CN104880525B - 用于刑侦目的的液质联用检测尿中唑吡坦中毒标记物苯基-4-羧酸唑吡坦的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开用于刑侦目的的液质联用检测尿中唑吡坦中毒标记物苯基‑4‑羧酸唑吡坦的方法，包括如下步骤：(1)将尿液样品处理后得到待检测液；(2)利用液相色谱‑串联质谱联用仪检测步骤(1)得到的待检测液中的苯基‑4‑羧酸唑吡坦。本发明的检验方法具有灵敏度高、检出限低的优点；并且其操作简单，回收率高，选择性强，可用于尿液中唑吡坦的染毒检验鉴定，从而提高在中毒事件和刑事案件的检验中唑吡坦中毒相关案件的检测。
Description
技术领域
本发明涉及刑侦领域的毒物检测方法，特别涉及用于刑侦目的的液质联用检测尿中唑吡坦中毒标记物苯基-4-羧酸唑吡坦的方法。
背景技术
唑吡坦是第三代催眠药-非苯二氮类催眠药的代表药物之一，商品名思诺思，为咪唑并吡啶类催眠药。随着唑吡坦在临床上的应用增多，法庭科学领域中也出现了相关的案件。由于其吸收快，代谢快，检验时间短，原体不易检测。因此，研究唑吡坦及其代谢产物，明确生物转化规律，对于案件检验和法庭科学等具有重要意义。
唑吡坦化学名为N，N，6-三甲基-2-(4-甲苯基)咪唑并[1，2-a]-吡啶-3-乙酰胺，分子式C19H21N3O，分子量307，结构式如式(Ⅰ)所示。药物推荐的治疗剂量为5～10mg，其口服吸收迅速，具有很高的血浆蛋白结合率(92.5％)，可通过血脑屏障，脑脊液浓度为血浓度的30～50％，其代谢产物无药理活性，只有不到1％的原药从尿中排出。唑吡坦在体内的主要代谢产物为6-羧酸唑吡坦(Zolpidem6-carboxylic acid,ZCA)和苯基-4-羧酸唑吡坦(Zolpidem phenyl-4-carboxylic acid,ZPCA)，结构式分别如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示。
唑吡坦进入体内后，对受体结合部位有高度选择性,服药后产生明显的催眠镇静作用,而副作用和不良反应则小的多。虽然这类药物安全范围较大，但大剂量服用也致中毒。中毒表现为不同程度的嗜睡、头昏、乏力，共济失调，恶心，呕吐，个别表现为兴奋，多语。严重者可引起昏迷，血压下降，休克，呼吸循环抑制，死亡等。单一的新型催眠药毒性较小，口服大量唑吡坦急性中毒死亡的，往往可同时检出其它镇静安眠药或抗抑郁药物或乙醇，因此不能确定此类药物确切的中毒量和致死量数据。
近年来在毒物分析鉴定中出现一些利用唑吡坦实施自杀、麻醉抢劫、麻醉凶杀、麻醉强奸的刑事案件。由于该药起效快消除快的代谢特点，给痕量检测提出了较高的要求。
唑吡坦的消除半衰期很短，仅有0.7～3.5h，因此服用24～48h后很少有机会检出唑吡坦。在麻醉抢劫案件中，尿液是最常用的检材样品之一，由于毒物在尿液中具有更长的检验时间窗口，因此尿液比血液或血清等更具有特殊优势。但是，现有技术中还没有针对尿液中苯基-4-羧酸唑吡坦的检测方法，尤其是没有灵敏度高、检出限低的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种灵敏度高、检出限低的用于刑侦目的的液质联用检测尿中唑吡坦中毒标记物苯基-4-羧酸唑吡坦的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：用于刑侦目的的液质联用检测尿中唑吡坦中毒标记物苯基-4-羧酸唑吡坦的方法，包括如下步骤：
(1)将尿液样品处理后得到待检测液；
(2)利用液相色谱-串联质谱联用仪检测步骤(1)得到的待检测液中的苯基-4-羧酸唑吡坦。
上述方法，在步骤(2)中，液相色谱的色谱柱为：a)色谱柱：Agilent Eclipse PlusC18RRHD柱，2.1mm×100mm，1.7μm；或者b)色谱柱：ACQUITY UPLC HELIC柱，2.1mm×100mm,1.7μm。
上述方法，在步骤(2)中，液相色谱的流动相为如下任意一种组合：
流动相组合一：由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈；
流动相组合二：由A相和B相组成，A相为乙腈的体积分数为0.05％、甲酸的体积分数为0.1％且水的体积分数为99.85％的混合溶液2A；B相为水的体积分数为0.05％、甲酸的体积分数为0.1％且乙腈的体积分数为99.85％的混合溶液2B；
流动相组合三：由A相和B相组成，A相为水的体积分数为95％且甲酸乙腈溶液A的体积分数为5％的混合溶液3A，其中在甲酸乙腈溶液A中甲酸的体积分数为1％，并且混合溶液3A中还加入了乙酸铵浓度为20mmol/L的乙酸铵溶液；B相为水的体积分数为5％且甲酸乙腈溶液B的体积分数为95％的混合溶液3B，其中在甲酸乙腈溶液B中，甲酸的体积分数为1％。
上述方法，在步骤(2)中，液相色谱的流动相梯度洗脱条件为如下三种流动相梯度洗脱条件中的任意一种：
流动相梯度洗脱条件一，以流动相B的比例进行说明：初始体积10％保持0.4min后，2.2min增至50％保持0.3min，2.6min下降至10％并保持2min；
流动相梯度洗脱条件二，以流动相B的比例进行说明：初始体积10％保持0.4min后，1.5min增至90％保持1min，2.6min下降至10％并保持2min；
流动相梯度洗脱条件三，以流动相B的比例进行说明：初始体积10％保持0.5min后，1.5min缓慢增至70％保持1min，2.6min下降至10％并保持2min。
上述方法，在步骤(2)中，液相色谱的进样量为1μL、流速为0.4mL/min。
上述方法，在步骤(2)中，质谱条件为：电喷雾离子源ESI，离子化模式：ESI+；扫描模式：多反应监测MRM；离子源电压：5500V；源温度：550℃；气帘气：30psi，雾化气：60psi，辅助气：55psi，去簇电压:150。
上述方法，在步骤(1)中，尿液样品处理方法如下：取尿液样品，加入乙腈，混匀振荡,离心，取上清液经有机膜过滤,所得滤液即为待检测液。
上述方法，取尿液样品，加入乙腈，混匀振荡,离心，取上清液过有机滤膜，然后再过PLD+去除蛋白和磷脂96孔板，负压抽真空过有机滤膜,所得滤液即为待检测液。
上述方法，在步骤(1)中，尿液样品处理方法如下：取尿液样品，加入乙酸酯类化合物、1,1-二甲基丙酮和二烯丙基醚中任意两种或三种，混匀振荡，静置分层，分离水相和有机相；再向水相中加入乙酸酯类化合物、1,1-二甲基丙酮和二烯丙基醚中的任意两种或三种，再次混匀振荡、静置分层并分离水相和有机相，合并有机相；将合并后的有机相置于浓缩仪上挥发至干，残渣用甲醇定容，用有机滤膜过滤并转移至进样瓶内供检测。
上述方法，所述乙酸酯类化合物为乙酸乙酯或乙酸甲酯
本发明的有益效果是：本发明建立的苯基-4-羧酸唑吡坦的乙腈沉淀蛋白-去磷脂-液相色谱/质谱检验方法，操作简单，检出限低，回收率高，选择性强，可用于尿液中唑吡坦的染毒检验鉴定，从而提高在中毒事件和刑事案件的检验中唑吡坦中毒相关案件的检测。
附图说明
图1为Agilent Eclipse Plus C18柱色谱图。
图2为UPLC HELIC柱的色谱图。
图3为第一种流动相的色谱图。
图4为第二种流动相的色谱图。
图5为第三种流动相的色谱图。
图6为空白的液质MRM图。
图7为3混标的液质MRM图。
具体实施方式
为清楚说明本发明中的方案，下面给出优选的实施例并结合附图详细说明。
实施例1
本实施例用于刑侦目的的液质联用检测尿中唑吡坦中毒标记物苯基-4-羧酸唑吡坦的方法，包括如下步骤：
一、实验试剂、仪器及实验设备
1实验试剂
1.1标准品与试剂
苯基-4-羧酸唑吡坦标准品，含量99wt％，购于加拿大Toronto化学公司；
甲酸、乙腈、醋酸铵、甲醇等均为色谱纯试剂，购自国药集团；
超纯水经Millipore simplicity纯水系统制备。
1.2标准溶液及相关溶剂的配制
标准储备液的配制：精确称取10mg苯基-4-羧酸唑吡坦标准品溶于甲醇中，并定容至刻度，配制成1mg/mL的标准品储备液，4℃冰箱中保存，备用。
标准工作液的配制：取配制好的标准储备液，依次稀释为0.1、0.01、0.001mg/mL系列浓度的工作溶液，于4℃冰箱中保存，备用。
0.1％甲酸水溶液：0.5mL甲酸用超纯水稀释至500mL。
2材料
PLD+去除蛋白和磷脂96孔板：96孔去磷酯板PLD+50mg 96孔板(瑞典Biotage公司)。
空白样品：尿液，采自未服用过药物的健康志愿者。
3仪器及实验设备
API 5500 Q-TRAP MS/MS(Applied Biosystems公司，美国)，配以电喷雾离子源(ESI)，三重四极杆质量分析器。
Shimadzu 30A-LC(Shimadzu公司，日本)，配以Shimadzu 30A自动进样器(Shimadzu公司，日本)。
BP210s电子天平(德国Sartorius公司)；Millipore SimLicity纯水净化系统(法国)；Scientific Industries漩涡振荡器(USA)；SORVALL高速冷冻离心机(德国)；EYELA高速振荡器(日本)。
二、将尿液样品处理后得到待检测液：取尿液0.2mL，加入0.8mL乙腈，混匀振荡10min,8000rpm离心10min，取上清液200μL经有机膜过滤(微孔有机滤膜：0.22μm),所得滤液即为待检测液，将待检测液置于浓缩仪上挥发至干，残渣用甲醇定容，用有机滤膜过滤并转移至进样瓶内供检测。
三、利用液相色谱-串联质谱联用仪检测步骤(二)得到的待检测液中的唑吡坦。
液相色谱的色谱柱为：a)色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD柱，2.1mm×100mm，1.7μm。
液相色谱的流动相为流动相组合一：由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈。
液相色谱的流动相梯度洗脱条件为流动相梯度洗脱条件一，以流动相B的比例进行说明(如表1所示)：初始体积10％保持0.4min后，2.2min增至50％保持0.3min，2.6min下降至10％并保持2min。
表1 梯度洗脱条件一
| 时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A(V％) | 流动相B(V％) |
| 0.1 | 0.4 | 90 | 10 |
| 0.4 | 0.4 | 90 | 10 |
| 2.2 | 0.4 | 50 | 50 |
| 2.5 | 0.4 | 50 | 50 |
| 2.6 | 0.4 | 90 | 10 |
| 4.6 | 0.4 | 90 | 10 |
液相色谱的进样量为1μL、流速为0.4mL/min。
质谱条件为：电喷雾离子源ESI，离子化模式：ESI+；扫描模式：多反应监测MRM；离子源电压：5500V；源温度：550℃；气帘气：30psi，雾化气：60psi，辅助气：55psi，去簇电压:150。检测离子对，碰撞能量见表2。
表2 检测离子对，碰撞能量表
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于，色谱柱为：ACQUITY UPLC HELIC柱，2.1mm×100mm,1.7μm。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于，液相色谱的流动相为流动相组合二：由A相和B相组成，A相为乙腈的体积分数为0.05％、甲酸的体积分数为0.1％且水的体积分数为99.85％的混合溶液2A，B相为水的体积分数为0.05％、甲酸的体积分数为0.1％且乙腈的体积分数为99.85％的混合溶液2B。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于，液相色谱的流动相为流动相组合三：由A相和B相组成，A相为水的体积分数为95％且甲酸乙腈溶液A的体积分数为5％的混合溶液3A，其中在甲酸乙腈溶液A中，甲酸的体积分数为1％，并且每100毫升混合溶液3A中还加入了乙酸铵浓度为20mmol/L的乙酸铵溶液0.5-2毫升；B相为水的体积分数为5％且甲酸乙腈溶液B的体积分数为95％的混合溶液3B，其中在甲酸乙腈溶液B中，甲酸的体积分数为1％。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于，液相色谱的流动相梯度洗脱为流动相梯度洗脱条件二，以流动相B的比例进行说明(如表3所示)：初始体积10％保持0.4min后，1.5min增至90％保持1min，2.6min下降至10％并保持2min。
表3 梯度洗脱条件二
| 时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A(V％) | 流动相B(V％) |
| 0.1 | 0.4 | 90 | 10 |
| 0.4 | 0.4 | 90 | 10 |
| 1.5 | 0.4 | 10 | 90 |
| 2.5 | 0.4 | 10 | 90 |
| 2.6 | 0.4 | 90 | 10 |
| 4.6 | 0.4 | 90 | 10 |
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于，液相色谱的流动相梯度洗脱为流动相梯度洗脱条件三，以流动相B的比例进行说明(如表4所示)：初始体积10％保持0.5min后，1.5min缓慢增至70％保持1min，2.6min下降至10％并保持2min。
表4 梯度洗脱条件三
| 时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A(V％) | 流动相B(V％) |
| 0.1 | 0.4 | 90 | 10 |
| 0.5 | 0.4 | 90 | 10 |
| 1.5 | 0.4 | 30 | 70 |
| 2.5 | 0.4 | 30 | 70 |
| 2.6 | 0.4 | 90 | 10 |
| 4.6 | 0.4 | 90 | 10 |
实施例7
实施例7与实施例1的区别在于，在步骤(1)中，尿液样品处理方法如下：取尿液0.2mL，加入0.8mL乙腈，混匀振荡10min,8000rpm离心10min，取上清液经0.22μm的微孔有机滤膜过滤,然后再过PLD+去除蛋白和磷脂96孔板，再次负压抽真空过0.22μm的有机滤膜，所得滤液即为待检测液，供仪器分析。
实施例8
实施例7与实施例1的区别在于，在步骤(1)中，尿液样品处理方法如下：取5mL尿液样品，加入乙酸甲酯和1,1-二甲基丙酮的混合溶液5mL(乙酸甲酯和1,1-二甲基丙酮的体积比为3:2)，混匀振荡，静置分层，分离水相和有机相；再向水相中加入乙酸甲酯和1,1-二甲基丙酮的混合溶液5mL(乙酸甲酯和1,1-二甲基丙酮的体积比为3:2)，再次混匀振荡、静置分层并分离水相和有机相，合并有机相；将合并后的有机相置于浓缩仪上挥发至干，残渣用甲醇定容，用有机滤膜过滤并转移至进样瓶内供检测。
实施例9
实施例7与实施例1的区别在于，在步骤(1)中，尿液样品处理方法如下：取5mL尿液样品，加入乙酸乙酯和二烯丙基醚的混合溶液5mL(乙酸乙酯和二烯丙基醚体积比为3:2)，混匀振荡，静置分层，分离水相和有机相；再向水相中加入乙酸乙酯和二烯丙基醚的混合溶液5mL(乙酸乙酯和二烯丙基醚体积比为3:2)，再次混匀振荡、静置分层并分离水相和有机相，合并有机相；将合并后的有机相置于浓缩仪上挥发至干，残渣用甲醇定容，用有机滤膜过滤并转移至进样瓶内供检测。
实施例10
实施例7与实施例1的区别在于，在步骤(1)中，尿液样品处理方法如下：取5mL尿液样品，加入乙酸乙酯、1,1-二甲基丙酮和二烯丙基醚的混合溶液5mL(乙酸乙酯、1,1-二甲基丙酮和二烯丙基醚的体积比为1.5:1.5:2)，混匀振荡，静置分层，分离水相和有机相；再向水相中加入乙酸乙酯、1,1-二甲基丙酮和二烯丙基醚的混合溶液5mL(乙酸乙酯、1,1-二甲基丙酮和二烯丙基醚的体积比为1.5:1.5:2)，再次混匀振荡、静置分层并分离水相和有机相，合并有机相；将合并后的有机相置于浓缩仪上挥发至干，残渣用甲醇定容，用有机滤膜过滤并转移至进样瓶内供检测。
实施例1-实施例10的实验结果及对比分析如下：
1、质谱参数的优化选择
精确称取苯基-4-羧酸唑吡坦标准品，用乙腈配制成20ng/mL的单标标准溶液，采用针泵形式直接进样，首先确定目标物母离子的质量数。在此基础上选择强度最大的前3～4个子离子，对碰撞能量进行比较优化，通过逐渐改变碰撞能量，使母离子强度约占最大子离子强度的1/3～1/4。最终选定强度最高的2个子离子，组成两对母/子离子对作为定性分析的指标，以最强离子对作为定量分析指标。在此基础上逐步优化选定的两对母/子离子的去簇电压、碰撞能量、射入电压、碰撞室射出电压等，获得最优的完整的质谱数据。
2液相条件的优化
2.1色谱柱的优化
在液相柱的优化中，实施例1和实施例2比较了Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1mm×100mm,1.7μm)和ACQUITY UPLC HELIC(2.1mm×100mm,1.7μm)柱。前者对于3个目标物的标准品及添加样品的分离、色谱峰峰形均较好(见图1)，但后者HELIC柱呈现出分离不佳,色谱峰拖尾,并对其有较大的基质影响(见图2)。
2.2流动相的优化
在流动相方面，实施例1、实施例3和实施例4比较了流动相组合一、流动相组合二和流动相组合三这三种流动相对分离检测的影响。结果表明，使用这三种流动相的效果均较好(见图3～5),色谱峰峰形良好，但流动相组合二和流动相组合三对6-羧酸唑吡坦的响应较小，流动相组合三中唑吡坦和6-羧酸唑吡坦保留时间较近；流动相组合二中唑吡坦、苯基-4-羧酸唑吡坦和6-羧酸唑吡坦三者的保留时间相差最大。因此，综合以上因素选择简单高效的流动相组合一作为流动相。
2.3梯度的优化
实施例1、实施例5和实施例6比较了不同流动相梯度条件，最终确定流动相梯度洗脱条件一为最佳条件，能够确保目标物分离良好，保留时间稳定(如图3所示)。
2.3专属性
在实施例1选定的仪器条件下，唑吡坦及6-羧酸唑吡坦、苯基-4-羧酸唑吡坦具有良好的色谱峰。在该色谱条件下分析空白尿样无干扰，表明该方法具有较好专属性，色谱峰的峰形及分离良好(图6-7)。
2.4样品处理方法
2.4.1乙腈沉淀蛋白以及过PLD+去除蛋白和磷脂96孔板
PLD+去除蛋白和磷脂96孔板的作用是去磷酯和去蛋白作用，实施例7中在乙腈沉淀蛋白后,再过PLD+去除蛋白和磷脂96孔板。结果显示，过PLD+去除蛋白和磷脂96孔板后的平均回收率比单纯的乙腈沉淀蛋白的平均回收率略好(见表5)，说明乙腈沉淀蛋白后再过PLD+去除蛋白和磷脂96孔板有助于降低生物检材中磷酯等基质对目标物的影响,可提高苯基-4-羧酸唑吡坦回收率。
表5 乙腈沉淀蛋白和过PLD+去除蛋白和磷脂96孔板的平均回收率
2.4.2有机溶剂萃取
乙腈沉淀蛋白以及过PLD+去除蛋白和磷脂96孔板，虽然可以降低生物检材中磷脂等基质对目标物的影响，但是苯基-4-羧酸唑吡坦回收率依旧较低。实施例8-实施例10采用混合有机溶剂萃取的方法，苯基-4-羧酸唑吡坦平均回收率均高于90％，其中实施例10中的平均回收率最高可达97％以上(见表6)。
表6 有机溶剂萃取的平均回收率
2.5标准曲线与灵敏度
将标准储备液用初始流动相稀释成0.10ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL的苯基-4-羧酸唑吡坦系列标准液，仪器进样1μL分析。以标准溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标做标准线性回归,得到回归方程。苯基-4-羧酸唑吡坦系列标准液为：y＝46443x-3615.4；相关系数为R2＝0.9999。标准线性范围为0.1ng/mL～50ng/mL，灵敏度为0.08ng/mL。
2.6工作曲线与检出限
分别取空白尿样品5份、各0.2mL，加入苯基-4-羧酸唑吡坦系列标准液制备成添加尿液样品，使溶液终浓度为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL，50ng/mL，采用实施例7或实施例10中的检验方法，进行仪器分析。以浓度对相应的峰面积进行线性回归，得到回归方程为：y＝40806x-18733；在1ng/mL～50ng/mL线性范围内，相关系数为R2＝0.9983。按信/噪比(S/N)≥3，计算得尿液中检出限为0.1ng/mL。
2.7回收率与精密度
取空白尿样品0.2mL，加入苯基-4-羧酸唑吡坦系列标准液制备成添加尿液样品，使溶液终浓度为1ng/mL、5ng/mL、50ng/mL，每个浓度平行操作5份。采用实施例7中的尿液样品处理方法、色谱条件和质谱条件进行仪器分析。测得的峰面积和对应浓度的标准品峰面积的比率作为回收率，平均回收率为90.8％。
取空白尿样品0.2mL，加入苯基-4-羧酸唑吡坦系列标准液制备成添加尿液样品，使溶液终浓度为1ng/mL、5ng/mL、50ng/mL，每个浓度平行操作5份。采用实施例10中的尿液样品处理方法、色谱条件和质谱条件进行仪器分析。测得的峰面积和对应浓度的标准品峰面积的比率作为回收率，平均回收率为97.7％。
配制高、中、低3种浓度的样品进行检测，采用实施例7或实施例10中的尿液样品处理方法、色谱条件和质谱条件进行检测。每一浓度平行5份，在同一天内3个不同时间进行检测，计算目标物峰面积的相对标准偏差，得到日内精密度,两目标物结果均小于5％。按照同样方法配制3种浓度的样本进行萃取检测，每天测1批，连续测5d，计算目标物峰面积相对标准偏差，得到日间精密度,两目标物结果均小于10％(见表7)。
表7 苯基-4-羧酸唑吡坦的精密度表
通过实施例1-实施例10可以看出：本发明建立的苯基-4-羧酸唑吡坦的乙腈沉淀蛋白-去磷脂或有机溶剂萃取的液相色谱/质谱检验方法，操作简单，检出限低，回收率高，选择性强，可用于尿液中唑吡坦的染毒检验鉴定，从而提高在中毒事件和刑事案件的检验中唑吡坦中毒相关案件的检测。
综上所述，本发明的方法可用于生物样品中苯基-4-羧酸唑吡坦的定性分析和定量分析。定性分析：如果生物样本中出现与苯基-4-羧酸唑吡坦标准工作溶液保留时间相同的色谱峰，进入质谱后也生成与苯基-4-羧酸唑吡坦对应分子量的质谱图，则表明待测目标生物样本中含有苯基-4-羧酸唑吡坦。定量分析：用与绘制标准曲线完全相同的色谱条件作出待测目标生物样本中苯基-4-羧酸唑吡坦的色谱图，测量色谱峰面积和峰高，然后根据峰面积和峰高在标准曲线上直接查出注入色谱柱中待测目标生物样本中苯基-4-羧酸唑吡坦的浓度。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明创造所作的举例，而并非对本发明创造具体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所引伸出的任何显而易见的变化或变动仍处于本发明创造权利要求的保护范围之中。
Claims (7)
1.用于刑侦目的使用液相色谱-串联质谱检测尿中唑吡坦中毒标记物苯基-4-羧酸唑吡坦的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将尿液样品处理后得到待检测液；（2）利用液相色谱-串联质谱联用仪检测步骤（1）得到的待检测液中的苯基-4-羧酸唑吡坦；液相色谱的色谱柱为：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD柱，2.1mm×100mm，1.7µm；液相色谱的流动相由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈；液相色谱的流动相梯度洗脱条件：以流动相B的比例进行说明，初始体积10%保持0.4min后，2.2min增至50%保持0.3min，2.6min下降至10%并保持2min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，液相色谱的进样量为1μL、流速为0.4mL/min。
3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，质谱条件为：电喷雾离子源ESI，离子化模式：ESI+；扫描模式：多反应监测MRM；离子源电压：5500V；源温度：550℃；气帘气：30psi，雾化气：60psi，辅助气：55psi，去簇电压：150。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，尿液样品处理方法如下：取尿液样品，加入乙腈，混匀振荡，离心，取上清液经有机膜过滤，所得滤液即为待检测液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，取尿液样品，加入乙腈，混匀振荡，离心，取上清液过有机滤膜，然后再过ISOLUTE® PLD+去除蛋白和磷脂96孔板，负压抽真空过有机滤膜，所得滤液即为待检测液。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，尿液样品处理方法如下：取尿液样品，加入乙酸酯类化合物、1,1-二甲基丙酮和二烯丙基醚中任意两种或三种，混匀振荡，静置分层，分离水相和有机相；再向水相中加入乙酸酯类化合物、1,1-二甲基丙酮和二烯丙基醚中的任意两种或三种，再次混匀振荡、静置分层并分离水相和有机相，合并有机相；将合并后的有机相置于浓缩仪上挥发至干，残渣用甲醇定容，用有机滤膜过滤并转移至进样瓶内供检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述乙酸酯类化合物为乙酸乙酯或乙酸甲酯。
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