CN104894098A - 一种固定化益生菌发酵剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种固定化益生菌发酵剂及其制备方法，其特征在于该发酵试剂包括：菌剂为干酪乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉，固定化载体为琼脂、海藻酸钠、魔芋粉、黄豆粉和硅藻土。该固定化益生菌发酵剂可反复多次使用；该固定化益生菌发酵剂制备方法简单，可重复利用次数高，载体强度高、透水性佳、菌剂活性高、产活性物质丰富，在发酵食品和饲用微生物制剂生产上极具应用潜力。

Description

一种固定化益生菌发酵剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及菌剂固定化包埋领域，主要是涉及一种固定化益生菌制剂及其制备方法。

背景技术

干酪乳杆菌是一种有益人体健康的益生菌，在进入人体肠道后可大量存活，并发挥调节肠道菌群平衡、促进人体消化吸收等作用，在食品、医药及饲料领域有广泛的应用。酿酒酵母和黑曲霉均为可食用安全微生物，在食品医药及饲料领域同样应用广泛。同时由于干酪乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉生理特性差异，它们在对氧的耐受性或者需求上、营养物质利用能力、代谢产物特性和生长速度等方面存在巨大差异，如能充分发挥各菌株长处，规避其短处，则可良好发挥各菌株益生功能获得高效益生菌制剂和相关产品。

经过对现有技术的检索发现，已有的乳酸菌(包括干酪乳杆菌)制剂或发酵剂多为固定化制剂，常见包埋壁材和辅料以海藻酸钠、明胶、羟甲基纤维素、β-环糊精、多孔淀粉、果胶、阿拉伯胶和益生元等为主，干燥方法多为冷冻干燥。少量研究设计乳酸菌和酵母菌混合制剂，干酪乳杆菌-酿酒酵母-黑曲霉三元混合菌剂未见报道。此外以琼脂、海藻酸钠、魔芋粉、黄豆粉和硅藻土为载体材料的干酪乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉固定化研究亦未见报道。本发明固定化益生菌发酵剂创新性强，产品技术含量高，应用潜力巨大。

发明内容

本发明的目的是发明一种可多次重复使用、活菌数高、代谢产物丰富且制备方法简单的固定化益生菌发酵剂。由于干酪乳杆菌存在常温烘干死亡率高、连续发酵退化较快等缺点，因此要活的本发明预期的高效固定化益生菌发酵剂，必须采用特殊处理方法对干酪乳杆菌活性进行保护。

本发明利用黑曲霉分解魔芋粉和黄豆粉产生甘露寡糖、氨基酸和小肽的特性，借助黑曲霉份分解作用为酿酒酵母和干酪乳杆菌持续提供营养物质，以保证后二者持续增殖；此外酿酒酵母代谢产物也对干酪乳杆菌增殖具有促进作用，黑曲霉和酿酒酵母对载体内氧的消耗也有助于干酪乳杆菌活性保持。最后载体材料琼脂、海藻酸钠、魔芋粉、黄豆粉和硅藻土的选择具有不可替代性：魔芋粉和黄豆粉经黑曲霉水解为酿酒酵母和干酪乳杆菌增殖提供营养；琼脂、海藻酸钠和硅藻土配合形成高强度和高稳定性载体，缺少琼脂则不能在模具中冷凝成型，缺少海藻酸钠则无法获得高机械强度，缺少硅藻土则干燥后无法复水、不能悬浮于水面、无法形成高机械强度硬质载体。菌剂和载体材料的科学配伍与不可替代性决定了本发明专利具有突出的创新性。

一方面，本发明提供一种固定化益生菌发酵剂，其特征在于：发酵剂干燥过程，干酪乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉活菌数均上升；干燥发酵剂中干酪乳杆菌2.1×10⁸～3.0×10⁹CFU/g，酿酒酵母密度达到1.0×10⁸～1.5×10⁹CFU/g，黑曲霉密度达到1.1×10⁷～5.0×10⁸个孢子/g；发酵剂可重复使用20～50次；干燥前后外形尺寸缩小率小于20％；干燥后后发酵剂能浮于水面，且浸水后30min吸水率达到40～70％；

另一方面，本发明涉及上述固定化益生菌发酵剂的制备方法，包括以下步骤：

第一步，载体材料准备：将一定量琼脂、海藻酸钠、魔芋粉、黄豆粉和硅藻土分散于水中，然后进行高压灭菌，灭菌后趁热混合均匀，即获得载体材料溶液。其中、琼脂0.5～4g、海藻酸钠0.5～4g、魔芋粉0.5～5.0g，黄豆粉1.0～10.0g、硅藻土20.0～50.0g。最适配方为：水100mL、琼脂1.4g、海藻酸钠2.0g、魔芋粉3.2g、黄豆粉6.4g、硅藻土35g。

第二步，向载体材料溶液中添加菌剂和加工成型：将第一步获得的载体材料溶液进行冷却，待温度降低到45℃时，加入干酪乳杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉和黑曲霉菌粉，快速混合均匀并注入模具中于冷凝成型。其中，冷凝环境环境温度为0℃～35℃。菌粉用量为：干酪乳杆菌菌粉0.1～1.0g/100mL水、酿酒酵母菌粉0.1～1.0g/100mL水、黑曲霉菌粉0.1～1.0g/100mL水。

第三步，固定化益生菌发酵剂的固定化：将冷凝成型的发酵剂脱模，并浸入氯化钙溶液中进行二次固化。其中，氯化钙溶液的质量百分比浓度为1.0～5.0％，固化时长为0.5～24h。

第四步，固化成型菌发酵剂的干燥：于20℃～30℃下烘干24～48h，即可获得本发明所述固定化益生菌发酵剂。干燥后较干燥前发酵剂外形尺寸缩小率小于20％。此外，烘干过程同时也是固定化菌剂增殖的过程，发酵剂中的干酪乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉在烘干过程中均会增殖。干燥结束后，发酵剂中各菌的含量为：干酪乳杆菌2.1×10⁸～3.0×10⁹CFU/g，酿酒酵母1.0×10⁸～1.5×10⁹CFU/g，黑曲霉1.1×10⁷～5.0×10⁸个孢子/g。

本发明所有的百分比含量，没有特备指明，都属于质量百分比含量。

本发明所制备固定化益生菌发酵剂可重复使用次数为10～50次，浸于水中30min，吸水率达到40～70％。

有益效果

本发明制备操作简单，易于一体加工成型，干酪乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉协同发酵，产生多种活性物质，发酵剂机械强度高可多次重复使用，在食品、医药和饲料发酵上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明固定化益生菌发酵剂外部形貌和内部菌剂生长情况(以圆盘状和颗粒状发酵剂为例)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

在下列所有实施例子中的菌剂为干酪乳杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉和黑曲霉菌粉所产生。

干酪乳杆菌BFT-1，分类命名：干酪乳杆菌BFT-1，拉丁学名：Lactobacilluscasei BFT-1，保藏号：CCTCC NO：M 2011424，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学。与已授权发明专利：一种包埋干酪乳杆菌的微胶囊及其制备方法(申请号：CN201310626099)中干酪乳杆菌BFT-1为同一菌株。

酿酒酵母菌菌株WY238，分类命名：酿酒酵母菌菌株WY238，拉丁学名：Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen WY238，保藏号：CGMCC No.2013，保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所。与已授权发明专利：用于生产无抗原豆粕的微生物菌剂及其制备方法(申请号：CN200910096861)中酿酒酵母菌WY238为同一菌株。

黑曲霉MA-56，分类命名：黑曲霉MA-59，拉丁学名：Aspergillus nigerMA-56，保藏号：CGMCC No.2722，保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所。与已授权发明专利：一种饲用β－甘露聚糖酶及其制备方法(申请号：CN200910095505)中黑曲霉新菌种MA-56为同一菌株。

在下列实施例子中，以圆盘状固定化益生菌发酵剂为例进行说明，但本发明的保护范围不限于圆盘状1种。

实施例1

步骤1：将0.5g琼脂，0.5g海藻酸钠，0.5g魔芋粉、1.0黄豆粉和20.0g硅藻土分散于100mL水中，于121℃下高压灭菌30min。灭菌结束后趁热混合均匀获得载体材料溶液。

步骤2：将载体混合溶液冷却到45℃，加入干酪乳杆菌菌粉0.1g、酿酒酵母菌粉0.1g和黑曲霉菌粉0.1g，快速混合均匀并倒入直径15cm高3cm的圆皿中，于0℃下冷凝成型获得成型发酵剂。

步骤3：将步骤2获得的成型发酵剂从圆皿中取出，浸入1.0％氯化钙溶液中固化0.5h，即获得固化发酵剂。

步骤4：将步骤3获得的固化发酵剂于20℃下烘干24h，即得本发明所述固定化益生菌发酵剂。

该固定化发酵剂表面为黑曲霉菌丝层，内部为干酪乳杆菌和酿酒酵母，3种菌的菌数分别为干酪乳杆菌密度达到2.1×10⁸CFU/g，酿酒酵母密度达到1.0×10⁸CFU/g，黑曲霉1.1×10⁷个孢子/g；干燥后发酵剂直径较干燥前缩小了19.7％；浸于水中30min，吸水率为40.3％；重复使用10次发酵能力无显著降低。

实施例2

步骤1：将4.0g琼脂，4.0g海藻酸钠，5.0g魔芋粉、10.0黄豆粉和50.0g硅藻土分散于100mL水中，于121℃下高压灭菌30min。灭菌结束后趁热混合均匀获得载体材料溶液。

步骤2：将载体混合溶液冷却到45℃，加入干酪乳杆菌菌粉1.0g、酿酒酵母菌粉1.0g和黑曲霉菌粉1.0g，快速混合均匀并倒入直径15cm高3cm的圆皿中，于35℃下冷凝成型获得成型发酵剂。

步骤3：将步骤2获得的成型发酵剂从圆皿中取出，浸入5.0％氯化钙溶液中固化24h，即获得固化发酵剂。

步骤4：将步骤3获得的固化发酵剂于30℃下烘干48h，即得本发明所述固定化益生菌发酵剂。

该固定化发酵剂表面为黑曲霉菌丝层，内部为干酪乳杆菌和酿酒酵母，3种菌的菌数分别为干酪乳杆菌密度达到3.0×10⁹CFU/g，酿酒酵母密度达到6.5×10⁸CFU/g，黑曲霉2.4×10⁸个孢子/g；干燥后发酵剂直径较干燥前缩小了5.3％；浸于水中30min，吸水率为70.0％；重复使用50次发酵能力无显著降低。

实施例3

步骤1：将2.0g琼脂，2.0g海藻酸钠，2.5g魔芋粉、5.0黄豆粉和35.0g硅藻土分散于100mL水中，于121℃下高压灭菌30min。灭菌结束后趁热混合均匀获得载体材料溶液。

步骤2：将载体混合溶液冷却到45℃，加入干酪乳杆菌菌粉0.5g、酿酒酵母菌粉0.5g和黑曲霉菌粉0.5g，快速混合均匀并倒入直径15cm高3cm的圆皿中，于28℃下冷凝成型获得成型发酵剂。

步骤3：将步骤2获得的成型发酵剂从圆皿中取出，浸入3.0％氯化钙溶液中固化12h，即获得固化发酵剂。

步骤4：将步骤3获得的固化发酵剂于25℃下烘干36h，即得本发明所述固定化益生菌发酵剂。

该固定化发酵剂表面为黑曲霉菌丝层，内部为干酪乳杆菌和酿酒酵母，3种菌的菌数分别为干酪乳杆菌密度达到2.4×10⁹CFU/g，酿酒酵母密度达到3.5×10⁸CFU/g，黑曲霉1.7×10⁸个孢子/g；干燥后发酵剂直径较干燥前缩小了12.8％；浸于水中30min，吸水率为58.3％；重复使用35次发酵能力无显著降低。

实施例4

步骤1：将1.4g琼脂，2.0g海藻酸钠，3.2g魔芋粉、6.4黄豆粉和35.0g硅藻土分散于100mL水中，于121℃下高压灭菌30min。灭菌结束后趁热混合均匀获得载体材料溶液。

步骤2：将载体混合溶液冷却到45℃，加入干酪乳杆菌菌粉0.5g、酿酒酵母菌粉0.2g和黑曲霉菌粉1.0g，快速混合均匀并倒入直径15cm高3cm的圆皿中，于15℃下冷凝成型获得成型发酵剂。

步骤3：将步骤2获得的成型发酵剂从圆皿中取出，浸入2.0％氯化钙溶液中固化8h，即获得固化发酵剂。

步骤4：将步骤3获得的固化发酵剂于25℃下烘干48h，即得本发明所述固定化益生菌发酵剂。

该固定化发酵剂表面为黑曲霉菌丝层，内部为干酪乳杆菌和酿酒酵母，3种菌的菌数分别为干酪乳杆菌密度达到3.5×10⁹CFU/g，酿酒酵母密度达到1.5×10⁹CFU/g，黑曲霉5.0×10⁸个孢子/g；干燥后发酵剂直径较干燥前缩小了8.4％；浸于水中30min，吸水率为61.5％；重复使用50次发酵能力无显著降低。

Claims (5)

1.一种固定化益生菌发酵剂，其特征在于：载体材料由琼脂、海藻酸钠、魔芋粉、黄豆粉和硅藻土构成；发酵剂中的菌剂包括干酪乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉构成的混合菌剂。

2.根据权利要求1所述的固定化益生菌发酵剂，发酵剂物料配方为：水100mL、干酪乳杆菌菌粉0.1～1.0g、酿酒酵母菌粉0.1～1.0g、黑曲霉菌粉0.1～1.0g、琼脂0.5～4.0g、海藻酸钠0.5～4.0g、魔芋粉0.5～5.0g，黄豆粉1.0～10.0g、硅藻土20.0～50.0g。

3.根据权利要求1所述的固定化益生菌发酵剂，发酵剂的外形可以是球型、方形、柱状、条状、线状或饼状等。

4.根据权利要求1所述的固定化益生菌发酵剂，干酪乳杆菌菌粉中干酪乳杆菌活菌数为5.0×10⁹～5.0×10¹⁰CFU/g，酿酒酵母菌粉中酿酒酵母活菌数为2.0×10⁸～2.0×10⁹CFU/g，黑曲霉菌粉中黑曲霉活菌数为2.0×10⁸～2.0×10⁹CFU/g。

5.一种制备固定化益生菌发酵剂的方法，包括以下步骤：

第一步，载体材料准备：将一定量琼脂、海藻酸钠、魔芋粉、黄豆粉和硅藻土分散于水中，然后进行高压灭菌，灭菌后趁热混合均匀，即获得载体材料溶液；其中、琼脂0.5～4g、海藻酸钠0.5～4g、魔芋粉0.5～5.0g，黄豆粉1.0～10.0g、硅藻土20.0～50.0g。最适配方为：水100mL、琼脂1.4g、海藻酸钠2.0g、魔芋粉3.2g、黄豆粉6.4g、硅藻土35g；

第二步，向载体材料溶液中添加菌剂和加工成型：将第一步获得的载体材料溶液进行冷却，待温度降低到45℃时，加入干酪乳杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉和黑曲霉菌粉，快速混合均匀并注入模具中于冷凝成型；其中，冷凝环境环境温度为0℃～35℃；菌粉用量为：干酪乳杆菌菌粉0.1～1.0g/100mL水、酿酒酵母菌粉0.1～1.0g/100mL水、黑曲霉菌粉0.1～1.0g/100mL水；

第三步，固定化益生菌发酵剂的固定化：将冷凝成型的发酵剂脱模，并浸入氯化钙溶液中进行二次固化；其中，氯化钙溶液的质量百分比浓度为1.0～5.0％，固化时长为0.5～24h；

第四步，固化成型菌发酵剂的干燥：于20℃～30℃下烘干24～48h，即可获得本发明所述固定化益生菌发酵剂。