CN104911185A - 一种用于特异抑制esccal_1表达的干涉rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于特异抑制ESCCAL_1表达干涉RNA，所述的干涉RNA序列SEQ ID NO.5所示。本发明同时公开了利用上述干涉RNA制备干涉细胞株的方法。本发明首次提供了一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA，并将其制备得到干涉细胞株，将干涉细胞株进行动物实验，并与对照组进行对比，结果表明其能够明显抑制ESCCAL_1表达，进而抑制了肿瘤的生长与迁移，对于开发抗肿瘤药物有着重要的参考价值。

Description

一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA及其应用。

背景技术

ESCCAL_1是曹巍等从人食管鳞状细胞癌组织中筛选出的一个食管鳞状细胞癌特异相关长片段非编码RNA转录物，它在食管鳞状细胞癌组织中高表达，相应正常组织中低表达【Cao W,Wu W,Shi F,Chen X,Wu L,Yang K,Tian F,Zhu M,Chen G,Wang W et al:Integrated analysis of long noncoding RNA and coding RNA expression in esophageal squamouscell carcinoma.International journal of genomics 2013,2013:480534.】；并且促进食管鳞状细胞的侵润和转移、抑制细胞的凋亡。长片段非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNAs)通常是指长度在200个核苷酸到数千个核苷酸的非蛋白质编码RNA，LncRNAs在基因组转录过程中异常丰富，具有时空表达特异性，缺乏有义开放阅读框(open readingframes,ORF)。它们具有转录调控、转录后调控、蛋白质翻译调控等多种作用。越来越多的证据表明：LncRNAs参与许多细胞的生长过程，包括胚胎干细胞多能性、细胞周期调控、疾病发生，以及肿瘤的形成等【Guttman M,Rinn JL:Modular regulatory principles of largenon-coding RNAs.Nature 2012,482(7385):339-346.】。

ESCCAL_1作为长链非编码RNA的一个新的成员，其在肿瘤发生发展中的作用还没有深入的研究。申请人的研究发现ESCCAL_1在肿瘤细胞、特别是在食管鳞状细胞癌中含量明显高于正常细胞，且ESCCAL_1本身能够明显促进肿瘤细胞的生长和迁移。而目前对于其促进机理及如何抑制ESCCAL_1促进肿瘤细胞的生长和迁移的过程还没有研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA及其应用，能够很好的对肿瘤起到抑制作用，为其在抗肿瘤药物中的应用提供了基础。

本发明的技术方案如下：

一种用于特异抑制ESCCAL_1表达干涉RNA，所述的干涉RNA序列SEQ ID NO.5所示。

一种利用以上所述的干涉RNA制备干涉细胞株的方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的干涉RNA合成双链DNA；

(2)通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的RNAi慢病毒载体GV112和步骤(1)合成的双链DNA进行连接转化，制备感受态细胞；

(3)制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，培养后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液；

(4)将慢病毒颗粒感染EC9706细胞，筛选出ESSCAL_1稳定干涉的细胞株。

以上所述的制备干涉细胞株的方法，步骤(1)中合成双链DNA的方法为将干涉RNA溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15分钟，然后自然冷却至室温，TTTTTG是终止信号。

以上所述的制备干涉细胞株的方法，步骤(2)中连接反应体系为：1μL线性化的载体DNA 100ng/μL、1μL DNA oligo 100ng/μL、2μL 10XT4噬菌体DNA连接酶缓冲液、1μL T4噬菌体连接酶，反应体系为20μL。

以上所述的制备干涉细胞株的方法，步骤(3)中共转染后8h更换为完全培养基，培养48h。

以上所述的干涉RNA在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明首次提供了一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA，并将其制备得到干涉细胞株，将干涉细胞株进行动物实验，并与对照组进行对比，结果表明其能够明显抑制ESCCAL_1表达，进而抑制了肿瘤的生长与迁移，对于开发抗肿瘤药物有着重要的参考价值。

附图说明

图1为实施例2中敲除ESCCAL_1对肿瘤细胞侵袭的影响图；其中CON:正常目的细胞、未感染任何病毒的细胞组；NC:正常目的细胞、加阴性对照病毒感染的细胞组；KD:正常目的细胞、加目的基因敲减病毒感染的细胞组；

图2为实施例2中敲除ESCCAL_1对凋亡的影响图；其中NC：正常目的细胞、加阴性对照病毒感染的细胞组；KD：正常目的细胞、加目的基因敲减病毒感染的细胞组。

具体实施方式

实施例1：ESCCAL_1在人食管鳞状细胞癌癌细胞株EC9706中的表达

通过荧光定量PCR实验检测ESCCAL_1在人食管鳞状细胞癌癌细胞株EC9706和正常细胞中的表达，方法如下：依照试剂生产厂商说明(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，应用Trizol试剂提取食管癌鳞状细胞癌组织和相应正常的食管鳞状上皮组织总RNA，应用2100生物分析仪对RNAs进行定量(Agilent technology,USA)。PCR引物序列如下：ESSCAL-1(chr.8_TCONS_00014521)，正向引物:5’-CCAGACAGCAGCAAAGCAAT-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物5’-GGAAGCAGCAAATGTGTCCAT-3’(SEQ ID NO.2)；GAPDH，正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO.4)。取相同量cDNA进行定量PCR，以GAPDH为对照，应用Q-PCR对26例配对ESCC组织与正常组织中的ESCCAL_1表达情况进行检测。按照Faststart Universal SYBR Green Master Mix试剂盒(Roche，德国)说明，在ABI 7900HT Version 2.3(Applied Biosystems，USA)荧光实时定量PCR仪上进行反应。每个反应设3个平行管，总反应体系为10μL，包含Faststart Universal SYBR green mastermix 5μL，上、下游引物各0.5μL(0.5mM)，逆转录反应产物模板1μL，灭菌水3μL。反应条件为：初始变性94℃，10min；然后94℃，15s，60℃，1min，循环40次。

实验结果表明，LncRNAs ESCCAL_1在食管癌组织中表达明显高于其相对正常组织。实施例2：ESCCAL_1促进食管鳞状细胞癌细胞的生长和迁移

根据ESCCAL_1靶序列GGAGAAAGACCCAAGCAAA(SEQ ID NO.5)进行siRNA设计，合成的单链DNAoligo信息如下表(由上海吉凯基因公司合成)：

双链DNA oligo制备：

1)合成以下单链DNA oligo(DNA合成5'-STEM-Loop-STEM-3’)。ESCCAL_1-RNAi-a,5'-CCGGGAGGAGAAAGACCCAAGCAAACTCGAGTTTGCTTGGGTCTTTCTCCTCTTTTTG-3'(SEQ ID NO.6)

ESCCAL_1-RNAi-b,5'-AATTCAAAAAGAGGAGAAAGACCCAAGCAAACTCGAGTTTGCTTGGGTCTTTCTCCTC-3’(SEQ ID NO.7)

2)引物退火形成带双链DNA：把合成后成双对的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15分钟，然后自然冷却至室温，TTTTTG是终止信号。通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的RNAi慢病毒载体GV112和DNA片段在缓冲液中进行连接，于16℃连接过夜，连接产物进行感受态细胞的制备。连接反应体系为：1μL线性化的载体DNA 100ng/μL、1μLDNA oligo 100ng/μL、2μL 10XT4噬菌体DNA连接酶缓冲液、1μL T4噬菌体连接酶，反应体系为20μL。挑取转化子重悬于10μL LB溶液，混匀取1μL作为模板；使用GV112通用引物，进行菌落PCR鉴定试验。将PCR阳性克隆进行测序，测序引物与鉴定引物中的上游引物相同。

RNAi慢病毒包装与滴度检测：制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。将慢病毒颗粒感染EC9706细胞，筛选出ESSCAL_5稳定干涉的细胞株。利用Transwell方法检测ESCCAL_1干涉对食管癌细胞迁徙力的影响；利用流式细胞仪检测细胞凋亡。

对ESCCAL_1序列不同区域设计了小干扰RNA靶向ESCCAL_1，用构建的ESCCAL_1siRNA慢病毒感染EC9706；与对照组相比，EC9706侵袭力明显下降(图1)、细胞凋亡增加(图2)(*P<0.05)。实验数据表明：ESCCAL_1与编码基因一起抑制肿瘤细胞的凋亡，并使肿瘤细胞具有更强的侵袭力和转移能力。

实施例3：ESCCAL_1对食管癌细胞的成瘤影响

取对数生长期的食管癌鳞状细胞EC9706细胞(对照组)和ESCCAL_1干涉细胞株(敲除组)，用胰蛋白酶消化后，用血球计数板对细胞进行计数，并最终用一定体积的D-Hanks重悬，使细胞悬液的浓度为10⁷个细胞/mL。将一次性注射器，吸取1mL，皮下注射至动物右前肢腋下，每只200μL。隔天观察皮下成瘤情况。观察裸鼠生存状况和肿瘤体积的变化情况，称重体重、测量肿瘤的长径和短径。皮下注射23天后，实验动物进行颈椎处死。在白板上排列好动物，并用2把标尺放置于左边与上方，以便观察具体刻度，用数码照相机拍摄动物照片。并将肿瘤放在上方便于观察。用医用剪刀和医用镊子取出肿瘤，并在白板上排列好后拍照留存。同样需要标尺作为参照，读取具体刻度。将取出的肿瘤称重。

结果显示干涉组的肿瘤体积明显小于对照组。对照组肿瘤颜色暗红，质软，而干涉组肿瘤颜色显得苍白，其重量平均较对照组轻1.288-0.541＝0.747。

序列表

<110>  江苏迈健生物科技发展有限公司

<120>  一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA及其应用

<130>  1

<160>  7    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ccagacagca gcaaagcaat                                                 20

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ggaagcagca aatgtgtcca t                                               21

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

ccgggaaact gtggcgtgat gg                                              22

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt                                           25

<210>  5

<211>  19

<212>  DNA

<213>  干涉RNA

<400>  5

ggagaaagac ccaagcaaa                                                  19

<210>  6

<211>  58

<212>  DNA

<213>  ESCCAL_1-RNAi-a

<400>  6

ccgggaggag aaagacccaa gcaaactcga gtttgcttgg gtctttctcc tctttttg       58

<210>  7

<211>  58

<212>  DNA

<213>  ESCCAL_1-RNAi-b

<400>  7

aattcaaaaa gaggagaaag acccaagcaa actcgagttt gcttgggtct ttctcctc       58

Claims (6)

1.一种用于特异抑制ESCCAL_1表达干涉RNA，其特征在于：所述的干涉RNA序列SEQ ID NO.5所示。

2.一种利用权利要求1所述的干涉RNA制备干涉细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述的干涉RNA合成双链DNA；

（2）通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的RNAi慢病毒载体GV112和步骤（1）合成的双链DNA进行连接转化，制备感受态细胞；

（3）制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，培养后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液；

（4）将慢病毒颗粒感染EC9706细胞，筛选出ESCCAL_1稳定干涉的细胞株。

3.根据权利要求2所述的制备干涉细胞株的方法，其特征在于，步骤（1）中合成双链DNA的方法为将干涉RNA溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15分钟，然后自然冷却至室温，TTTTTG是终止信号。

4.根据权利要求2所述的制备干涉细胞株的方法，其特征在于，步骤（2）中连接反应体系为：1μL线性化的载体DNA 100ng/μL、1μL DNA oligo 100ng/μL、2μL 10XT4噬菌体DNA连接酶缓冲液、1μL T4噬菌体连接酶，反应体系为20μL。

5.根据权利要求2所述的制备干涉细胞株的方法，其特征在于，步骤（3）中共转染后8h更换为完全培养基，培养48h。

6.一种抗肿瘤药物，其特征在于：包括权利要求1所述的干涉RNA。