CN104894134A - 二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子TuPMM-A1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发现涉及分子生物学领域，具体涉及二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子TuPMM-A1及其应用。本发明克隆了TuPMM-A1基因的启动子p TuPMM-A，证明该启动子驱动的基因表达主要在根、茎、叶、幼穗等器官中表达，在发育的种子表达量较低，干种子中未检测到PMM蛋白的积累。功能验证表明，该启动子在翻译起始点上游0.42-0.62kb范围内发挥的功能。该启动子可用于驱动目标基因主要在叶片中表达。

Description

二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子TuPMM-A1及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子TuPMM-A1及其应用。

背景技术

普通小麦为六倍体(Triticum aestivium L.,2n＝42,AABBDD)，由二倍体祖先物种乌拉尔图小麦(Triticum urartu L.,2n＝14,AA)和目前未知的B组供体，以及D组的供体粗山羊草(Aegilops tauschii L.,2n＝14,DD)经过两次自然杂交加倍形成。

小麦是我国的重要粮食作物，其生产水平直接与我国的粮食安全息息相关，我国的小麦育种工作者培育了相当数量适应我国各地气候和栽培条件优良小麦品种，育种水平不低于西方发达国家。

植物的转基因涉及三个方面研究内容：第一，用有效的手段将目标基因进入受体。由于各种植物自身的特点，一种手段不可能在所有的植物中都适用，需针对不同的植物，研究高效的转化手段。如在拟南芥和水稻中，农杆菌介导的基因转化比较有效简易，而到目前为止，农杆菌转化小麦的技术尚在实验室进行探索研究中。第二，如何能够在特异的位点导入目标基因，避免对基因组中其他功能基因的破坏。通过同源重组的定点打靶技术，在动物的转化中获得较大成功。目前，我国的科学家在在利用TALEN和CRISPR/Cas9基因组编辑技术在作物基因组内进行定点编辑(如定点突变、定点甲基化修饰、定点基因沉默和激活等)方面取得了重要的进展。第三，如何能使转入后的目标基因按设计或有效地进行表达。大部分转基因实验，均是使用组成型高表达的启动子，如在双子叶植物中通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子；在单子叶植物中主要采用玉米泛素ubiquitin和水稻肌动蛋白actin启动子等；这些组成型表达启动子调控的基因表达不受时空限制和外界环境的诱导,即在植物所有组织中均过量表达目的基因，其结果会造成转基因植物体内物质和能量的无谓浪费，可能引起一些副作用。

近年来，随着对转基因安全的关注，相对安全的基因改良的农作物至少需要满足以下几个方面的要求：(1)外源的(非宿主植物自身来源的DNA序列降低到最低程度)；(2)目标基因的产物在人类或动物的食用组织或器官中最好不积累(对于改良目标为相应组织或器官的除外)；(3)能经过相对较长时间的证明，改良的性状经过了严格的动物、环境试验，并证明是安全的。就前两个条件而言，需要研究者广泛地研究，并对目标生物体中相关的基因进行筛选。如水稻的Actin，玉米的Ubiqutin基因的启动子，但这类启动子也有其明显的缺点。目前，迫切需要筛选在种子器官中不表达或表达量低，其蛋白产物不能有效积累(翻译起始点上游的序列在种子中不同有效地驱动翻译，引起蛋白的积累)启动子序列，尽可能地降低转基因产物在人类的食物或食物加工的原材料中的积累。

普通小麦中有六个磷酸甘露糖变位酶基因成员(phosphomannomutase,PMM)，分别定位在小麦的第二群(TaPMM-A1，B1和D1)和第四群染色体(TaPMM-A2，B2和D2)，在根、茎、叶、旗叶和幼穗等器官中TaPMM-A1的表达量比较高，且这种表达方式在二、四倍体祖先物种中有相同的趋势，说明在六倍体小麦PMM-A1基因的启动子序列在二、四和六倍体小麦物种中基本相同，受到了相同的调控方式。

发明内容

本发明的目的是提供乌拉尔图小麦TuPMM-A1基因的启动子p TuPMM-A。

其中，乌拉尔图小麦TuPMM-A1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

ATGGCGGCGGCGAGGAAGGACGCCGGTGTGCTCGCGCTCTTCGACGTCGACGGCACCCTCACCGCGCCCCGCAAGGAGGTGACGCCGGAGATGCTCGAGTTCATGAAGCGCCTGCGCGAGGTGAGGCCCGAATGTGACCCTGTCTGTCGTTCTCTCGTTTCAGTTTCTTTTCCGTACAATTCTCAGGCGAGATTGCTCACTGTATGTCTGGGTTGTGGCACTCTGGTTTTCTTCCTGGGAGCAGAATGTGACCGTCGGCGTGGTGGGGGGATCCGATCTGGTCAAGATCTCCGAGCAGCTCGGCAAATCAGGTACCCGCCCTGCTTGGATTCAGCAGGACACTCTGCTTGGATTCAGAGTCCCCCCTAACCGCACTGTTCACTCACCTTGTCTGTAACTGTAACTGCAAGACTGAGCTTGATATTTGTTCTCCCCACTGCAGTCATCACCGACTATGACTACGTCTTCTCCGAGAACGGCCTGGTCGCGCACAAGGACGGCAAGCTCATCGGGACGCAAGTAAGTGCCCACGCCGCATAATGCGCGCTGTTTTAGCACAGATGTACAACTGAATTTTGCCTGGTGTTCTTCACTCTGCAGAGCTTGAAAACGTATCTTGGAGATGACCAACTTAAGGTGAGCCTGTGTTGTGTGACGTTTTTTTTTCTTGTACTGCTGTTGAAGATGAGTTTTGAGGCCTTGGTAGTGATGTTTATGTGTTCTTTGCAGGAATTCATTAACTTCACTCTTCATTACATCGCGGATTTGGATATCCCAATTAAAAGGTCAGTGCGGAATCCTGTTTGAGAATTCCCTCGGACGCTTGCCCTTTACTGACCGGGTAAAGTAAATGTTTCCACAGGGGTACATTCATAGAGTTCAGGAGTGGAATGATCAATGTGTCGCCTATAGGGAGGAACTGTAGTCAAGAAGAACGTGATGATTTTGAGAAGTATGATAAGGTACAGATTGTCTTATAAGAACAAGTAGTTAGTCAATAATCAGAAAGGGGGGATAGCTATTAGAAAAACATGAAACTGAACCGACTCGTTTTGTTTAGGTACATAACGTTCGGCCTAAAATGGTGTCAGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCACACCTGAACCTGACTTTTTCTATTGGAGGGCAGATCAGTTTTGATGTAAGTGTTCTGAACTCATAAAAATCTGCTAGAAATCTTCAGTTTGGTATTTACTACTGCATCACTGAATTCAGGTATTCCCACAAGGCTGGGACAAAACCTACTGCTTGAGATATCTGGAAGAATTCAAAGAAATCCATTTCTTTGGGGACAAAACCTACAAGGTAAGATACTTTAGTTGTGCAGTGCTTCCAAGTAAAGAAATCTCCTTTTCTTTTTTTGAAGTACTTTTGTGCACACAAGATGTTGTTTGATAAACTTTTCAAGCCACTGTTAACGACATCCCATTTAATTACTACAGTACAAACTTAGCTGTACTGTATACTACAAACTGAAACTGACATTCGTTTTTCCTCTGATTATATTTAATAGGGTGGCAATGATCATGAGATATTTGAATCTGACAGAACAGTTGGTCATACAGGTATGCTCGTTGTATGTTAAAAGCTATTCTTCTGATGGTTATGAAATCTAGGAGGCATTTATATTTATATAGAGGACATCCCTGAACGAGCAATTTTGCATTGTAAAAAATATCATAGCTTAACAGGAGATTTCTCGAAGGGTTGGTTAATAAGTAAACAGGAGAGACAGAGAGAACCTCTTTGTAGCAAACGATATTATTAGTTGCCAACTGATTCCATATTTGGCATTGTGGTCAACCATGAGGGCAGTATCATTAATATCTAACCACTCTGAATTGTTGATGATCGAGCTGTAGTGGCTGTCAGAAACTACCTTTTCACCATCATATCTAATCATCCGGAGTAGCACCTTTTCAAGTCATATTCGTCCCTGAAGAGTGCACCTCGGGCTGTAACCGAGTAAATAATAGGGCATCAATAGCCCTTCAGAAACATTACACAGCTCCCATTGTAATTTAGTTGCAAAACATTACTCTGTTACTCCGCTTTGTTAGCGAGACTAGAGCTGGTGTCTGGCCCAGTTTTTTAGCCGAGTCCCACCCATGATTTATTTATCGGGATTTGGTGCTGACTGACCGTTTACATGTGCAGTTACCAGCCCCAATGACACTGTGCAGCAGTGCAAATCCATCTTCCTGTCGGAGTGA

根据本发明的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子p TuPMM-A的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5'-ATCTCGCTCTGGCTCGTAGTGGAACTTTCCGAGCATAATTGGTTTGATGCCAACATTCTGCATTGCCATTATTTGGCAAGCCAACATTTGGCAAAATCAAAAGTCACCAAAATTTGGCGACTTTTTGTGAGATTGACAAGAAAAGTTGGTAGCCAACATTTGACATTTGCCAAATATTGTCATGCCAGCTTTTGGCAGCGAACCAATTATGCTCTCCGTCCTCATTTAGAACCTCTTTGTTAATGATTTTGGCCAACACCTTTTGGATGCGCTCATACTCTGTTAATAATTCCCCTATGTCTATGTCCCTCTCCATCTCTTCGGACCACTTGACGATCTGGCTATGTTTTTGCAAATATTTGCTTTTCTTCAATAAGTCGTATATGATGGCCATGGCACAATAGCAAGACCTATGAGAGGATTTGACATTTGGTTTTCTATAGCAACAAGCGCTAGTGAAGAACTTAATTTCGGAATGCTTTGTTATCGTCTCGTTGTAGTTCTTACACTTGGCTAGAGCATCATTTAGAACCTTCTTCAATCTGGTCCATTGCTTTTTAGGGTGTCTCGTCGAATCGAAAAAATAAGCCAAGCCCTGCGTCGGCAGTAGCGTGATTACGATCCAATATCGGTCACTGCGCAAAAAAAGAAGAAATTGGCATTGATGAGGTGAAACCAGAAGGTCATTTATATGTTTCAAAATAAATGAGTGAATGTTAACGACTTACTTGTCACAATATGGCACTAGTAAGGTGTCCTTACATGGATGATTCACAAGCATGCACGGGAACAGTAGTCCAAGATGAGCTCCTACTATTTCCGGTTTCCAGGTTGTGGCAGTGCATGTAAAAAGATCGAGTAAGGACACTTTACGATGCTGGAGTAGGCGATCTGAAGCTCCTTGAAGTACCCAAAGCCTTATTAACTCTGGGGAGGCTGCGCTGACAGAGAAGATATTCACATGGATCACCTCATTGAAGACTAGATCAATTTTATCGGCCGAAAACTCTTGGATGAAATTGTAACCTTCTATGACCTTGGCCATGTATCCATGTTGACCTTCTTTTGATTTATCTACAACATCGGCGTGTAGAACTTGAAGATCGAGCGACCTTGCTGGGTGGCATTGGGCGTGCACAAGCCTACATGCCAGAGCCTGGCCGAGCCCGCCTGTCGGTGTGTACGCCCCACACCGGGCTCGTCCGGTCACGACAAGCGGTTCATGCGTTGCGATCGCTCCACTGGCCGTATGTTGTGTCCGTCTTAGACGGCTCGTACATGGGGCTAGGCATCCAAGATGCGTACCTGGGCAACCCGGCTCGGCGGTCCATGCTGGGTAGCTTTGGTCGGGCAAGCGGGGCATAGTGCGTGCGCCTGGCTCTATGGGTGTTGGTTCGTCCGTGCAAGCATTGTTCTCCGCGAGCTAGACATGCGCACTCGCCTGATGCACCCAGCCGGCTATGCAGAGGGATGTCCAGCCGTCTGTGCGGGCTGGGGGCGCTTGTCTGGGTCTTCTGGCTACCCAGCTGTGCGGATGGCCATTTAGCCGTTGTGCTGCCTATGGGAGGTGTTTTTTTGAAGGGGCCTATGGGAGGTGTTTGCCTGGCCCTTTCGGCTACCCGGTAGTTTGGCTGGGGCATTATGTCGATTTGCCGTGGCCCTGGTGTGTCTTGGCGCTTTGATGTTTTCTTTGAGGCGGTTACATTTTCTTATAAGTTTGTTGTTTTACGGGCAATTCAGACGCGACGTTCATTGCACATCCTCCCCCTTTCATTTGCATGTCTCGCTCCAGAGGGCTTTGCTCATTGTAGCCGGCGATGTTTTGCTACATCGTCGACGGGAGATGGCCGAGTTCGTGGAGGGGGAGATGGAGGGGCCTGGGCCCATGGAGGACAACAGGCTGACGGGGGAGGAGCTTGCACTGGCTAAGTAATCGGTGCTGTGGTTCAGCATGCTTCGGGAAGAACAACCGTCGCGAGCACTTTTGTTCCTGCCGATAATCAATCGGTGTCTCTTGGGCGCGTGAGAGGCTTTCATGTGAACTATGTTCGTTATGCATCGAACGAAACTGGTTGGAAACGATCTGCCCGGTTGGAGTTGGCTAACACATTTTTTCACATGCGGGCTACCACATTGTGTTTGACCGCGAGGATGCTCAAAGGACCTATTTGTAATGTTTTTTATGTGCGGTTCGCTCTGCAATGTTTCGTGAACATTTGTCATGTTTTCGTCTTTCTGCTAGTTTTATATGCAGTTGTATTCTGTTTTTTAGTATCCCTCTGTAAAGTAATATAAGAGCGTTTAGTTCAGTATTTCTTTACTGAGAGAGTATTAATTAATAATTCAATTAATATAATGTGTGCGGTAAAAAAAGTCCATAGCGATTTTAGCCCCAGCGTGTCTCCTACGTGGGGGGTGTGGATACGAACTCTGCGCGCAGTGCGCCACTCCGCGACCGCCACGTGGCCGGAAGCACGTCGAGGCGGCTGACGTGGCGCCCGGTCGTCGGCCCGCGCCGACCCGCGTGGGCCGACGTCATCCCCGTCCTCGCCGTCGCCGCCTCGTGGCCTCGTGGGGGGAGCGAGAAGAGATAGAGGAGCAGCCCCGGCGCATCTGGATCCGCGCCGCAAAGCTGACTTCTTTCTCCGCCGCACGCATCCTCCACCTCCTCCTCCCGGCGACCACCCCGGGGGCGCTATATCACGCGGCCGCCGCGAGGAGCTGCGCCCCGTCCCTTCTTCTTCCTCGTAGCAGCCTCAGCAGCAGGAGGAAGATG

根据本发明的具体实施方式，通过以下步骤发现了乌拉尔图小麦TuPMM-A1基因的启动子并研究了其发挥功能的区段：

(1)以六倍体普通小麦研究对象，检测了六个TaPMMs在叶片以及发育的籽粒中的表达量。

(2)提取了不同的普通小麦品种的干种子中的可溶性总蛋白，并用PMM蛋白的抗体检测了干种子中PMM总蛋白的积累。

(3)设计TaPMMs启动子区特异的引物，利用二倍体和六倍体小麦的基因组进行扩增后，回收PCR产物，进行常规的TA克隆和测序，成功在二倍体乌拉尔图小麦和六倍体小麦中克隆获得TuPMM-A1，TaPMM-A1和TaPMM-D1三个基因的上游序列。

(4)对三个序列进行多重序列比对，分析启动子区功能元件，确定对TuPMM-A1启动子-1.2kb范围进行进一步的功能分析。

(5)利用系列缺失法构建了七个TuPMM-A1promoter::GUS植物表达载体(F1-F7)，转化拟南芥，成功获得了F1，F4-F7转基因阳性株系。

(6)检测了F1，F4-F7转基因阳性株系中的GUS基因表达，表明TuPMM-A1promoter发挥功能的最下区段在ATG上游0.42-0.62kb范围内，其序列为如SEQ IDNo.3所示：

5'-ATGCTCAAAGGACCTATTTGTAATGTTTTTTATGTGCGGTTCGCTCTGCAATGTTTCGTGAACATTTGTCATGTTTTCGTCTTTCTGCTAGTTTTATATGCAGTTGTATTCTGTTTTTTAGTATCCCTCTGTAAAGTAATATAAGAGCGTTTAGTTCAGTATTTCTTTACTGAGAGAGTATTAATTAATAATTCAATTAATATAATGTGTGCGGTAAAAAAAGTCCATAGCGATTTTAGCCCCAGCGTGTCTCCTACGTGGGGGGTGTGGATACGAACTCTGCGCGCAGTGCGCCACTCCGCGACCGCCACGTGGCCGGAAGCACGTCGAGGCGGCTGACGTGGCGCCCGGTCGTCGGCCCGCGCCGACCCGCGTGGGCCGACGTCATCCCCGTCCTCGCCGTCGCCGCCTCGTGGCCTCGTGGGGGGAGCGAGAAGAGATAGAGGAGCAGCCCCGGCGCATCTGGATCCGCGCCGCAAAGCTGACTTCTTTCTCCGCCGCACGCATCCTCCACCTCCTCCTCCCGGCGACCACCCCGGGGGCGCTATATCACGCGGCCGCCGCGAGGAGCTGCGCCCCGTCCCTTCTTCTTCCTCGTAGCAGCCTCAGCAGCAGGAGGAAGATG

本发明明确了PMM-A1基因及其蛋白在发育种子中的积累(六倍体普通小麦)，在祖先二倍体物种中克隆TuPMM-A1基因的启动子，减少六倍体物种中基因克隆的复杂性，且已经证明其与六倍体中的对应基因具有相同的表达模式，并通过检测TuPMM-A1promoter:GUS转基因拟南芥中GUS基因的表达，初步明确p TuPMM-A启动子的最下功能区段，结合其自身的表达和在异源植物拟南芥叶片中驱动的报告基因的表达，该启动子可应用于转基因的应用与研究。

附图说明

图1：六个PMM成员在普通小麦(中国春)旗叶以及发育的种子中的表达模式。FL：旗叶；10，20和30DPA分别为授粉后10，20和30天的种子。

图2：不同小麦品种种子可溶性蛋白SDS-PAGE电泳以及PMM蛋白印迹图。M：标准蛋白分子量marker(全氏金基因blue plus protein marker II)；泳道1:H6756；2：内麦9号；3：豫麦67；4：淮麦22；5：阿夫；6：长旱58；7：晋麦54；8：原核表达经过His标签纯化的PMM蛋白；9：转化His-PMM融合基因质粒的BL21细菌诱导后总蛋白。箭头标示His-PMM融合蛋白，植物样品中的PMM蛋白分子量小于融合蛋白。

图3：PMM-A1基因启动子区的扩增后1％琼脂糖凝胶电泳图。A为引物PRO-A1

F1R1配对，B为PRO-A1F2R2引物配对。M：DL5,000(大连宝生物)，泳道1-2均为目标产物泳道。

图4：构建的植物表达载体TuPMM-promoter:GUS示意图(后续相应的转基因株系用F1-F7表示)。

图5：拟南芥阳性转基因株系中GUS基因的表达。

具体实施方式

实施例1

(1)以六倍体普通小麦研究对象，设计了六个TaPMMs基因特异的引物(参见以下表1中的引物，)，检测了叶片以及发育的籽粒中的六个基因的相对表达量。

表1本申请中用于检测普通小麦6个PMM-A1基因的引物

如图1所示，六个PMMs成员在普通小麦(中国春)旗叶以及发育的种子中的表达模式，PMM-A1是所有六个PMM基因在旗叶中表达量最高的成员，所有的PMM成员在发育的种子中的表达量相对较低，种子中PMMA1的表达大约是其叶片中的1/15。

(2)提取了不同的普通小麦品种的干种子中的可溶性总蛋白，并用PMM蛋白的抗体检测了干种子中PMM总蛋白的积累。

如图2所示，不同小麦品种种子可溶性蛋白SDS-PAGE电泳以及PMM蛋白印迹图。蛋白印迹检测后，在出现非特异条带的情况下，PMM特异条带未出现，说明在种子可溶性蛋白部分未见PMM蛋白的积累

(3)设计TaPMMs启动子区特异的引物(表2中PRO A1-F1和R1，PRO A1-F2和R2分别配对扩增二倍体和六倍体小麦PMM-A1的启动子；PRO D1-F1和R1扩增六倍体中PMM-D1基因的启动子)。利用二倍体和六倍体小麦的基因组进行扩增后，回收PCR产物，进行常规的TA克隆(Promega公司的T-easy载体，按其说明书进行克隆)和测序(送上海生物工程有限公司进行测序)。成功在二倍体乌拉尔图小麦和六倍体小麦中克隆获得TuPMM-A1，TaPMM-A1和TaPMM-D1三个基因的上游序列。如图3所示，PRO-A1F1R1以及PRO-A1F2R2配对后的PCR产物经1％琼脂糖凝胶后，切胶回收(鼎国胶回收试剂盒，按说明书进行)。产物与Promega公司的T-easy载体连接(按说明说进行)，5-10μL连接产物转化100-200μL大肠杆菌DH5a感受态，在含有氨苄青霉素(50μg/ml)，X-gal以及IPTG的平板上LB培养基上进行37℃培养过夜(每个平板加入40μL 200mg/mL的X-gal和4μL 1mol/L的IPTG。对白班进行菌落PCR，电泳检测后的克隆，用于进一步的质粒提取和测序验证。

(4)对三个序列进行多重序列比对，进行启动子区功能元件的分析，确定对TuPMM-A1启动子-1.2kb范围进行进一步的功能分析。

(5)利用系列缺失法构建了七个TuPMM-A1promoter::GUS植物表达载体。用引物PMMP Hind III F1-F7与PMMP Bgl II R分别配对，利用测序正确的TuPMM-A1启动子TA克隆做模板进行扩增，PCR产物经回收后，用Hind III和Bgl II进行酶切，与进行了相同的酶切处理后的pCAMBIA1301载体进行连接，产物转化DH5a感受态，对阳性的重组子进行测序验证扩增，获得正确的植物重组载体F1-F7，它们在翻译起始密码子上游的长度分别为120，220，320，420，620，820和1120bp(如图4)。正确的质粒进一步转化农杆菌GV3101，按浸花法克隆后转化拟南芥，成功获得了F1，F4-F7转基因阳性株系(表2，HPT Foward和35S promoter R)引物鉴定阳性的转基因株系。所用的pCAMBIA1301载体，置换了GUS基因上游的CaMV 35S启动子序列。

如图4所示，载体的骨架为p1301，GUS为报告基因，该载体携带能在植物中表达的潮霉素抗性基因，便于转基因植株的筛选。通过对T0植株的抗性筛选，T3纯合株系的分子鉴定(潮霉素抗性基因和35S启动子区的引物的扩增)，获得了F1，F4-F7等五个具有不同长度的PMM-A1-promoter的阳性转基因株系。

(6)检测了F1，F4-F7转基因阳性株系中的GUS基因表达，表明TuPMM-A1promoter发挥功能的最下区段在ATG上游0.42-0.62kb范围内。如图5所示，拟南芥阳性转基因株系中GUS基因的表达。因F1和F4区段的启动子不能驱动报告基因GUS的表达，其后F5-F7均能驱动GUS的表达，说明PMM-A1promoter发挥功能的最小区段大在ATG上游0.42-0.62kb范围内(如序列SEQ ID No.3所示)。

表2：克隆植物表达载体和鉴定阳性转基因植物所用的引物

Claims (4)

1.二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子p TuPMM-A，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子p TuPMM-A的功能片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.权利要求1所述的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A在转基因技术中的应用。

4.权利要求2所述的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A的功能片段在转基因技术中的应用。