CN104861065A - 一种人类cd20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法，采用6-12周SPF级雌性Balb/c小鼠，免疫流程同一般血清的制备；将免疫后的小鼠预处理B细胞和骨髓瘤细胞通过PEG法进行细胞融合；采用HAT选择培养，得到杂交瘤细胞，检测细胞培养上清液，进行阳性克隆的筛选；进行杂交瘤细胞的克隆化；进行杂交瘤细胞的冻存和复苏；大量生产人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体。采用小剂量利妥昔单抗治疗免疫性血小板减少症的实施例支持利妥昔单抗与其他药物的联合在临床应用可能会取得较单药更好的效果，在免疫性血小板减少症治疗中有较好的疗效，不良反应小，可作为有效的二线治疗手段。

Description

一种人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及一种人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法。

背景技术

免疫性血小板减少症(ITP)是一种常见的以血小板计数减少及出血风险增加为特点的病情反复的自身免疫性疾病。虽然该疾病是一种良性疾病，但由于疾病本身或治疗相关不良反应使患者的生活质量降低。

目前推荐ITP的一线治疗主要为糖皮质激素、静脉注射免疫球蛋白和抗D免疫球蛋白。二线治疗主要包括脾切除、利妥昔单抗、血小板生成素受体激动剂(TPO-RA)。

糖皮质激素60-70％的有效率，但在减量或原剂量的持续用药中容易发生激素依赖，结果为血小板的下降，并且非常多的副作用，如：高血压、高血糖、溃疡、感染、股骨头坏死等。

静脉注射免疫球蛋白、抗D免疫球蛋白、血小板生成素受体激动剂(TPO-RA)价格昂贵，且药物有效时间非常短暂，停药半月后复发。

脾切除70％左右的患者有效，但术后也存在复发的问题，同时感染等手术并发症使得一些患者不能接受。

通过全面衡量各治疗方法的有效持续时间、疾病复发率、不良反应及药物价格等，利妥昔单抗正逐渐被越来越多用于治疗ITP患者。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法，旨在解决现有的血小板减少症治疗方法存在的有效持续时间短、疾病复 发率高、不良反应大及药物价格昂贵的问题。

本发明是这样实现的，一种人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法，所述的人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法为：

步骤一、动物的选择与免疫：采用6-12周SPF级雌性Balb/c小鼠，免疫流程同一般血清的制备；

步骤二、将免疫后的小鼠预处理B细胞和骨髓瘤细胞通过PEG法进行细胞融合；

步骤三、采用HAT选择培养，得到杂交瘤细胞，检测细胞培养上清液，进行阳性克隆的筛选；

步骤四、进行杂交瘤细胞的克隆化；

步骤五、进行杂交瘤细胞的冻存和复苏；

步骤六、大量生产人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体。

效果汇总

本发明实施例中，采用小剂量利妥昔单抗治疗免疫性血小板减少症，32例ITP患者，可评估29例，完全反应18例，有效5例，总反应率79.3％，其中新诊断患者总反应率50％，持续性、慢性ITP患者总反应率高达83.9％，考虑与联合应用其他药物如TPO、IL-11、静脉免疫球蛋白、糖皮质激素相关，进一步支持利妥昔单抗与其他药物的联合在临床应用可能会取得较单药更好的效果，在免疫性血小板减少症治疗中有较好的疗效，不良反应小，可作为有效的二线治疗手段。

附图说明

图1是本发明实施例提供的人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明是这样实现的，一种利妥昔单抗，包括活性成分人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体、枸橼酸钠、聚山梨醇酯80、氯化钠、注射用水。

进一步，如图1所示，所述的人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法为：

S101、动物的选择与免疫：采用6-12周SPF级雌性Balb/c小鼠，免疫流程同一般血清的制备；

S102、将免疫后的小鼠预处理B细胞和骨髓瘤细胞通过PEG法进行细胞融合；

S103、采用HAT选择培养，得到杂交瘤细胞，检测细胞培养上清液，进行阳性克隆的筛选；

S104、进行杂交瘤细胞的克隆化；

S105、进行杂交瘤细胞的冻存和复苏；

S106、大量生产人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体。

进一步，所述的利妥昔单抗的使用方法为：

成人作为成年病人的单一治疗药，推荐剂量为每平方米体表面积375mg，静脉给入，每周1次，共4次，并适合门诊用药，滴注本药60分钟前可给予止痛药和抗过敏药，推荐首次滴入速度为50mg/hr，随后可每30分钟增加50mg/hr，最大可达400mg/hr，如果发生过敏反应或与输液有关的反应，应暂时减慢或停止输入，如病人的症状改善，则可将输入速度提高一半，随后的输入速度开始可为100mg/hr，每30分钟增加100mg/hr，最大可达到400mg/hr，配置好的输注液不应静脉推注或快速滴注。

2009年1月～2012年12月就诊于沈阳军区总医院血液科32例ITP患者。其中男性6例，女性26例，男∶女为3∶13，中位年龄40岁(14-68岁)。所有病例均按照2009年国际ITP工作组制定的诊断及分型标准，新诊断ITP 9例，持续性ITP 5例，慢性ITP 18例。其中重症P 28例，难治性2例。患者治疗时血小板水平＜10×10⁹/L 28例，10～50×10⁹/L 3例，＞100×10⁹/L 1例(早期应用TPO后血小板升至正常，考虑巩固治疗在血小板计数正常后采用利妥昔单抗)。从诊断至用药时间10d-20y，中位时间3y。应用利妥昔单抗前的治疗史：无治疗3例，糖皮质激素14例，白介素11(IL-11)1例，TPO 1例，糖皮质激素+静脉免疫球蛋白4例，糖皮质激素+IL-11 1例，糖皮质激素+静脉免疫球蛋白+IL-11 2例，糖皮质激素+TPO+达那唑1例，糖皮质激素+TPO+达那唑+静脉免疫球蛋白1例，糖皮质激素+环磷酰胺+长春新碱1例，糖皮质激素+达那唑+长春新碱1例，糖皮质激素+脾切除1例，糖皮质激素+脾切除+TPO 1例。32例均无乙肝、丙肝及HIV；合并梅毒1例，溃疡性结肠炎1例，甲状腺功能减低1例。

本发明采用小剂量利妥昔单抗治疗免疫性血小板减少症的方法包括：

实验室检查：所有患者均进行血液分析、肝功、肾功、血糖、乙肝、丙肝、HIV、梅毒、抗“O”、类风湿因子、抗核抗体、免疫球蛋白、骨髓涂片检查，部分患者进行血清TPO水平的检测及幽门螺旋杆菌的筛查，治疗期间每3天监测1次血液分析，治疗结束后每个月复查1次血液分析；

ITP的分型：按照2009年国际ITP工作组制定的分型标准，新诊断的ITP：指确诊后3个月以内的ITP患者；持续性ITP：指确诊后3～12个月血小板持续减少的ITP患者，包括没有自发缓解的患者或停止治疗后不能维持完全缓解的患者；慢性ITP：指血小板减少持续超过12个月的ITP患者；重症ITP：指血小板＜10×10⁹/L，且就诊时存在需要治疗的出血症状或常规治疗中发生了新的出血症状且需要用其他升高血小板药物治疗或增加现有治疗 的药物剂量；难治性ITP：指满足以下所有三个条件的患者：①脾切除后无效或者复发；②仍需要治疗以降低出血的危险；③除外了其他引起血小板减少症的原因，确诊为ITP；

治疗方法：利妥昔单抗100mg/周连用4周，之后若经济条件允许每3-6月巩固应用1次，用药前为预防过敏反应，给予地塞米松5～10mg静点，并口服氯苯那敏8mg，治疗初期血小板＜30×10⁹/L时，利妥昔单抗+糖皮质激素或者利妥昔单抗+IL-11或者利妥昔单抗+TPO或者利妥昔单抗+静脉免疫球蛋白，利妥昔单抗应用时血小板＞30×109/L时，作为糖皮质激素/静脉免疫球蛋白/TPO后续维持治疗；

其中，治疗初期血小板＜30×10⁹/L时，利妥昔单抗+糖皮质激素17例(其中糖皮质激素只是在应用利妥昔单抗的当天应用11例)，或者利妥昔单抗+IL-115例，或者利妥昔单抗+TPO 4例，或者利妥昔单抗+静脉免疫球蛋白3例，另外3例利妥昔单抗应用时血小板＞30×10⁹/L，作为糖皮质激素/静脉免疫球蛋白/TPO后续维持治疗。

疗效判定，按照2009年国际ITP工作组制定的疗效标准，完全反应：治疗后血小板数≥100×10⁹/L且没有出血；有效：治疗后血小板数≥30×10⁹/L并且至少比基础血小板数增加两倍，且没有出血；无效：治疗后血小板数＜30×10⁹/L或者血小板数增加不到基础值的两倍或者有出血；在定义完全反应或有效时，应至少检测两次，其间至少间隔7d。

治疗结果：

1、不同ITP亚型利妥昔单抗治疗的疗效：

32例ITP患者，可评估29例，完全反应18例，有效5例，无效6例，总反应率79.3％。9例新诊断ITP患者，3例利妥昔单抗应用时血小板＞30×10⁹/L，作为糖皮质激素/静脉免疫球其中蛋白/TPO后续维持治疗，另外6例患者，完全反应1例，有效2例，无效3例。5例持续性ITP患者，完全 反应4例，有效1例。18例慢性ITP患者，完全反应13例，有效2例，无效3例。慢性ITP患者中2例难治性ITP患者(曾行脾切除)，完全反应1例，有效1例(见表1)。出现反应时间3w～5w，中位时间4w。血小板峰值50～465×10⁹/L，平均值163×10⁹/L。持续有效时间4m～27m，中位时间16m。

表1 29例ITP患者利妥昔单抗为基础治疗的疗效

2、对糖皮质激素的反应与利妥昔单抗疗效的关系：

应用利妥昔单抗前29例中，除2例曾经应用IL-11、TPO治疗外，其余27例均曾经应用糖皮质激素，17例糖皮质激素曾有效，但大部分在激素减量后血小板降低，小部分因激素副作用而无法耐受，该部分患者在应用利妥昔单抗后完全反应12例，有效2例，无效3例。其余10例既往糖皮质激素无效ITP患者，应用利妥昔单抗后完全反应6例，部分反应3例，无效1例(见表2)。

表2 27例先前糖皮质激素治疗的ITP患者应用利妥昔单抗为基础治疗疗效

3、不良反应： 

利妥昔单抗100mg/周连用4周治疗ITP总体耐受良好。其中3例在用药过程中出现寒战、皮疹、心慌，经暂停药物，给予地塞米松、异丙嗪等治疗后，症状消失，继续完成药物治疗。1例治疗期间出现上呼吸道感染，经抗感染对症处理后好转。没有严重的不良事件如休克、严重感染、病毒性肝炎等发生。

本发明实施例中，32例ITP患者，可评估29例，完全反应18例，有效5例，总反应率79.3％，其中新诊断患者总反应率50％，持续性、慢性ITP患者总反应率高达83.9％，考虑与联合应用其他药物如TPO、IL-11、静脉免疫球蛋白、糖皮质激素相关。进一步支持利妥昔单抗与其他药物的联合在临床应用可能会取得较单药更好的效果。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法为：

步骤一、动物的选择与免疫：采用6-12周SPF级雌性Balb/c小鼠，免疫流程同血清的制备；

步骤二、将免疫后的小鼠预处理B细胞和骨髓瘤细胞通过PEG法进行细胞融合；

步骤三、采用HAT选择培养，得到杂交瘤细胞，检测细胞培养上清液，进行阳性克隆的筛选；

步骤四、进行杂交瘤细胞的克隆化；

步骤五、进行杂交瘤细胞的冻存和复苏；

步骤六、大量生产人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体。