CN104857564A - 一种引导尿道再生的功能性生物支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种引导尿道再生的功能性生物支架材料的制备方法及其应用。本发明的引导尿道再生的功能性生物支架材料的制备方法包括如下步骤：将间充质干细胞负载于由离体哺乳动物表皮制备的尿道状胶原管上，得到所述引导尿道再生的功能性生物支架材料。通过试验证明：本发明的引导尿道再生的功能性生物支架材料对尿道缺损组织有很好的修复作用，可以促进尿路再生。

Description

一种引导尿道再生的功能性生物支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种引导尿道再生的功能性生物支架材料及其制备方法，属于医用材料领域。

背景技术

胶原蛋白为生物体提供了一种机械支撑作用，维护器官与组织的完整性，保障其正常功能的行使，这对于实质性器官而言非常重要。胶原蛋白是基底膜的主要成分之一，在骨骼中超过80％的有机质是I型胶原蛋白，胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，作为细胞生长的依附与支架，能诱导上皮细胞等的增殖分化和移植。

骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)作为一种成体干细胞，为中胚层发育的早期细胞，它具有自我更新、高度增殖和在特定条件下多向分化的特性，能分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱等组织结构，还能诱导分化为心肌细胞、神经细胞、胰岛细胞等。BMSCs不仅具备潜在的免疫调节和抗炎特性，而且在组织修复的过程中具有分泌糖蛋白、生长因子等营养物质的作用，这种作用不但可以有效减少组织炎症和纤维化的发生，而且可以刺激组织的再生。BMSCs来源丰富、易于获取、体外培养扩增迅速、且具备跨胚层多向分化的能力，故被认为是组织工程较为理想的种子细胞。

外伤、狭窄、先天畸形等原因引起的尿路组织缺损，是泌尿外科常见疾病。对于这类疾病的治疗目前多采用自体材料进行修复。自体材料能够部分替代尿路的形态和功能，提高患者的健康和生活质量，但其来源都是以牺牲正常组织为代价的，这将对患者造成二次创伤。并且以这些材料修补尿路缺损并不能完全达到预期效果，术后尿瘘、再狭窄等并发症的发生比例高。因此利用功能性生物材料，重建尿路正常的形态和功能，减少手术并发症，减轻患者痛苦及经济负担，提高生活质量有着重要临床意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种引导尿道再生的功能性生物支架材料的制备方法。

本发明提供的引导尿道再生的功能性生物支架材料的制备方法包括如下步骤：将间充质干细胞负载于由离体哺乳动物表皮制备的尿道状胶原管上，得到所述引导尿道再生的功能性生物支架材料。

上述方法中，所述间充质干细胞和所述胶原管的配比为1×10⁶个：cm²。

上述方法中，所述由离体哺乳动物表皮制备的尿道状胶原管按照包括如下步骤的方法制备：将离体哺乳动物表皮依次用氢氧化钠水溶液和去污剂处理，得到胶原支架材料，再用所述胶原支架材料制成与尿道大小相符的管状支架，得到尿道状胶原管。

上述方法中，所述去污剂为吐温-80、吐温-20或TRITON-X100；所述氢氧化钠水溶液的浓度为2-5mol/L；所述吐温-80、所述吐温-20和所述TRITON-X100的质量分数均为1-5％。

上述方法中，所述离体哺乳动物表皮依次用氢氧化钠水溶液和去污剂处理包括如下步骤：

1)将所述离体哺乳动物表皮在浓度为2-5mol/L氢氧化钠水溶液中浸泡10-60分钟，得到氢氧化钠胶原支架材料；

2)将所述氢氧化钠胶原支架材料在质量分数为1-5％的吐温-80水溶液中浸泡3小时，得到胶原支架材料。

上述方法中，所述用所述胶原支架材料制成与尿道大小相符的管状支架的方法，包括如下步骤：用可吸收缝线将所述胶原支架材料缝合成与尿道大小相符的管状支架。

上述方法中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞；所述骨髓间充质干细胞具体为离体的人骨髓间充质干细胞。

上述方法中，所述哺乳动物为猪、牛、羊、马或兔；所述哺乳动物具体为牛。

本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的引导尿道再生的功能性生物支架材料。

本发明的最后一个目的是提供一种制备用于引导尿道再生的功能性生物支架的胶原管的方法。

本发明提供的制备用于引导尿道再生的功能性生物支架的胶原管的方法包括如下步骤：将离体哺乳动物表皮依次用氢氧化钠溶液和去污剂处理，得到胶原支架材料，用所述胶原支架材料制成与尿道大小相符的管状支架，得到胶原管。

上述引导尿道再生的功能性生物支架材料或由上述方法制备的胶原管在如下(1)-(5)中至少一种中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)制备修复尿道组织缺损的产品；

(2)制备促进尿道缺损组织再长的产品；

(3)制备促进尿道上皮再生的产品；

(4)制备促进尿道平滑肌再生的产品；

(5)制备促进尿道血管再生的产品。

本发明将人骨髓间充质干细胞hBMSCs按密度1×10⁶/cm²负载于管状胶原支架材料(长5cm，内径0.8cm)上，得到引导尿道再生的功能性生物支架材料。通过试验证明：本发明的引导尿道再生的功能性生物支架材料对尿道缺损组织有很好的修复作用，可以促进尿路再生。

附图说明

图1为尿道大体标本。其中，A为实验组；B为对照组，两箭头之间为修复段尿道。

图2为正常尿道、实验组修复段尿道和对照组修复段尿道的组织学对比图(HE×100，HE×400)。

图3为实验组修复段尿道人源细胞核的荧光表达情况(共聚焦显微镜×800)。其中白色箭头所指为抗人源细胞核抗体染色阳性的细胞。

图4为正常尿道、实验组修复段尿道和对照组修复段尿道的上皮、平滑肌、血管的免疫荧光检测比对(共聚焦显微镜×400)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

鼠抗人源细胞核(anti-human nuclei)IgG单抗、鼠抗广谱细胞角蛋白(pancytokeratin AE1/AE3)IgG单抗、鼠抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)IgG单抗、兔抗血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)IgG单抗、Alexa Fluor标记的羊抗鼠IgG二抗、Alexa Fluor标记的羊抗兔IgG二抗，均是美国Molecular Probes公司的产品。

激光共聚焦显微镜是德国L-eica公司的产品。

实施例1、引导尿道再生的功能性生物支架材料的制备方法

一、胶原管的制备

1、胶原支架材料的制备

本发明的胶原支架材料是一种杀灭细菌、病毒及疯牛病等病原体的胶原支架材料，是将牛皮肤依次用氢氧化钠溶液和去污剂处理后得到的产品。具体步骤如下：

(1)剥取牛(猪、牛、羊、马或兔等哺乳动物)的体表皮肤，得到离体的表皮；

(2)机械处理掉离体的表皮下附带成分(如肌肉、脂肪等)，并用去离子水清洗表皮，得到清洗后的表皮；

(3)将清洗后的表皮用5mol/L氢氧化纳溶液，处理40分钟；

(4)重复步骤(3)1-3次，得到氢氧化纳溶液处理后的表皮；

(5)将氢氧化纳溶液处理后的表皮用去污剂-质量分数为5％的吐温-80(去污剂可为质量分数为1-5％的吐温-80、吐温-20、TRITON-X100或其它化学去污剂)处理3小时，得到去污剂处理的表皮；

(6)用去热原水对去污剂处理的表皮充分清洗，去掉化学成分残留，得到胶原支架材料，将其保存于生理盐水中；

(7)置换新的生理盐水漂洗2小时；

(8)放置冻干机冷冻干燥；钴源照射，密封保存。

2、胶原管的制备

将步骤1制备得到的胶原支架材料制成规格为5cm×3cm的长方形膜片，厚度为0.2cm，并根据预实验中所测得的犬尿道大小，用3-0可吸收缝线将胶原材料连续缝合，形成长为5cm、内径为0.8cm的管状支架即胶原管。

二、骨髓间充质干细胞的分离与培养

1、密度梯度离心法分离BMSCs细胞

将1-2ml狗的骨髓缓慢加入到比重为1.077g/L的等量的淋巴细胞分离液(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)中，尽量保持液面不被破坏。室温2000rpm，离心20min，离心管内液体分为3层。取中间层MSCs，加5ml的PBS液中(购自GIBCO公司)，室温1200rpm，离心洗涤6min，弃上清，取沉淀。

2、接种和扩增培养

(1)用含10％FBS、90％L-DMEM、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素的干细胞培养基调节步骤1得到的沉淀中的细胞密度。然后将6×10⁷个骨髓有核细胞接种到T25的塑料培养瓶中，在37℃、5％CO₂、95％饱和湿度的培养箱中培养。

(2)原代接种后24-48小时，除去未贴壁的造血细胞，用PBS液洗涤，半量换液。以后每隔2～3天换液1次。

(3)当细胞达70％～80％汇合时，用PBS液将培养的细胞洗2遍，加入0.25％胰酶(含0.01％EDTA)消化液，室温消化，显微镜下观察，待细胞由梭形变为圆形时，用含血清培养液或血清终止胰蛋白酶的作用。

(4)用吸管轻轻吹打培养瓶的细胞贴附面，使细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细胞悬液。

(5)将细胞悬液接种到新的培养瓶中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。待传代的细胞生长密度达到80％～90％时，即可按照1：2或者1：3的比例再次传代。

(6)将hBMSCs细胞经传代培养扩增至第2代时，制成数量为1.5×10⁷的细胞悬液备用。

3、冻存

(1)收集对数期的步骤2获得的细胞悬液(24h前换液一次)，显微镜下观察细胞密度及状态是否良好。

(2)将对数期的细胞用PBS液洗2遍，加入0.25％胰酶(含0.01％EDTA)室温消化至细胞由梭形变为圆形时，用血清终止胰蛋白酶的作用，吸管轻轻吹下贴壁细胞，吹打成悬液，转移至新的15ml离心管中。

(3)1200rpm离心6分钟，弃上清，轻弹管底以打散细胞，加入PBS液吹打均匀。取出少量培养液稀释至适当倍数用血球计数板计数，将剩余细胞重复上述离心操作。

(4)弃上清，轻弹管底以打散细胞，用含10％血清的二甲基亚砜重悬细胞，用吸管轻轻吹打均匀，分装至冻存管中，使细胞浓度在2×10⁶/ml左右。

(5)旋紧冻存管盖，用封口膜封口，标记好名称及日期。将细胞置于梯度降温盒中，于-80℃放24小时，之后转入液氮中备用。

三、可引导尿道再生的生物材料的制备

将步骤二培养后的hBMSCs按密度1×10⁶/cm²负载于步骤一制备的胶原管上，得到hBMSCs-胶原支架材料即引导尿道再生的功能性生物支架材料。

实施例2、引导尿道再生的功能性生物支架材料在修复尿道组织缺损中的应用

一、试验动物与分组

试验动物为雄性比格犬(12月龄，体重12±1.5kg)10只，随机分成两组，每组各5只。实验组：实施例1制备的引导尿道再生的功能性生物支架材料；对照组：实施例1中步骤一制备的胶原管。

二、试验方法

分别用实施例1中制备得到的引导尿道再生的功能性生物支架材料和实施例1中步骤一制备的胶原管对犬缺损尿道进行组织修复，术后六个月处死比格犬，观测引导尿道再生的生物材料在犬组织工程尿道再生中的作用。

1、缺损尿道的制备方法

人为手术处理：3％的戊巴比妥钠溶液(Merck公司，德国)按1ml/kg腹腔注射麻醉实验犬。会阴部备皮，常规消毒铺巾。取会阴部倒“V”字形切口，切开皮肤及皮下组织，游离并切除阴茎骨近侧尿道组织，长度为5cm，得到缺损尿道。

2、对缺损尿道进行修复的方法

用3-0可吸收缝线将实施例1中制备得到的引导尿道再生的功能性生物支架材料与尿道远近端吻合，放置8F多孔硅胶尿管支撑尿道并引流膀胱；再用1-0丝线逐层缝合海绵体肌、皮下组织及皮肤，最后用1-0丝线将尿管末端缝合固定于包皮上。

三、试验结果

1、标本观察

采集2组犬的尿道标本进行观察，结果如图1所示。结果表明：与对照组相比，实验组修复段尿道比较柔软，有一定弹性；尿道标本纵行剖开后观察，实验组尿道腔较正常尿道腔狭小，但构成一完整腔道，黏膜面光滑红润；而对照组黏膜面粗糙苍白，修复段尿道未形成一完整腔道，明显狭窄，甚至完全闭锁。

2、组织学观察

将实验组再生后的尿道中心处离断标本，将标本一分为二，一半标本置于4％中性甲醛中固定24h，石蜡包埋，连续切片，片厚2.5μm，脱蜡，常规苏木精-伊红染色(HE染色)，镜下观察再生尿道的组织结构；另一半标本采集后立即进行冰冻切片，共下述步骤3使用。

HE染色观察结果如图2所示：实验组修复段尿道被覆完整的黏膜上皮层，约6-7层，细胞排列规则，与正常尿道上皮相近；对照组修复段尿道被覆不连续的黏膜上皮层，细胞层数少，细胞排列不规则，多数部位仅有单层上皮细胞覆盖。两组尿道黏膜下均以纤维组织生长为主，平滑肌生长不明显，实验组可见少量口径较小的新生血管，对照组新生血管罕见。

3、免疫荧光检测人源细胞核

上述另一半标本采集后立即行冰冻切片，片厚5μm，用4％多聚甲醛室温下固定10min后，用PBS液清洗后加入3％双氧水(H₂O₂)室温下作用10min，再用0.3％TritonX-100透膜处理20min；10％山羊血清封闭非特异抗原20min，PBS液清洗后滴加鼠抗人源细胞核IgG一抗(1：100)，放入湿盒中4℃过夜孵育，次日加Alexa Fluor标记的羊抗鼠IgG二抗(1：100)作用30min，DAPI染核10min，激光共聚焦显微镜下观察。

尿道中人源细胞核表达情况如图3所示：Anti-human nuclei IgG单抗检测尿道标本后发现，实验组再生尿道中存在抗人源细胞核抗体荧光染色阳性的细胞，主要分布于粘膜下组织中，粘膜层几乎没有。表明人BMSCs可以在犬体内存活，并发挥一定作用。

4、免疫荧光检测尿道组织成分

分别用pan cytokeratin AE1/AE3(1:100)、α-SMA(1:200)、vWF(1:400)IgG单抗检测实验组和对照组的尿道标本中上皮、平滑肌、血管的再生情况，具体方法同上。激光共聚焦显微镜下观测三种组织成分的荧光染色，并用Image-Pro Plus软件定量计算两组尿道上皮、平滑肌、血管的平均荧光密度值，每张切片随机取10个高倍视野进行计算，取均值。

免疫荧光结果如图4和表1所示：实验组尿道上皮再生效果显著优于对照组(P＜0.01)，与正常尿道上皮无差异(P＞0.05)；实验组尿道平滑肌、血管的再生虽优于对照组(P＜0.01)，但与正常尿道相比，差距显得很大(P＜0.01)，再生能力相当有限。

表1正常尿道、实验组、对照组修复段尿道组织各成分的平均荧光密度值(x±s，n＝10)

综合以上试验结果表明：本发明的引导尿道再生的功能性生物支架材料可以对尿道损伤进行有效的修复。

Claims (10)

1.一种引导尿道再生的功能性生物支架材料的制备方法，包括如下步骤：将间充质干细胞负载于由离体哺乳动物表皮制备的尿道状胶原管上，得到所述引导尿道再生的功能性生物支架材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞和所述胶原管的配比为1×10⁶个：cm²。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述由离体哺乳动物表皮制备的尿道状胶原管按照包括如下步骤的方法制备：将离体哺乳动物表皮依次用氢氧化钠水溶液和去污剂处理，得到胶原支架材料，再用所述胶原支架材料制成与尿道大小相符的管状支架，得到尿道状胶原管。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述去污剂为吐温-80、吐温-20或TRITON-X100；

所述氢氧化钠水溶液的浓度为2-5mol/L；

所述吐温-80、所述吐温-20和所述TRITON-X100的质量分数均为1-5％。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述离体哺乳动物表皮依次用氢氧化钠水溶液和去污剂处理包括如下步骤：

1)将所述离体哺乳动物表皮在浓度为2-5mol/L氢氧化钠水溶液中浸泡10-60分钟，得到氢氧化钠胶原支架材料；

2)将所述氢氧化钠胶原支架材料在质量分数为1-5％的吐温-80水溶液中浸泡3小时，得到胶原支架材料；

所述用所述胶原支架材料制成与尿道大小相符的管状支架的方法，包括如下步骤：用可吸收缝线将所述胶原支架材料缝合成与尿道大小相符的管状支架。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞；所述骨髓间充质干细胞具体为离体的人骨髓间充质干细胞。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述哺乳动物为猪、牛、羊、马或兔；所述哺乳动物具体为牛。

8.权利要求1-7中任一所述的方法制备得到的引导尿道再生的功能性生物支架材料。

9.一种制备用于引导尿道再生的功能性生物支架的胶原管的方法，包括如下步骤：将离体哺乳动物表皮依次用氢氧化钠溶液和去污剂处理，得到胶原支架材料，再用所述胶原支架材料制成与尿道大小相符的管状支架，得到胶原管。

10.权利要求8所述的引导尿道再生的功能性生物支架材料或由权利要求9所述的方法制备的胶原管在如下(1)-(5)中至少一种中的应用：

(1)制备修复尿道组织缺损的产品；

(2)制备促进尿道缺损组织再长的产品；

(3)制备促进尿道上皮再生的产品；

(4)制备促进尿道平滑肌再生的产品；

(5)制备促进尿道血管再生的产品。