显示阳性结果。还需要用癌变基因TS之寡核苷酸在相同条件下作原位杂交，从上述阳性细胞中鉴定出具有双重阳性细胞，并认定为癌干细胞。理论上此类细胞应该很少。我们的研究证明，这种双重阳性且高拷贝数的扩增，只有发生于干细胞才能导致癌症的发生和发展，而发生于其他细胞则无此癌症发展进程。

3)动态观察： 

对上述7例MDS先后进行两次以上随访检测并作动态观察，同时对MDS各期的原位杂交积分值作t检验，发现杂交信号积分值依次为：RA组＜RAEB(T)组＜转白血病组(P＜0.001和0.005)。SCD阳性组＜SCD阴性组(P＜0.001)，而核型正常组与异常组无显著差别。说明随着MDS转为白血病，其原位杂交积分值呈显著性增加。这一点亦同原位杂交积分值与MDS患者骨髓原始和早幼粒细胞％的增加(P＜0.001)，和骨髓细胞SCD转阴的结果相一致。表明原位杂交结果不仅有诊断意义还有白血病发病学意义。

从MDS阳性反应图中可见不同细胞反应强度不同，从一个+到++++不等。从杂交反应的强度反映此细胞致病基因和癌变基因扩增的拷贝数。癌干细胞应该有最大拷贝数，应该从AL-CR正常骨髓液中剔除之后才使用。在目前无此技术的情况下，通过强化病人正常造血功能，来实现骨髓中基本不含癌干细胞的目标，而后立刻采集并-20度冰箱保存备用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种癌干细胞的鉴定方法，其特征在于，用致病和癌变两个癌基因的寡核苷酸，经生物素标记作原位杂交，并将显示双重阳性反应的细胞认定为癌干细胞；

癌干细胞的鉴定方法为：

在待测骨髓细胞涂片上作原位杂交；所用探针是经过地高辛标记的V-erbB和TS寡核苷酸；前条寡核苷酸即为V-erbB发生突变/扩增位置的寡核苷酸；

其序列如下：V-erbB Oligo：5‘GTT TGC CAG CTC TGC CAT 3’；

TS Oligo：(针对TS基因的编码区随机设计)；

上述基因在DNA合成仪上合成，电泳分离，酒精沉淀而成。

2.根据权利要求1所述的癌干细胞的鉴定方法，其特征在于，应用上述两条寡核苷酸，经生物素标记，原位杂交技术，进行癌干细胞的鉴定，分离和应用，包括在自体骨髓移植中的应用。