CN104870651B - 包含至少一种烃基(硫代)糖苷的微生物检测介质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物检测介质，所述检测基于选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶促活性的发现，优选地所述微生物酶促活性是酯酶活性，所述介质包含：至少一种发色团底物和/或荧光团底物，其对期望的酶促活性是特异性的，优选地对酯酶活性是特异性的；至少一种烃基(硫代)糖苷；以及至少一种溶剂(S)。

Description

包含至少一种烃基(硫代)糖苷的微生物检测介质
技术领域
本发明涉及通过生化手段、且更特别地通过酶促手段的微生物分析。更特别地，本发明涉及通过接种反应介质检测微生物(例如细菌菌株)，特别地用于表征(鉴定所述微生物、测定后者对至少一种抗微生物剂的潜在的抗性性质等)和/或枚举所述微生物的目的。这些反应介质包括生色底物和/或荧光底物，所述生色底物和/或荧光底物能够与对寻求的微生物是特异性的微生物酶反应。
现有技术
在本发明的框架内，无论在医疗环境还是工业环境中，最特别感兴趣的是：检测病原微生物或质量指标(特别地用于表征和/或枚举其的目的)；并且更特别地检测具有酯酶(特别地包括羧酸酯酶、脂肪酶和磷脂酶活性)、糖苷酶(osidase)、肽酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶类型的酶活性的微生物，例如沙门氏菌(Salmonella)属、埃希氏杆菌(Escherichia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、李斯特菌(Listeria)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、假丝酵母(Candida)属的细菌或酵母；并且更特别地，基于示出酯酶活性的存在/检测酯酶活性来检测沙门氏菌属的细菌。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株经常通过示出糖苷酶类型的酶活性(比如β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶活性)的存在被揭示。
以相同的方式，李斯特菌属通过示出β-葡萄糖苷酶活性的存在被检测。
氨肽酶活性也可以被用于揭示微生物的群、属或种。例如，L-丙氨酸氨肽酶活性使得区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌成为可能。
沙门氏菌属是人类多种严重感染(伤寒热、食物中毒)的原因，其具备能够水解合成的生色底物例如靛原底物的非特异性酯酶。
沙门氏菌-且更通常地酯酶活性细菌-通常在培养肉汤中或在琼脂介质上被检测并且被表征，这使得酯酶活性细菌、特别地沙门氏菌的可疑菌落的检测和表征成为可能。此种介质的接种通过使生物学样品与介质接触来进行。
具有酯酶、糖苷酶、肽酶、硫酸酯酶或甚至磷酸酯酶活性的细菌在它们的酶资产(enzyme asset)上具备酯酶、糖苷酶、肽酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶，这些酶将存在于介质中的合成酶底物的靶标键裂解，并且因此释放所述底物的活化的发色团或荧光团部分。这导致揭示水解、并且因此揭示靶标细菌或靶标细菌的菌落的存在的显色或荧光。
为了能够进行大规模的例行测试，有必要的是，检测和/或表征和/或枚举介质是稳定的并且通过限制操作实例使得可以在最大可能的程度上简化相应的检测和/或表征和/或枚举方法。此外，重要的是，方法提供非常良好的灵敏度(显色或荧光的强度)以及第一流的检测特异性(以便限制或甚至避免“假阳性”的检测)。可疑菌落的揭示率还是用于检测呈现上述酶活性的细菌的这些类型的介质以及方法的基本参数。
已知的是，酶比如酯酶、糖苷酶、肽酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶的合成底物造成与用于微生物且特别地用于具备这些活性的细菌的培养介质之间的相容性问题。此外，随着时间推移此种底物是不稳定的，这导致随着储存时间增加，关注的酶活性的灵敏度减少。
关于这点，标题为“Synthèse de substrats indigogéniques.Mise en évidencede l'activité estérasique des salmonelles”[Synthesis of indigogenicsubstrates.Showing the presence of the esterase activity of salmonellae]的科学论文：A.Agban等人,Eur.J.Med.Chem.(1990)25,697-699，公布了包含靛原底物即特别地溴-5-吲哚酚壬酸酯(C9)以及胆汁盐即脱氧胆酸钠的琼脂培养介质。此种培养介质经受与在下文中参考文献FR-A-2697028阐明的那些相同的缺点。
专利申请FR-A-2697028公开用于示出沙门氏菌的存在的培养介质，所述培养介质包含由辛酸与吲哚残基的酯(5-溴-4-氯-3-吲哚基-辛酸酯)构成的生色酯酶底物、以及选自胆汁盐(脱氧胆酸钠)的清洁剂。此生色和此胆汁盐被包含于允许沙门氏菌生长的营养介质中。根据专利申请FR-A-2697028的教导，直接将胆汁盐添加至其中已经包含酯酶底物的选择性介质。然而，此种培养介质不提供在酯酶底物的稳定性方面的所有合意的保证。此外，证明的是此后者与培养介质不是完全混溶的。这显然损害了获得的关于灵敏度(获得的显色的强度)、快速性和稳定性的结果的质量。还应当注意的是，根据FR-A-2697028的培养介质采取粉末的形式。这迫使使用者进行在先操作以重构液体或胶凝介质。这种限制由利用的酯酶底物的无稳定性造成。
与胆汁盐-比如脱氧胆酸钠-的使用有关的另一个缺点-基于以下事实：后者是动物来源的原材料，在质量方面的可变性程度起源于所述动物来源。
此外，用根据FR-A-2697028的培养介质获得的结果在生物学活性方面是可完成的。
以该申请人的名义的专利EP-B-1334206，描述用于检测/鉴定具有选自酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的酶活性的微生物(以及特别地细菌和/或酵母)的介质。准备好使用且储存稳定的以液体或琼脂形式的此种介质特别地包含：
-酯酶、糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶中的至少一种底物，其是生色的或荧光的，以及
-至少一种脱水山梨糖醇脂肪酸酯(SFAE)或至少一种脂肪酸(FA)或SFAE/FA混合物，作为乳化稳定剂(以某种重量百分比)，
-以及任选地至少一种溶剂(S)。
还根据EP-B-1334206，优选地从包括以下的组中选择SFAE：
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，包含20个环氧乙烷(E.O.)单元，
-20-；
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(20E.O.)，-40-；
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(20E.O.)，-60-；
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬酯酸酯(20E.O.)，-65-；
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(20E.O.)，-80-；
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇倍半油酸酯(20E.O.)，-83-；
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯(20E.O.)，-85-；
以及其混合物。
脱水山梨糖醇脂肪酸酯(SFAE)是在食品和药物制备中广泛使用的已知的表面活性剂。通过例证的方式，我们可以提及由DICKINSON等人的论文：“J Colloid interfaceSci 1999年4月15日；212(2):466-473”，其涉及包含酪蛋白酸钠以及包含20个环氧乙烷(20)单元的聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯的乳液的稳定化。考虑的乳液是水包油乳液(在pH6.8下的30％体积的正十四烷)。
虽然根据EP-B-1334206的反应介质的检测灵敏度是相对满意的，但存在对开发微生物检测介质的需求，所述微生物检测介质基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，并且基于比通过利用现有技术的介质获得的那些且特别地专利EP-B-1334206的那些优越的性能。优越的性能可以被采用以意指提高的检测灵敏度，即用于靶标微生物的菌落的最高可能的显色和/或荧光强度。关于通过示出酯酶活性的存在检测沙门氏菌，这证明是特别地合意的。此外，且除了必备的灵敏度标准以外，还重要的是，上述微生物检测介质是可靠的、特异性的以及可再生的。
本发明的一个目标是开发微生物检测介质(特别地用于表征和/或枚举其的目的)，所述微生物检测介质基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，所述微生物检测介质包括选自酯酶底物和/或糖苷酶底物和/或肽酶底物和/或硫酸酯酶底物和/或磷酸酯酶底物的至少一种酶底物，所述至少一种酶底物是生色的和/或荧光的且所述至少一种酶底物是储存稳定的(揭示的显色或荧光强度被保持在最大水平持续若干周)。
本发明的另一个目标是获得微生物检测介质，所述微生物检测介质基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，所述微生物检测介质不采取待被液体再生以重构液体或胶凝介质的干燥粉末的形式，而是直接地采取准备好使用的形式。
本发明的另一个目标旨在减少使用的生色和/或荧光酶底物(本领域技术人员已知其是特别昂贵的)的量。
本发明的又另一个目标在于开发获得上述检测介质的方法，所述方法易于利用，且所述方法特别地使得可以表征寻求的微生物(特别地经由它们的鉴定和/或它们对至少一种抗微生物剂的潜在的抗性性质的测定)和/或枚举它们而没有过多的困难。
在阅读本申请后，其他目标将变得明显。
发明陈述
本发明旨在满足上述需求，且实现上文提到的目标中的全部或某些。
因此，本发明的第一目标涉及微生物检测介质，所述检测基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，优选地所述微生物酶活性是酯酶活性，所述介质包含：
-至少一种生色底物和/或荧光底物，其对寻求的酶活性是特异性的，优选地对酯酶活性是特异性的；
-至少一种烃基(硫代)糖苷；
-至少一种溶剂(S)。
根据优选的实施方案，当根据本发明的微生物检测介质包含正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为烃基糖苷时，所述介质不包含被包括在由聚磷酸钠类(HMP)、氯化铷(RbCl)和氯化锂(LiCl)构成的组中的化合物。
本发明的另一个目标涉及微生物检测介质，所述检测基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，优选地所述微生物酶活性是酯酶活性，所述介质主要由以下组成：
-至少一种生色底物和/或荧光底物，其对寻求的酶活性是特异性的，优选地对酯酶活性是特异性的；
-至少一种烃基(硫代)糖苷；
-至少一种溶剂(S)，以及任选地适合用于允许寻求的微生物(靶标微生物)生长的培养介质。
本发明的另一个目标还是微生物检测介质，所述检测基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，优选地所述微生物酶活性是酯酶活性，所述介质由以下组成：
-至少一种生色底物和/或荧光底物，其对寻求的酶活性是特异性的，优选地对酯酶活性是特异性的，
-至少一种烃基(硫代)糖苷；
-至少一种溶剂(S)；
-适合用于允许寻求的微生物(靶标微生物)生长的培养介质。
在实践中，本领域技术人员应当取决于靶标微生物(且特别地取决于靶标细菌)、根据本领域技术人员完全已知的且在本领域技术人员所能及的范围内的标准选择培养介质。此培养介质不包含被包括在由聚磷酸钠类(HMP)、氯化铷(RbCl)和氯化锂(LiCl)构成的组中的化合物。
依据本发明，术语烃基(硫代)糖苷必须被理解为能够指定烃基糖苷类型的化合物(即其中烃基部分经由醚键-O-与碳水化合物残基结合)、或烃基硫代糖苷类型的化合物(即其中烃基部分经由硫醚键-S-与碳水化合物残基结合)，这是词根“硫代”出现在此术语的括号内的原因。
所述烃基部分通常是脂肪族的、直链或支链的、饱和或不饱和的。在本发明的意义上，“脂肪族的”烃基部分可以被理解为意指直链的或打开的支链的(无环的)部分。根据优选的实施方案，烃基(硫代)糖苷化合物的烃基部分是直链的(非支链的)，有利地是饱和的、脂肪族的基团。
碳水化合物残基，就其本身，可以是单糖(simple sugar)(单糖(monosaccharide))或糖苷(糖)残基。因此，依据本发明，术语烃基(硫代)糖苷包括能够被单独使用或任选地与其他表面活性剂比如一种或更多种阴离子型表面活性剂联合使用的烃基(硫代)糖苷和烃基(硫代)多糖苷两者。
这些烃基(硫代)糖苷是通常被用于大范围的工业应用且特别地被用于清洁剂或化妆品的非离子型表面活性剂。
没有被以下理论所束缚，但用于本发明的目的的烃基(硫代)糖苷似乎充当稳定-乳化剂。根据一个特定的实施方案，所述烃基(硫代)糖苷可以与至少一种协同助剂(co-agent)、优选地至少一种阴离子型表面活性剂、优选地7-乙基-2-甲基-4-十一烷基硫酸氢酯或其盐中的至少一种、且更特别地其钠盐(TERGITOL-)连接。
获得根据本发明的烃基(硫代)糖苷的不同方法对于本领域技术人员是熟知的。因此，如期望的，他/她能够在市场上获得烃基(硫代)糖苷或通过利用他的/她的一般知识或基于关于此主题的现有的出版物来合成烃基(硫代)糖苷。
有利地，至少一种烃基糖苷被用作烃基(硫代)糖苷。
根据本发明的“检测介质”必须被理解为能够由以下组成：
-介质，其使得检测/揭示微生物、特别是寻求的微生物(靶标微生物)的存在或不存在成为可能，和/或
-介质，其使得表征所述微生物即特别地鉴定和/或测定微生物对至少一种抗微生物剂(在细菌的情况下是抗菌剂)的潜在的抗性性质成为可能，和/或
-介质，其使得枚举所述微生物成为可能；此枚举在于通过利用本领域技术人员熟知的微生物学技术来对已经在根据本发明的反应介质上生长的微生物菌落的数目计数。
因此，本发明还涉及微生物表征(例如鉴定)和/或枚举介质，所述表征和/或所述枚举基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，优选地所述微生物酶活性是酯酶活性，所述介质包含：
-至少一种生色底物和/或荧光底物，其对寻求的酶活性是特异性的，优选地对酯酶活性是特异性的；
-至少一种烃基(硫代)糖苷，优选地至少一种烃基糖苷；以及
-至少一种溶剂(S)。
根据优选的实施方案，其存在被示出的(被寻求的)酶活性是羧酸酯水解酶类型的酯酶活性，比如羧酸酯酶、脂肪酶或磷脂酶活性。
通过使用根据本发明的培养介质检测的微生物优选地是细菌和/或酵母，有利地是细菌。
根据特别优选的实施方案，根据本发明的反应介质被用于检测具有酯酶活性的微生物(比如细菌和/或酵母)、优选地具有酯酶活性的细菌比如沙门氏菌(例如用于表征和/或枚举其的目的)。正如本领域技术人员所已知，酯酶活性在微生物学领域是非常普遍的。实际上，已知大量细菌具备酯酶活性且因此能够裂解对此种酶活性特异性的合成的(生色的和/或荧光的)底物。除了先前提到的沙门氏菌以外，还可提及属于假单胞菌属、不动杆菌属、李斯特菌属等的细菌。
上述微生物的检测在于，经由已经出现在液体介质中或出现在由这些微生物在琼脂介质上形成的菌落上的显色和/或荧光的目测或光学检测，来揭示(目测)其在培养介质中/上的存在。在光学检测的情况下，此后者可以通过在比如照相机的装置的帮助下光学读取所有或部分的所述介质来进行。通过光学读数检测显色和/或荧光使得能够使相应的检测方法部分或全部自动化。
荧光酶底物可以具有不同的性质。首先，基于伞形酮或氨基香豆素以及其在3、4或6位被取代的衍生物的底物，使得释放在紫外(UV)灯(λex＝365nm)下颜色从蓝到绿变化的荧光化合物成为可能。
还存在导致在自然光(λex＝530nm)下粉色的荧光化合物的释放的、基于试卤灵(resorufin)(以及其衍生物)的底物。
还可提及在降解后释放在自然光(λex＝485nm)下黄色的荧光化合物的、基于荧光素(以及其衍生物)的底物。
这些荧光酶底物通常不是很适合用于琼脂介质，且优选地被用于液体介质。
依据本发明的可用的生色酶底物可以具有不同的性质。
首先，应当提到基于吲哚酚以及其衍生物的底物，所述底物在氧气的存在下产生从蓝色到粉色变化的沉淀物以及ALDOLTM(BIOSYNTH AG)的衍生物-其在国际申请WO 2010/128120中被提到-其产生从黄色到红色变化的有色沉淀物(包括在氧气不存在的情况下)。依据本发明，基于吲哚酚以及其衍生物的这些底物是特别优选的，由于它们的相对容易的利用以及它们的良好的检测灵敏度。它们的应用主要涉及糖苷酶、酯酶和磷酸酯酶类型的酶活性。由于非常适合于在固体或半固体载体(过滤器、琼脂、电泳凝胶等)上使用，因此它们较少用于液体介质中(形成沉淀物)。
第二，存在在铁盐的存在下产生有色沉淀物的基于羟基喹啉、二羟基黄酮、二羟基蒽醌、邻苯二酚或七叶亭(esculetin)以及其衍生物的酶底物。同样，它们的应用主要涉及糖苷酶和酯酶类型的酶活性。
第三，可以提到导致形成黄色化合物的基于硝基苯酚和硝基苯胺以及其衍生物的酶底物。它们使得可以在基于硝基苯酚的底物的情况下检测糖苷酶和酯酶活性，并且在基于硝基苯胺的底物的情况下检测肽酶活性。然而，在检测肽酶活性的情况下，释放的硝基苯胺对期望被鉴定或表征的细菌是有毒的，这可以证明对进行的或随后的分析是有害的。此外，它们通常不适合用于固体载体上，且较好地适合用于液体介质中。
第四，存在基于萘酚和萘胺以及其衍生物的酶底物。在这种情况下，酶-底物反应以两个步骤发生，通过酶活性释放的萘酚和萘胺在重氮盐的存在下经历“偶氮偶合(azo-coupling)”，其在揭示之后被添加，导致形成不溶的有色化合物。它们使得可以借助于萘酚检测糖苷酶和酯酶活性，且借助于萘胺检测肽酶活性。“偶氮偶合”反应发生在对细菌经常是化学地攻击的、有毒的并且使得样品不可用于其他分析的介质中，此外，萘胺是致癌的。
依据本发明，已经在根据本发明的检测介质上或中生长的微生物被检测和/或枚举-目测或经由照相机或摄影设备类型的光学和电子装置-经由有色和/或荧光反应的出现(根据是否使用生色的或荧光的底物)或同时展示两种特性，所述有色的和/或荧光的反应通过靶向微生物酶活性产生。
更特别地涉及酯酶的酶底物，根据优选的实施方案，后者包含2至16个碳原子，具有界定被意图的应用的链长度。因此，C2或C4底物的用途适合用于检测“通用底物”病菌的最大值。对于更特定的应用，比如特别地沙门氏菌的检测，C7-C10底物是特别适合的。在能够被结合到C2-C12的碳链的生色中，可提及例如基于吲哚酚的底物，比如5-溴-4-氯-3-吲哚酚、5-溴-6-氯-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚、5-溴-3-吲哚酚、5-碘-3-吲哚酚、6-溴-3-吲哚酚及5,6-二溴-3-吲哚酚；基于二羟基蒽醌的底物，比如茜素(alizarin)；基于ALDOLTM的底物(由Biosynth AG,Rietlisstrasse 4,9422Staad,Switzerland开发，特别地在国际专利申请2010/128120中提到)；荧光团是例如4-甲基伞形酮以及7-羟基香豆素的其他衍生物。
此种酯酶的酶底物可以是例如吲哚酚衍生的生色酯底物，以及特别地5-溴-4-氯-3-吲哚酚辛酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚酚辛酸酯、5-溴-3-吲哚酚壬酸酯、6-氯-3-吲哚酚壬酸酯或5-溴-3-吲哚酚癸酸酯。在这点上，还应当提到蒽醌衍生的生色酯酶底物，比如2-茜素辛酸酯。
在任何情况下，这些生色的和/或荧光的合成底物对于本领域技术人员是熟知的，他们将知道取决于寻求的酶活性或多种酶活性来选择待使用的酶底物。
根据本发明的优选的实施方案，烃基(硫代)糖苷对应于通式(I)：
R-X-(G)n(I)
其中：
-R代表直链或支链的、饱和或不饱和的脂肪族基团，优选地是直链的，有利地是直链且饱和的，含有2至12个碳原子、优选地6至12个碳原子、且优选地8至12个碳原子；
-X是-O-或-S-，优选地是-O-；
-G代表碳水化合物残基；
-n是在1和10之间、优选地在1和3之间的整数，有利地n是整数1或2。
根据本发明的烃基(硫代)糖苷的此定义使得获得期望的检测灵敏度水平成为可能，即使得从使用的生色和/或荧光酶底物获得非常良好的显色和/或荧光强度成为可能。没有被理论所束缚，可能的是，这种/这些烃基(硫代)糖苷-特别地通式(I)的那些-改进靶向酶表达的检测，即微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性。
根据本发明的检测介质可以包含优选地对应于上文提到的通式(I)的一种烃基(硫代)糖苷或多种烃基(硫代)糖苷(即至少两种烃基(硫代)糖苷)。当检测介质包含至少两种烃基(硫代)糖苷时，后者可以是相同的或不同的，全部优选地对应于所述通式(I)。
依据本发明，优选的烃基(硫代)糖苷是以下的烃基糖苷：正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(后者是特别优选的)。
根据本发明的微生物检测介质能够通过在溶剂(S)中混合对寻求的酶活性是特异性的(优选地对酯酶活性是特异性的)至少一种生色底物和/或荧光底物与比如先前定义的至少一种烃基(硫代)糖苷来获得。
相当明显地且特别地关于在本申请的前文中提到的问题，根据本发明的微生物检测介质呈准备好使用的形式(液体或琼脂)且是储存稳定的，这意指显色和/或荧光强度被保持稳定持续至少若干周，有利地持续至少三周。
优选地，取决于使用的烃基(硫代)糖苷或多种烃基(硫代)糖苷，烃基(硫代)糖苷在介质中的浓度在0.5g/L和8g/L之间，优选地在0.5g/L和6g/L之间。
溶剂(S)是用于溶解感兴趣的生色和/或荧光酶底物、特别地关于生色酶底物的助剂。其还补充充当稳定-乳化剂的烃基(硫代)糖苷的作用。
根据本发明的有利的实施方案，溶剂(S)选自包括以下的组：
-醇，优选地甲醇、乙醇、甲氧基乙醇，
-极性非质子溶剂，优选地二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)，
-含水溶剂，优选地水或缓冲水，
-以及其混合物；
优选地所述溶剂(S)是二甲基亚砜(DMSO)。
在实践中，优选地使用的溶剂是甲醇或极性非质子溶剂，优选地DMF和DMSO(优选地DMSO)。特别地，当使用酯酶底物时，后者被溶于DMSO类型的有机溶剂中，向其中添加感兴趣的烃基(硫代)糖苷。
关于生色底物和/或荧光底物，后者包含：对其存在将被示出的酶是特异性的靶标部分，优选地对酯酶活性是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
根据优选的实施方案，酶底物是由待检测的酶的靶标部分和发色团或荧光团部分构成的生色底物或荧光底物，优选地，靶标选自特别地包括以下的组：
-糖苷，其由单糖、二糖和/或多糖单元构成，与荧光团或发色团部分的羟基官能α-或β-结合；
-α-氨基酸或肽；
-有机酸，比如-O-CO(CH2)n-CH3，其中n在0和20之间；
-无机酸，比如硫酸盐、磷酸盐、焦硫酸盐或磷酸二酯。
-醌类/蒽醌类以及衍生物，特别地二羟基蒽醌(茜素)；
-氨基香豆素或羟基香豆素以及衍生物；
-荧光素以及衍生物；
-吲哚酚或ALDOLTM以及衍生物；
-氨基苯酚以及衍生物；
-硝基苯酚以及衍生物；
-氨基苯基或羟基苯基以及衍生物；
-吩噁嗪酮以及衍生物；
-邻苯二酚以及衍生物；
-喹唑啉酮以及衍生物(包括97)；
-二羟基黄酮以及衍生物；
-3-羟基黄酮(3-HF)以及衍生物；
-七叶亭以及衍生物。
优选地，酶底物是基于吲哚酚或基于其衍生物中的一种的底物。在这种情况下，本发明还涉及适用于在绝氧和/或微量需氧的条件(在反应介质中的分子氧浓度低于大气浓度)下使用的检测介质，所述介质包含促进吲哚酚衍生物的氧化聚合的试剂，比如柠檬酸铁铵络合物。
高锰酸钾、铁氰酸盐/铁氰化物也可以被提及作为“促进吲哚酚衍生物的氧化聚合的试剂”。
促进吲哚酚衍生物的氧化聚合的试剂(例如柠檬酸铁铵类型的金属络合物)优选地以在大约0.1mg/ml和大约2mg/ml之间(优选地约0.6mg/ml)的浓度使用。
在根据本发明的反应介质中酶底物必须被使用的浓度可以由本领域技术人员基于他的/她的一般知识并且从例行测试(在适用的情况下)容易地测定。此浓度必须足以实现需要的检测灵敏度水平，但不能太大以便不冒抑制微生物的生长的风险。
举例来说，生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间、优选地在5mg/L和6g/L之间、有利地在25mg/L和2g/L之间。
有利地，根据本发明的反应介质包含适合的培养介质，比如在“Handbook ofculture media”(CRC Press)中描述的介质，优选地所述培养介质选自：
-麦康凯(MacConkey)、Hektoen选择性介质、被意图用于选择性地检测沙门氏菌的沙门氏菌的选择性生色介质、哥伦比亚ANC(Columbia ANC)、PALCAM、沙保弱(Sabouraud)庆大霉素-氯霉素类型，优选麦康凯介质或被意图用于选择性地检测沙门氏菌类型的沙门氏菌的选择性生色介质，
-哥伦比亚+/-血液、胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂(TSA)、营养琼脂、沙保弱类型的非选择性介质，优选哥伦比亚介质。
在实践中，本领域技术人员应当取决于靶标微生物(且特别地取决于靶标细菌)、根据本领域技术人员完全已知的且在本领域技术人员力所能及的范围内的标准选择培养介质。
在以任何方式都不是限制性的情况下，显现的是根据本发明的介质特别地适合用于检测医学或工业兴趣的微生物(特别地用于表征和/或枚举的目的)，以及特别地革兰氏阴性细菌，更特别地沙门氏菌属和假单胞菌属中的那些。
如整个本申请所指示，主要目标中的一个是开发使得检测具备酯酶活性(特别地用于表征和/或枚举的目的)的微生物(以及特别地细菌)比如沙门氏菌属、假单胞菌属、不动杆菌属等的细菌成为可能的介质。
关于沙门氏菌的检测，例如，麦康凯介质、Hektoen介质或沙门氏菌介质，应当被选作培养介质。
此外，介质可以潜在地含有其他添加剂，比如，例如：一种或更多种其他酶底物，其是例如生色和/或荧光的蛋白胨；一种或更多种生长因子；碳水化合物；一种或更多种选择性试剂；缓冲液；一种或更多种胶凝试剂等。
根据本发明的反应介质采取准备好使用的形式，优选地液体或凝胶形式。准备好使用的形式可以被理解为意指准备好在管、烧瓶中或在培养皿上接种的形式。
根据本发明的反应介质的优点中的一个是，其能够在4℃下以液体或凝胶的形式储存持续若干周。
本发明的另一个目标涉及获得根据本发明的介质的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在溶剂(S)中制备具有至少一种生色底物和/或荧光底物(比如上文定义的)以及至少一种烃基(硫代)糖苷的至少一种储备溶液，
b)任选地将至少一种添加剂添加至所述介质中，以及
c)使全部均质化。
关于上述步骤a)应当注意的是，可以在相同步骤期间将所述底物和所述至少一种烃基(硫代)糖苷添加至溶剂(S)中，或根据替代方案，将所述底物在第一阶段中引入溶剂(S)中，且然后将所述至少一种烃基(硫代)糖苷用先前获得的溶液(包含被所述溶剂(S)溶解的所述底物)摄取。
有利地，通过相继地并入酶底物、溶剂(S)以及比如先前定义的至少一种烃基(硫代)糖苷(可能地同时添加)单独地制备储备溶液。使用的产品和量如先前所定义。在均质化之后，将储备溶液添加至被过冷并且先前在水中被再生的胶凝培养介质。其还可以是非胶凝的液体介质，比如例如营养肉汤。
在将培养介质和储备溶液混合之后，获得准备好被接种的液体或胶凝检测介质。
本发明的目标还是根据本发明的介质用于检测具有酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物(显著地用于表征和/或枚举的目的)、优选地用于检测具有酯酶活性的微生物比如沙门氏菌属的细菌的用途。
根据本发明的检测介质可以被用于：
-检测/揭示微生物特别是寻求的微生物(靶标微生物)的存在或不存在，和/或
-表征所述微生物，即特别地鉴定和/或测定它们对至少一种抗微生物剂(在细菌的情况下是抗菌剂)的潜在的抗性性质，和/或
-枚举所述微生物。
本发明的另一个目标涉及用于样品中的具有酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物、优选地具有酯酶活性的微生物的检测介质，所述方法包括以下步骤：
i)用待分析的样品接种根据本发明(如上文定义)的介质，
ii)在适当的条件下(例如在有氧条件中在37℃下)温育接种的介质，
iii)检测并解释在由微生物形成的菌落处的显色和/或荧光，所述显色和/或荧光揭示至少一种生色底物和/或荧光底物与对其是特异性的微生物酶活性之间的反应，有利地，所述酶活性是酯酶活性。
例如，可以利用所述方法以便揭示所述微生物在所述样品内存在或不存在，和/或以便表征它们(例如鉴定它们)和/或枚举它们。
本发明还涉及至少一种烃基(硫代)糖苷用于改进选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的酶活性的检测的用途，优选地所述酶活性是酯酶活性。
待分析的样品可以来自多种来源，例如食品、环境、兽医或临床来源。
在食品来源的样品中，可以非详尽无遗地提到乳制品(酸乳、奶酪等)、肉类、鱼类、蛋类、水果、蔬菜、水、饮料(牛奶、果汁、苏打水等)的样品。当然，这些食品来源的样品还可以来自沙司或更复杂的膳食，或来自未加工的(或部分加工的)原材料。食品样品可以最终来自动物饲料，比如油渣饼、动物膳食。
作为环境样品的实例，还应当提到表面、水、空气等的样本。
临床来源的生物学样品可以对应于生物学流体(全血、血清、血浆、尿、脑脊髓流体等)样本、粪便样本、来自鼻、喉、皮肤、伤口、器官、组织或分离细胞的样本。此清单明显地不是详尽无遗的。
通常地，术语“样品”指的是从用于分析目的的一种或更多种实体取样的部分或量(更特别地小部分或小量)。可能地，此样品可以已经经历预处理，包括例如混合、稀释或甚至压碎的步骤，特别地在起始实体是固态的情况下。
通常地，分析的生物学样品能够-或被怀疑-含有至少一种靶标微生物。在大多数情况下，后者是为了健康的目的应当被检测的病原微生物(比如沙门氏菌)。
术语“微生物”具有与微生物学中通常可接受的那种相同的含义，且显著地包括革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌、以及更通常地肉眼不可见的单细胞有机体(其可以在实验室中操作和繁殖)。
用于本发明的目的的烃基(硫代)糖苷如先前所定义。优选地对应于上文提到的通式(I)的一种烃基(硫代)糖苷或多种烃基(硫代)糖苷(即至少两种烃基(硫代)糖苷)被使用。当至少两种烃基(硫代)糖苷被使用时，后者可以是完全相同的或不同的，全部都优选地对应于所述通式(I)。
详细描述
实施例1：用于检测沙门氏菌-改进检测灵敏度的介质
1.1介质的制备-酶底物的溶解
在DMSO类型的溶剂中制成酶底物5-溴-6-氯-3-吲哚酚辛酸酯(洋红-C8)的储备溶液。然后将使得可以获得360mg/L的最终底物浓度的某个体积的此储备溶液添加至分别含有吐温20(最终浓度6g/L)、0.7、2及6g/L的最终浓度的正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)以及相同浓度的正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DM)的烧瓶中。搅动不同溶液，且将体积引入到过冷的琼脂介质(沙门氏菌介质)中。下文的表1中呈现此方案：
表1
选择6g/L的最终的吐温20浓度，因为其在溶解/微生物学活性的情况下是最佳的。
1.2介质的制备
根据来自被校准至0.5McF的细菌悬浮液的三刻度盘(three-dial)技术，将来自申请人的收集物的沙门氏菌属的微生物接种于上述介质中的每种上。由于菌株的酯酶活性的低至平均表达而选择菌株，这在bioMérieux销售的沙门氏菌介质(以参考文献43621和43629)上给出低至平均紫色的显色强度。
平皿在37℃下温育24h。然后在温育24h之后目测检查形成的菌落。记录显色强度。下文的表2中提出结果。
表2
显色强度：标度从0到4，分别为无显色到高度强烈的显色；
0＝无显色
0.1＝痕量显色
0.5＝非常淡的显色
1＝明显的低强度显色
2＝清晰的中等强度显色
3＝强烈的显色
4＝高度强烈的显色
NB：n.5(例如1.5、2.5、3.5)对应于中间的显色强度。
1.3结论
对于所有的菌株，介质2(OG 2g/L)、3(OG 6g/L)、4(DM 0.7g/L)、5(DM2g/L)和6(DM6g/L)使得获得比对照介质T(吐温20，6g/L)更高的显色强度成为可能。介质1(OG 0.7g/L)、2(OG 2g/L)、3(OG 6g/L)、4(DM 0.7g/L)和5(DM 2g/L)使得检测所有测试的沙门氏菌(包括都柏林沙门氏菌(S.dublin))成为可能。提供最佳性能的介质是介质2(OG 2g/L)、3(OG 6g/L)、4(DM 0.7g/L)和5(DM 2g/L)。
因此，OG和DM使得似乎经由改进此酶表达来改进沙门氏菌中的酯酶活性检测灵敏度成为可能。此外，这些烃基糖苷还使得检测所有测试的沙门氏菌菌株(包括都柏林沙门氏菌)成为可能。
实施例2：经由C9酯酶活性的表达检测铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和鲍氏不动 杆菌(A.baumannii)
2.1介质的制备-酶底物的溶解
在DMSO类型的有机溶剂中制成ALDOLTM 470-壬酸酯(ALDOL470-C9，由BiosynthAG,Rietlisstrasse 4,9422Staad,Switzerland开发)和ALDOLTM 495-壬酸酯(ALDOL 495-C9，也由Biosynth AG,Rietlisstrasse4,9422Staad,Switzerland开发)的25g/L的两种储备溶液。然后将对应于200mg/L的酶底物的最终浓度的体积添加至分别含有以下的烧瓶中：吐温20(6g/L的在介质中的最终浓度)，以及DM(0.7、2及6g/L的最终浓度)。剧烈地搅动不同的烧瓶，然后将所有的内容物添加至过冷的琼脂介质：TSA(胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂)基底中。
下文的表3中呈现不同介质的组成：
表3
2.2生物学活性
根据来自被校准至0.5McF的细菌悬浮液的三刻度盘技术，将来自申请人的收集物的细菌接种于上述介质中的每种上。平血在37℃下温育24h，且目测分析形成的菌落。因此，记录显色和显色强度。下文的表4中阐明结果。
表4
显色强度：标度从0到4，分别为无显色到高度强烈的显色；
0＝无显色
0.1＝痕量显色
0.5＝非常淡的显色
1＝明显的低强度显色
2＝清晰的平均强度显色
3＝强烈的显色
4＝高度强烈的显色
NB：n.5(例如1.5、2.5、3.5)对应于中间的显色强度。
2.3结论
铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌是被认为是酯酶阳性的细菌。对照介质1和5没有使得反映此特性成为可能。实际上，对于大多数测试的菌株-在基于这2种ALDOLTM的酶底物(含有吐温20作为表面活性剂)的情况下，显色强度是低的(0.5)或零。
通过相同浓度的DM替换6g/L的吐温20出乎意料地使得改进酯酶活性的表达成为可能。实际上，此代替使得检测所有测试的菌株成为可能，无论哪种测试的酶底物都具有合适的显色强度。当底物基于ALDOLTM时，注意到DM对酯酶活性的表达的非常强烈的影响。
通过正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DM)代替吐温20，改进微生物的酯酶活性的检测，这似乎是由于酯酶底物的较好的生物学活性，这通过靶标微生物的较强烈的显色而被显示。
根据本发明的烃基糖苷提供改进的检测灵敏度，且甚至使得在吐温的存在下检测某些无色菌株成为可能。
此外，因为显色或荧光强度是较高的(由于所述烃基糖苷)，因此可以减少酶底物浓度，这代表在经济方面的优点。
实施例3：用于经由使用具有16个碳原子的酯酶(脂肪酶)底物来检测沙门氏菌-改 进检测灵敏度的介质
3.1介质的制备-酶底物的溶解
在DMSO类型的溶剂中制成酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚酚棕榈酸酯(X-C16)的储备溶液。然后将使得可以获得100mg/L的最终底物浓度的某个体积的此储备溶液添加至分别含有以下的烧瓶中：吐温20(按体积计0.1％、0.2％及0.6％的最终浓度)、2g/L的最终浓度的正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)、OG(2g/L)与吐温20的混合物(0.1％体积)、以及2g/L的在介质中的最终浓度的正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷(OTG)。搅动不同溶液，且将体积引入到过冷的琼脂介质(沙门氏菌介质)中。下文的表5中给出多种介质的组成的总结。
表5
3.2介质的接种
根据来自被校准至0.5McF的细菌悬浮液的三刻度盘技术，将来自申请人的收集物的沙门氏菌属的微生物接种于上述介质中的每种上。由于菌株的酯酶活性的不同的表达水平而选择菌株。对应于来自大肠杆菌(E.coli)的收集物ATCC 25922的菌株的菌株充当用于此种酶活性的表达的阴性对照。
平皿在37℃下温育24h。然后在温育24h之后目测检查形成的菌落。记录显色强度。下文的表6中提出结果。
表6
显色强度：标度从0到4，分别为无显色到高度强烈的显色；
0＝无显色
0.1＝痕量显色
0.5＝非常淡的显色
1＝明显的低强度显色
2＝清晰的中等强度显色
3＝强烈的显色
4＝高度强烈的显色
注意：表示为n.5(例如1.5和2.5)的强度代表中间强度。
3.3结论
介质3、4和5使得获得比对照介质(介质1)更高的显色强度成为可能，所述对照介质既不包含OG，也不包含OTG。
还注意到，含有单独的或以与吐温20的混合物的OG的介质(特别地尤其是当OG如在介质3中被单独使用时)，使得获得最佳性能成为可能：在这些介质上的100％的检测灵敏度，以及对于包括都柏林沙门氏菌的所有菌株的高显色强度。
酯酶阴性的大肠杆菌菌株不表现出阳性，这指示检测的特异性被保持。

Claims (123)

1.一种微生物检测介质，所述检测基于示出微生物酯酶活性的存在，所述介质包含：
-至少一种生色底物和/或荧光底物，其对寻求的酯酶活性是特异性的；
-至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷；
-至少一种溶剂(S)；
其中当所述检测介质包含正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为烃基糖苷时，所述介质不包含被包括在由聚磷酸钠类(HMP)、氯化铷(RbCl)和氯化锂(LiCl)构成的组中的化合物，
其中所述介质中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷的浓度在0.5g/L和8g/L之间，并且其中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷对应于通式(I)：
R-X-(G)n (I)
其中：
-R代表直链或支链的、饱和或不饱和的含有6至12个碳原子的脂肪族基团；
-X是-O-或-S-；
-G代表碳水化合物残基；
-n是在1和10之间的整数。
2.根据权利要求1所述的介质，其中R代表直链的脂肪族基团。
3.根据权利要求1所述的介质，其中R代表直链且饱和的脂肪族基团。
4.根据权利要求1所述的介质，其中R代表含有8至12个碳原子的脂肪族基团。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的介质，其中X是-O-。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的介质，其中n是1和3之间的整数。
7.根据权利要求5所述的介质，其中n是1和3之间的整数。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的介质，其中n是1或2。
9.根据权利要求5所述的介质，其中n是1或2。
10.根据权利要求1-4、7和9中任一项所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷是选自正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的烃基糖苷。
11.根据权利要求5所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷是选自正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的烃基糖苷。
12.根据权利要求6所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷是选自正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的烃基糖苷。
13.根据权利要求8所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷是选自正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的烃基糖苷。
14.根据权利要求10所述的介质，其中所述烃基糖苷是正十二烷基-β-D-麦芽糖苷。
15.根据权利要求11-13中任一项所述的介质，其中所述烃基糖苷是正十二烷基-β-D-麦芽糖苷。
16.根据权利要求1-4、7、9和11-14中任一项所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷在所述介质中的浓度在0.5g/L和6g/L之间。
17.根据权利要求5所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷在所述介质中的浓度在0.5g/L和6g/L之间。
18.根据权利要求6所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷在所述介质中的浓度在0.5g/L和6g/L之间。
19.根据权利要求8所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷在所述介质中的浓度在0.5g/L和6g/L之间。
20.根据权利要求10所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷在所述介质中的浓度在0.5g/L和6g/L之间。
21.根据权利要求15所述的介质，其中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷在所述介质中的浓度在0.5g/L和6g/L之间。
22.根据权利要求1-4、7、9、11-14和17-21中的一项所述的介质，其中所述溶剂(S)选自包括以下的组：
-醇，
-极性非质子溶剂，
-含水溶剂，
-以及其混合物。
23.根据权利要求5所述的介质，其中所述溶剂(S)选自包括以下的组：
-醇，
-极性非质子溶剂，
-含水溶剂，
-以及其混合物。
24.根据权利要求6所述的介质，其中所述溶剂(S)选自包括以下的组：
-醇，
-极性非质子溶剂，
-含水溶剂，
-以及其混合物。
25.根据权利要求8所述的介质，其中所述溶剂(S)选自包括以下的组：
-醇，
-极性非质子溶剂，
-含水溶剂，
-以及其混合物。
26.根据权利要求10所述的介质，其中所述溶剂(S)选自包括以下的组：
-醇，
-极性非质子溶剂，
-含水溶剂，
-以及其混合物。
27.根据权利要求15所述的介质，其中所述溶剂(S)选自包括以下的组：
-醇，
-极性非质子溶剂，
-含水溶剂，
-以及其混合物。
28.根据权利要求16所述的介质，其中所述溶剂(S)选自包括以下的组：
-醇，
-极性非质子溶剂，
-含水溶剂，
-以及其混合物。
29.根据权利要求22所述的介质，其中所述醇是甲醇、乙醇或甲氧基乙醇。
30.根据权利要求23-28中任一项所述的介质，其中所述醇是甲醇、乙醇或甲氧基乙醇。
31.根据权利要求22所述的介质，其中所述极性非质子溶剂是二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。
32.根据权利要求23-28中任一项所述的介质，其中所述极性非质子溶剂是二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。
33.根据权利要求22所述的介质，其中所述含水溶剂是水或缓冲水。
34.根据权利要求23-28中任一项所述的介质，其中所述含水溶剂是水或缓冲水。
35.根据权利要求22所述的介质，其中所述溶剂(S)是二甲基亚砜(DMSO)。
36.根据权利要求23-28中任一项所述的介质，其中所述溶剂(S)是二甲基亚砜(DMSO)。
37.根据权利要求1-4、7、9、11-14、17-21、23-29、31、33和35中的一项所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
38.根据权利要求5所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
39.根据权利要求6所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
40.根据权利要求8所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
41.根据权利要求10所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
42.根据权利要求15所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
43.根据权利要求16所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
44.根据权利要求22所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对其存在将被示出的酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
45.根据权利要求30所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
46.根据权利要求32所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
47.根据权利要求34所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
48.根据权利要求36所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物包含：对酯酶是特异性的靶标部分；以及发色团和/或荧光团标记物部分，当所述标记物部分不再与所述靶标部分连接时，即在通过所述酯酶裂解之后，所述标记物部分发射光和/或荧光。
49.根据权利要求1-4、7、9、11-14、17-21、23-29、31、33、35和38-48中的一项所述的介质，其中所述酯酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
50.根据权利要求5所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
51.根据权利要求6所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
52.根据权利要求8所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
53.根据权利要求10所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
54.根据权利要求15所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
55.根据权利要求16所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
56.根据权利要求22所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
57.根据权利要求30所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
58.根据权利要求32所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
59.根据权利要求34所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
60.根据权利要求36所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
61.根据权利要求37所述的介质，其中所述酶底物是基于吲哚酚或其衍生物中的一种的底物。
62.根据权利要求49所述的介质，适用于在绝氧和/或微量需氧的条件下使用，所述介质包含促进所述吲哚酚衍生物的氧化聚合的试剂。
63.根据权利要求50-61中的任一项所述的介质，适用于在绝氧和/或微量需氧的条件下使用，所述介质包含促进所述吲哚酚衍生物的氧化聚合的试剂。
64.根据权利要求62所述的介质，所述促进所述吲哚酚衍生物的氧化聚合的试剂是柠檬酸铁络合物。
65.根据权利要求63所述的介质，所述促进所述吲哚酚衍生物的氧化聚合的试剂是柠檬酸铁络合物。
66.根据权利要求1-4、7、9、11-14、17-21、23-29、31、33、35、38-48、50-62和64-65中的任一项所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
67.根据权利要求5所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
68.根据权利要求6所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
69.根据权利要求8所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
70.根据权利要求10所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
71.根据权利要求15所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
72.根据权利要求16所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
73.根据权利要求22所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
74.根据权利要求30所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
75.根据权利要求32所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
76.根据权利要求34所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
77.根据权利要求36所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
78.根据权利要求37所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
79.根据权利要求49所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
80.根据权利要求63所述的介质，其中所述生色底物和/或荧光底物的浓度在1mg/L和10g/L之间。
81.根据权利要求66所述的介质，其中所述所述生色底物和/或荧光底物的浓度在5mg/L和6g/L之间。
82.根据权利要求67-80中的一项所述的介质，其中所述所述生色底物和/或荧光底物的浓度在5mg/L和6g/L之间。
83.根据权利要求66所述的介质，其中所述所述生色底物和/或荧光底物的浓度在25mg/L和2g/L之间。
84.根据权利要求67-80中的一项所述的介质，其中所述所述生色底物和/或荧光底物的浓度在25mg/L和2g/L之间。
85.根据权利要求1-4、7、9、11-14、17-21、23-29、31、33、35、38-48、50-62和64-65、67-81和83中的一项所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
86.根据权利要求5所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
87.根据权利要求6所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
88.根据权利要求8所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
89.根据权利要求10所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
90.根据权利要求15所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
91.根据权利要求16所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
92.根据权利要求22所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
93.根据权利要求30所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
94.根据权利要求32所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
95.根据权利要求34所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
96.根据权利要求36所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
97.根据权利要求37所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
98.根据权利要求49所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
99.根据权利要求63所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
100.根据权利要求66所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
101.根据权利要求82所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
102.根据权利要求84所述的介质，所述介质包括适合的培养介质。
103.根据权利要求85所述的介质，所述培养介质选自-麦康凯、Hektoen选择性介质、被意图用于选择性地检测沙门氏菌的沙门氏菌的选择性生色介质、哥伦比亚ANC、PALCAM、沙保弱庆大霉素-氯霉素类型，
-哥伦比亚+/-血液、胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂(TSA)、营养琼脂、沙保弱类型的非选择性介质。
104.根据权利要求86-102中的一项所述的介质，所述培养介质选自-麦康凯、Hektoen选择性介质、被意图用于选择性地检测沙门氏菌的沙门氏菌的选择性生色介质、哥伦比亚ANC、PALCAM、沙保弱庆大霉素-氯霉素类型，
-哥伦比亚+/-血液、胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂(TSA)、营养琼脂、沙保弱类型的非选择性介质。
105.根据权利要求103所述的介质，所述培养介质是所述麦康凯或被意图用于选择性地检测沙门氏菌类型的沙门氏菌的选择性生色介质。
106.根据权利要求104所述的介质，所述培养介质是所述麦康凯或被意图用于选择性地检测沙门氏菌类型的沙门氏菌的选择性生色介质。
107.根据权利要求103所述的介质，所述培养介质是所述哥伦比亚介质。
108.根据权利要求104所述的介质，所述培养介质是所述哥伦比亚介质。
109.一种获得根据权利要求1至108中的一项的介质的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述溶剂(S)中制备至少一种储备溶液，所述至少一种储备溶液具有权利要求1至108中的一项中定义的至少一种生色底物和/或荧光底物以及至少一种烃基糖苷或烃基硫代烃基糖苷；
b)任选地将至少一种添加剂添加至所述介质中；以及
c)使全部均质化。
110.根据权利要求1至108中的一项的介质用于检测具有酯酶活性的微生物的用途。
111.根据权利要求110所述的用途，其中所述具有酯酶活性的微生物是具有酯酶活性的细菌或酵母。
112.根据权利要求110-111中任一项所述的用途，所述微生物是革兰氏阴性细菌。
113.根据权利要求112所述的用途，其中所述革兰氏阴性细菌是沙门氏菌属的细菌。
114.一种非诊断目的的用于样品中的具有酯酶活性的微生物的检测方法，所述方法包括以下步骤：
i)用待分析的样品接种根据权利要求1至108中任一项所述的介质；
ii)在适当的条件下温育所述接种的介质；
iii)检测并且解释在由所述微生物形成的菌落处的显色和/或荧光，所述显色和/或荧光揭示至少一种生色底物和/或荧光底物与酯酶活性的反应。
115.至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷用于改进酶活性的检测的用途，所述酶活性是微生物的酯酶活性，其中所述检测在检测介质中进行，所述检测介质包含
所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷，
至少一种生色底物和/或荧光底物，其酯酶活性是特异性的，和
至少一种溶剂，
并且其中当所述检测介质包含正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为烃基糖苷时，所述介质不包含被包括在由聚磷酸钠类(HMP)、氯化铷(RbCl)和氯化锂(LiCl)构成的组中的化合物，
其中所述介质中所述至少一种烃基糖苷或烃基硫代糖苷的浓度在0.5g/L和8g/L之间，并且其中所述烃基糖苷或烃基硫代糖苷对应于通式(I)：
R-X-(G)n (I)
其中：
-R代表直链或支链的、饱和或不饱和的含有6至12个碳原子的脂肪族基团；
-X是-O-或-S-；
-G代表碳水化合物残基；
-n是在1和10之间的整数。
116.根据权利要求115所述的用途，其中R代表直链的脂肪族基团。
117.根据权利要求115所述的用途，其中R代表直链且饱和的脂肪族基团。
118.根据权利要求115所述的用途，其中R代表含有8至12个碳原子的脂肪族基团。
119.根据权利要求115-118中任一项所述的用途，其中X是-O-。
120.根据权利要求115-118中任一项所述的用途，其中n是1和3之间的整数。
121.根据权利要求119所述的用途，其中n是1和3之间的整数。
122.根据权利要求115-118中任一项所述的用途，其中n是1或2。
123.根据权利要求119所述的用途，其中n是1或2。
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