CN104865394B - 一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置及使用方法和用途，该装置由过滤器、液体泵、脱气检测池、回路管、光源、光电转换器、信号处理器及各段管道组成；在计算机控制下，取样、脱气、检测、样品返回的全自动循环检测；检测间隔时间可依需要调控，结果准确、不消耗试剂与材料、使用费低。可用于检测各种几何结构生物反应器内瞬时细胞浓度及其变化过程，尤其适用于需要在线实时连续准确检测富含气泡液体的细胞浓度的场合，如藻类培养、微生物发酵过程中实时细胞浓度的准确检测；还可用于检测液体中微小颗粒的瞬时浓度及变化过程：如检测水净化或污染过程的浊度及变化过程。

Description

一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置

技术领域

本发明涉及一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，尤其涉及一种在线自动连续检测细胞培养体系或微生物工程体系中细胞浓度的装置。

本发明还涉及一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度装置的使用方法和用途。

背景技术

在微生物培养或微生物工程过程中，通过检测细胞浓度，可以了解细胞的繁殖、生长和生产状况，以便进行有效的调节与控制。

细胞浓度检测方法有取样检测法和在线检测法，取样检测法一般是用取样器从含有细胞的容器内取出一部分样品进行处理、检测，该法存在的问题有：(1) 取样时有可能将污染物引入培养系统中；(2) 消耗分析用材；(3) 耗用人工较多；(4)耗时长，结果获取滞后，不能及时进行实时反馈调控。

在线检测法有光反射法和电容法等。光反射法是将一束光射入透明容器或容器的透明窗直达器内液体表面或器壁与液体的界面，并接收其反射光，根据入射光与反射光的强度差异获得液体的细胞浓度。世界专利公开号WO2012016159A2，公开日为2012年2月2日，发明创造的名称为快速确定颗粒浓度的光学传感器(Optical sensor for rapid determination of particulate concentration)，该申请案公开了一种基于光反射法的细胞浓度测定法。该法存在的问题有:(1) 气泡未消除，影响检测结果的准确性；因微生物培养或微生物发酵过程中不断产生气体并以气泡的形式存于液内，气泡未消除，影响检测结果的准确性。(2)测量结果是表面或界面的浓度，难以反映整体浓度，仪器接收的反射光是容器内液体表面反射的光或是容器壁与液体界面反射的光，所测细胞浓度是其表面或界面的浓度，由于液体表面的气泡多于内部，表面组成与内部的不同，若搅拌不充分，表面浓度不能代表内部浓度；器壁与液体的界面是滞流层，传质效果差，更新慢，界面组成随时间的变化跟不上内部变化，界面浓度不能代表内部浓度。在线电容法是将感应器插入容器内，测量进入感应器液体的介电特性从而获得细胞的浓度，该法存在的问题有：(1)气泡未消除，影响检测结果的准确性。(2)测量结果是感应器内浓度，难以反映整体浓度，由于感应器内液体与外界液体不能充分对流交换，器内更新慢，组成随时间的变化跟不上感应器外部的变化，器内细胞浓度随时间变化不能代表整体浓度随时间的变化；(3)高浓度下易造成感应器阻塞。

发明内容

发明目的：为了克服现有细胞浓度检测技术的不足，解决当前实时检测细胞浓度存在的诸多问题，本发明提供一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，可在线实时自动连续检测细胞培养液在培养过程中或微生物发酵体系在发酵过程中的细胞浓度，及时了解体系中的细胞浓度及其变化过程，为适时有效调控细胞培养条件或微生物发酵条件提供依据，为微生物工程自动化提供支撑。

该装置可消除气泡干扰，不易阻塞，细胞浓度检测范围大（光密度范围0.05～60），无样品损耗，不用耗材、结果准确、使用费低，并且各功能区高度整合、结构简单、制造容易。

技术方案：本发明提供一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置及其使用方法和应用，尤其涉及一种在线实时自动连续检测细胞培养体系在培养过程中或微生物发酵体系在发酵过程中细胞浓度的装置及其使用方法和应用。

具体地说是提供一种可脱气在线实时自动连续检测细胞浓度装置的测量原理、结构、组件、使用方法与应用。

所述一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，如图1所示，包括过滤器2、液体泵3、脱气检测池4、回路管5、光源6、光电转换器7、信号处理器8及各段管道组成的可脱气自动连续检测循环装置，其特征是：过滤器2、液体泵3、脱气检测池4、回路管5之间由管道相连，与细胞培养器1构成液体流动循环系统；光源、光电转换器、信号处理器由电线相连，构成检测、信号处理及控制系统；所述脱气检测池是使被检测液体连续流动、脱气消泡、检测光可透过检测的流通池；所述光源为波长与亮度均可调控的发光器；所述光电转换器是光信号线性地转换成电信号的转换器件；所述信号处理器是具有数据处理和程序控制功能的计算机，能将光电转换器输入的电信号转换成细胞浓度的数据，并能进行计算、保存、显示、输出等处理，同时还能按一定程序控制液体泵的流量、光源的亮度、光电转换器的信号强度和检测频率等。

所述细胞培养器1是指含有细胞培养体系的容器或含有微生物发酵体系的容器，也可以理解为用于微生物培养容器或微生物工程容器或任何液相体系的容器。

所述过滤器2为膜过滤器，过滤膜孔直径0.1 mm～0.5mm。过滤器作用： (1)让液体中细胞顺畅通过，通过前后液体的细胞浓度不变；(2) 拦截液体中的固形物(如粉尘、有机团块、生物残体等)，防止进入液体泵和检测池干扰液体输送与检测结果；(3)消除液体中的部分气体(如气泡和泡沫等)。

所述液体泵3是液体输送设备，向被检测液体输入能量，使之进入检测池检测并返回细胞培养器1，材质为无毒或无生物活性的塑料或金属材料，流量每分钟为0 mL～100mL，由计算机控制，可选自柱塞泵、齿轮泵、叶轮泵等中的一种。

所述脱气检测池4，如图2、图3a、图3b所示，其特征是：由检测池凹槽9、密封圈16和盖板10组成，密封圈16嵌入检测池凹槽9的周边，检测池凹槽9和盖板10由连接件(如螺栓等)14连结，构成有液体进口11、液体出口13、检测窗(光线可透过)12的检测池。在液体泵3的作用下，被检测液体连续由液体进口11进入检测池，先脱气消泡，后被检测，再由液体出口13流出。

所述检测池凹槽9，是本发明的主要功能部件，如图3a、3b、3c、3d所示:凹槽的深度h1=0.5mm～12mm，槽内有脱气消泡墙17、液体进口11、液体出口13；所述脱气消泡墙17为一凸块，凸块形状可为长方体，靠近液体出口侧，其长a=12mm至80mm，宽b=12mm至60mm，高h2与槽深h1相等；脱气消泡墙17的左边与凹槽左内侧的距离L1=12mm至40mm，右边与凹槽右内侧的距离L2=12mm至30mm，对于同一脱气消泡墙，L1大于L2；上边与凹槽上内侧的距离L3=2mm至10mm；下边与凹槽下内侧的距离L4=4mm至20mm；脱气消泡墙的形状也可以制成有利于脱气消泡(脱除液体中气体)的任何几何形状，如正方体、圆柱体、圆台全、锥全、梯形体、曲面体等。所述液体进口11是一根连接于凹槽壁的圆管,内径为2mm至8mm，位于脱气消泡区，顶端低于凸块上侧面(气体流道底面)，底端高于凸块下侧面(液体流道上面)4mm以上；所述液体出口13是一根连接于凹槽壁的圆管,内径为2mm至8mm，位于液体出口缓冲区，顶端低于凸块上侧面(气体流道底面)2mm至4mm；液体进口11与液体出口13可处于同一水平线，也可以处于不同水平线。检测池凹槽9的材料为无毒或无生物活性的塑料或金属材料。

所述脱气检测池4,其内部有多个功能区，如图3c所示：有脱气消泡区21、液体流道区20、液体出口缓冲区19、气体流道区18等功能区。其中：脱气消泡区21是液体进口缓冲区,系气液分离区,液体中的气体在此分离,气泡消除；液体流道区20是液体由脱气消泡区21流至出口缓冲区19的通道，检测窗12位于液体流道20的中间或偏右，检测窗12是可见光可穿透的窗口，由透明材料(如塑料或玻璃)制成；气体流道区是脱气消泡区21内的气体流入出口缓冲区19的通道；液体出口缓冲区19是被检测液体出口的缓冲区，也是气体出口缓冲区,由气体流道流入的气体在此区逐渐随液体流出。

脱气检测池4的脱气工作原理是：在液体泵3的作用下，如图3c所示，当含有气体(如气泡)的液体(如细胞培养液或微生物发酵液)由液体入口11进入脱气消泡区21上部时,由于脱气消泡墙17的存在，不能及时进入液体流道20，在动能与重力的双重作用下不停地运动，并且与脱气消泡墙17及凹槽9内壁碰撞，液体中的气泡破裂，气体逸出、上升，经气体流道18流入液体出口缓冲区19，随检测后的液体流出。脱气消泡后的液体沿液体流道20流动，经检测窗12检测后流进液体出口缓冲区19，最后经液体出口13流出，实现被测液体连续流动、脱气消泡、被检测、流出的功能。

本发明细胞浓度检测方法是比浊法，检测原理是：当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低，在一定浓度范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线，然后以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用细胞计数板计数、平板菌落计数或细胞干重测定等方法。

所述光源6为发光二极管(LED)灯，波长与亮度均可调控，波长调控范围为300nm至800nm，波长调控精度为±2nm，通过选用不同波长的发光二极管灯以调控光源的波长；通过调节发光二极管灯的电流强度以调控光源的亮度。

所述光电转换器7是由光电二极管组成的光电转换器，将光信号线性地转换成电信号，并可进行放大的器件。选择光—电转换相关性好、线性范围大的光电二极管作为光感应器件，使用可调控的线性放大器放大与调控感应的电信号；光电转换器可以通过连接件(如螺栓) 与脱气检测池连接，也可以通过胶粘剂与脱气检测池连接。

所述信号处理器8是具有数据处理和程序控制功能的计算机，能将光电转换器输入的电信号转换成细胞浓度的数据，并能进行计算、保存、显示、输出等处理，同时还能按一定程序控制液体泵的流量、光源的亮度、光电转换器的信号强度和检测频率等。

计算机操作系统可选用Windows操作系统，如Windows2000、WindowsXP、Windows7等，也可选用其他操作系统；数据处理软件可选用Office软件，如Office2000、Office2003、Office2007、Office2010等，也可选用其他数据处理软件；控制与数据采集软件可选用现有工程控制软件，如LabVIEW，也可自编控制软件，控制程序按要求设置参数。

所述回路管5是检测后的液体流回细胞培养器的管路，与细胞培养器1、过滤器2、液体泵3、脱气检测池4及各段管道组成液体自动循环流动装置。

液体自动循环流动装置与光源6、光电转换器7、信号处理器8等组成自动连续检测循环装置。

本发明装置的工作过程由液体的循环流动过程、液体的检测过程和控制过程三部分组成：

液体循环流动过程：如图1所示，启动液体泵3，在泵的吸力作用下，细胞培养器1内的液体流入过滤器2(固形物被拦截、部分气泡被消除)，进液体泵3进一步获得动能，由脱气检测池进口(图2中11)流入脱气消泡区(图3d中21)上部，由于脱气消泡墙17的存在，不能及时进入液体流道20，在动能与重力的双重作用下不停运动，并且与脱气消泡墙17及凹槽内壁碰撞，液体中的气泡破裂，气体逸出、上升，经气体流道18流入液体出口缓冲区19，随检测后的液体流出。脱气消泡后的液体沿液体流道20流动，经检测窗12检测后流进液体出口缓冲区19，由液体出口13流出，经回路管5流回细胞培养器1，实现被测液体连续流进、脱气消泡、被检测、流出、返回的循环过程。

检测液体过程：当被测液体沿液体流道20流经检测窗12时，受到光源6发射的光照射，由于菌体的散射及吸收作用，一部分光线被反射与吸收，一部分光线透过液体并照射在光电转换器7上产生电信号并经放大，后者经信号处理器8处理，获得细胞浓度数据，实现对液体的检测过程。影响光线透过量的因素主要有液体中细胞的浓度与槽的深度。液体中细胞浓度越大，光线的透过量越小；槽的深度越大，光线穿过液体的路程越长，透过量越小；槽深一定时，光线透过量与液体细胞浓度成反比，与液体的光密度成正比。本发明可以检测液体的光密度范围为0.05～60。

控制过程：根据检测要求，设置有关参数值(如泵的转速、光源电流强度、光电转换器的放大倍数、光电转换器工作间隔时间等)，控制液体泵的流量、光源亮度、光电转换器的信号强度和检测频率等，实现自动连续检测。

本发明装置的应用：

(1) 检测微生物体系细胞的瞬时浓度以及浓度变化过程，尤其适用于需要在线实时连续准确检测富含气体的体系细胞浓度的场合，如藻类培养、细胞培养、微生物发酵过程中实时细胞浓度及其变化过程的准确检测，为工艺参数调控或自动化过程提供依据。

(2) 检测液体中微小颗粒物的瞬时浓度以及浓度变化过程：如检测水在净化或受污染过程中微小颗粒物任一时刻的浓度以及浓度变化过程，为质量监控提供依据。

发明的效益：

(1) 与人工取样检测比较，本发明优点有三:

① 实时获取检测结果，为即时调控提供依据：本发明是在线实时连续检测，即时获得检测结果，可为即时调控提供依据。而人工取样检测，取样后经处理、检测才能获得结果，耗时长，检测结果反映的是系统前一时间的情况，并非现时(数据获得时)情况，滞后的数据，只能作为现时调控的参考,不能作为调控的依据。

② 节约分析时间，节约人工和耗材，降低检测成本：人工取样检测需要取样、样品处理、仪器检测，要使用一次性手套、取样器、样品存放器、样品处理器、稀释剂、洗涤剂等，耗时、耗人工、耗材，费用高；本发明系自动检测，不需要人工操作，不消耗试剂和材料，检测费用低。

③ 避免了外界物质污染被检测体系。人工取样检测，取样时有可能将污染物引入培养体系造成污染，本发明的自动取样检测，全封闭循环连续检测，避免了外界污染。

(2) 与现有自动检测方法比较，有优点二:

① 消除被检测液体中的泡沫，实时脱除液体中的气体，避免了气泡对检测结果的影响，且检测后的样品气液组分可以复原。

本发明将脱气与检测部件整合，消除了液体中气体的影响，如图1、图3c所示，在液体泵3的作用下，细胞培养器1内的液体经过滤器2消去部分泡沫后，进入液体泵3被送入脱气检测池4进行脱气消泡、检测，然后经回路管5流回细胞培养器1。

现有自动检测细胞浓度技术，如光照取样检测和插管取样检测，均没有实施先脱气后检测，液体中的气体影响了检测结果的准确性，在检测富含气体的细胞液时，如微生物培养或微生物发酵过程中的细胞浓度时，液体中气体对检测结果的影响相当大。

② 流动取样，检测结果更准确。

本发明是流动取样，如图1所示，细胞培养器1内的液体被吸入过滤器2、液体泵3，经脱气检测池4检测后，再由回路管5流回细胞培养器1内。从细胞培养器一处吸入样品检测后流回另一处，循环流动，形成细胞培养器内液体的良好对流传质，每次样品都反映体系整体情况，与器内整体组成相同，检测结果代表着器内液体的整体水平，尤其对于特殊结构的反应器，如膜式反应器，检测结果更准确。

现有自动检测技术采用静态方式取样，如光照取样和插管取样。

光照取样检测：是用光透过器壁照射器内液面(器内液体的表面或器壁与液体的界面)进行的取样检测,样品始终为某一处的静态样，检测结果不能代表体系的整体水平，因为光照到的液面与器内大量的液体难以较好地对流传质,所以获得的结果不能反映器内液体的整体水平。

插管取样检测：将一根管插入微生物培养容器内的取样检测，样品是管内静态液体，仅代表系统中某一局部情况。管内样品与管外难以对流传质，因此获得的结果难以反映器内液体的整体水平。

附图说明

图1为本发明细胞浓度检测装置工况示意图；

图1中各数字表示的意义：1—细胞培养器；2—过滤器；3—液体泵；4—脱气检测池；5—回路管；6—光源；7—光电转换器；8—信号处理器。

图2为本发明脱气检测池立体示意图；

图2中各数字表示的意义：9—检测池凹槽；10—检测池盖；11—液体入口；12—检测窗(可见光透过窗)；13—气、液出口；14—固定连接件。

图3a为本发明脱气检测池凹槽主视图；

图 3a 中各标注含义： a—脱气消泡墙长，a=12mm～80mm； b —脱气消泡墙宽，b=12mm～60mm。图 3a中各数字表示的意义：15—固定件连接孔；16—密封圈；17—脱气消泡墙，其他数字意义同前图。

图3b为图3a沿A-A线的剖面图；

图 3b 是图3a沿A—A线的剖面图，图中h1是槽深，h1=0.5mm～12mm，h2是消泡墙高，与h1相等，其他数字意义同前图。

图3c为本发明脱气检测池凹槽功能区示意图；

图3c中各数字表示的意义：18—气体通道；19—出口缓冲区；20—液体流道；21—脱气消泡区；其他数字意义同前图。

图3d为本发明脱气检测池凹槽功能区有关尺寸图；

图3d中：

L1 —脱气消泡区宽，不小于进口孔直径的2倍；

L2 —液体出口缓冲区宽，不小于出口孔直径的2倍，且小于L1；

L3 —气体流道宽，L3=2 mm～10mm；

L4 —液体流道宽，L4=4mm～20mm。

图4为本发明脱气检测池盖示意图；

图5为本发明光电转换器位置示意图。

具体实施方式

本发明装置使用方法与步骤如下：

(1) 根据所检测细胞浓度范围,选择适宜的脱气检测池，按图1的方式，安装与调试好检测装置；

(2) 根据检测要求，设置有关参数值(如泵的转速、光源电流强度、光电转换器的放大倍数、光电转换器的工作间隔时间等)，控制液体泵的流量、光源亮度、光电转换器的信号强度和检测频率等，实现自动连续检测。

(3) 配制所测细胞系列浓度溶液，分别检测光密度,建立细胞浓度—光密度关系式；

(4) 检测样品，获得相应光密度,利用建立的细胞浓度—光密度关系式求得样品细胞浓度。

本发明所述的装置并不限于具体所述实施步骤，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。

Claims (6)

1.一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，包括过滤器、液体泵、脱气检测池、回路管、光源、光电转换器、信号处理器及管道组成的自动连续检测循环装置，其特征是：过滤器、液体泵、脱气检测池、回路管之间由管道相连，与被检测细胞液容器构成液体循环流动系统；光源、光电转换器、信号处理器由电线相连，构成检测、信号处理及控制系统；所述脱气检测池由检测池凹槽、密封圈和盖板组成，其中密封圈嵌入检测池凹槽周边，检测池凹槽和盖板之间通过连接件连结；所述检测池凹槽是长方体凹槽,槽深为0.5mm至12mm，槽内有液体进口、液体出口、脱气消泡墙、检测窗，所述脱气消泡墙为一凸块，选之长方体、正方体、梯形体、曲面体中的一种，脱气消泡墙高与槽深相等，位于槽的中间，液体进口位于脱气消泡墙左上部，顶端低于脱气消泡墙上侧面，底端高于脱气消泡墙下侧面4mm以上；液体出口位于脱气消泡墙右上部，顶端低于脱气消泡墙上侧面2mm至4mm，脱气消泡墙左侧与凹槽内侧的距离为12mm至40mm，构成液体进口、脱气消泡、气液分离区,脱气消泡墙上侧与凹槽内侧的距离为2mm至10mm，构成气体流道区，脱气消泡墙下侧与凹槽内侧的距离为4mm至20mm，构成液体流道区，检测窗位于液体流道区中间或中间偏右，脱气消泡墙右侧与凹槽内侧的距离为12mm至30mm，构成液体出口缓冲、气液再混合与出口区；所述光源为发光二极管，波长范围为300nm至800nm，亮度可调控；所述光电转换器是光信号线性地转换成电信号的器件；所述信号处理器是具有数据处理和程序控制功能的计算机，能将光电转换器输给的电信号转换成细胞浓度参数并能进行计算、保存、显示、输出处理，并按一定程序控制液体泵的流量、光源的亮度、光电转换器的信号强度、检测频率；本装置在线自动连续检测光密度范围为0.05至60。

2.根据权利要求1所述的一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，其特征是：所述脱气消泡墙为长方体，长12mm至80mm，宽12mm至60mm，高与槽深相等。

3.根据权利要求1所述的一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，其特征是：所述光电转换器是由光电二极管组成的光电转换器，将光信号线性地转换成电信号。

4.根据权利要求1所述的一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，其特征是：所述装置检测细胞浓度的方法是：

(1)根据所检测细胞浓度范围,选择适宜的脱气检测池；

(2)配制所测细胞系列浓度溶液并进行检测,建立细胞浓度—电信号关系式；

(3)检测样品，获得相应电信号,利用建立的细胞浓度—电信号关系式计算样品的细胞浓度。

5.根据权利要求1所述的一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，其特征是：所述装置应用于检测微生物体系的细胞浓度及浓度变化过程。

6.根据权利要求1所述的一种可脱气在线自动连续检测细胞浓度的装置，其特征是：所述装置应用于检测液体中微小颗粒物的浓度以及浓度变化过程。