CN104856906B - 一种防腐组合物及其在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种防腐组合物，其含有丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物、山梨坦辛酸酯中任意两种或以上的组合。该组合物对多种细菌、真菌均具有抑杀作用。尤其适用于化妆品中的是，其不会引起皮肤过敏或色素沉积、肤色变黄等问题。本发明同时公开了含有该防腐组合物的化妆品。

Description

一种防腐组合物及其在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于天然产物领域/化妆品领域，涉及一种具有防腐/抑菌效果的组合物。

背景技术

由于化妆品中含有多种营养物质，在生产、储存和使用中，极易受到微生物的污染，继而导致产品出现浑浊、沉淀、颜色变化、发泡、变味等变质现象，产品一旦变质，一些功效组分可能被分解成对人体皮肤刺激物质，使得产品的商业价值丧失。若是化妆品受到致病菌污染，此类病原微生物及其代谢产物将影响人体健康。因此，添加适量的防腐剂具有重要意义，可有效防止产品受到微生物污染和增殖，保证化妆品的安全和卫生质量。

防腐剂不仅需要防止和抑制微生物的生长，必须对人体无毒性和刺激性，同时和配方中的其他化学成分不发生反应，在不同体系中能保持稳定发挥防腐功效。目前化妆品中添加的最常见防腐剂主要有尼泊金酯类、醇类防腐剂如苯甲醇、凯松系列及其衍生物如甲基异噻唑啉酮、甲醛释放体系列如咪唑烷基脲等种类。但是现在许多传统防腐剂被报道出对人体健康具有一定的负面影响，如尼泊金甲酯酯类苯环的亲脂性可能在脂肪组织中累积；苯氧乙醇在使用量大时会引起皮肤刺激；甲醛释放体可能导致致癌；有机卤化物具有致敏性等，争议随之而来。随着科学技术和经济发展，消费者对化妆品的成分的关注度越来越高，致力追求绿色天然产品，从而市场对产品安全性要求更加严格。所以，从天然动植物来源成分中寻找温和、无刺激、安全和高效的防腐剂，对实现“无防腐”和“无添加”化妆品体系具有广阔的应用前景。

具有抑菌作用的天然产物已受到较多研究人员的关注。目前，被研究证实具有抑菌功能的天然提取物种类繁多，例如，丁香提取物、薄荷提取物、艾叶提取物、生姜提取物、紫苏提取物、黄芪提取物、肉桂提取物、真菊提取物、青蒿提取物、辣椒提取物、花椒提取物、银杏提取液、黄连提取物、绿茶提取物、桑叶提取物、迷迭香提取物、鹿蹄草提取物、柚皮提取物、柠檬精油、茶树精油等等。

化妆品中的常见致病菌包括，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherchia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、黑曲霉(Aspergillusniger)、白色念珠菌(Candida albicans)等等。其中，白色念珠菌是化妆品中受到较多关注的菌种，因为该菌容易存在于化妆品中，且为常见的致病菌，可以侵害皮肤、粘膜等。在利用天然产物抑制白色念珠菌方面，已有研究(王彩瑞4种中药提取物体外抗白色念珠菌的敏感性研究，大连医科大学，2010年)表明盐酸小檗碱的抑菌作用最强，而丁香酚对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)值为199.50～399.00μg/mL。

尽管具有抑菌功能的天然产物已被应用于多种对安全性要求较高的产品例如食品、保健品等，然而，在化妆品中的应用则相对较少，主要的原因在于：其一、与食品、保健品一类被直接摄入进行肠胃消化吸收的产品不同，化妆品将产品直接涂抹于皮肤上，通过皮肤进行吸收，其中所含的色素、色素酶等可能会影响皮肤颜色，产生暗黄、色素沉淀、色素脱失等不利影响；其二，有些抗菌天然产物可能引起皮肤过敏，这也是限制其利用的原因之一。

因此，在考虑天然产物抑菌有效性的同时，需要同时考虑其对皮肤的不良影响，这是开发有前景的化妆品天然抑菌产品的前提条件。

发明内容

本发明的主要目的之一在于提供一种可以应用于化妆品中的防腐组合物。

本发明的目的之二在于提供一种含有天然防腐成分的化妆品，或者一种不含化学性防腐成分的化妆品。

发明通过以下方案实现：

首先，发明人在筛选了多种具有抑菌作用的天然产物，同时研究了多种复配的组合物之后，提供了一种对皮肤较为温和有利的组合物，实验证实其十分适合于添加在化妆品中。该组合物含有以下成分：

丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物、山梨坦辛酸酯中任意两种或以上的组合。

丁香提取物主要是挥发油，含丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯、水杨酸甲酯、甲基正庚基酮、苯甲醛、乙酸苄酯等有效成分。对汉逊氏酵母、青霉、黑曲霉、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌有很强的抑菌作用；同时具有抗氧化清除自由基、消炎和促透皮吸收等功能。吴传茂等(丁香提取物的抑菌作用研究湖北工学院学报，2000，(1))对丁香提取液的抑菌作用进行了研究，发现丁香提取液对汉逊氏酵母、青霉、黑曲霉、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌有很强的抑菌作用。最低抑菌质量浓度为3.125～12.5mg/mL，活性pH4～6.5，在100℃以内对热稳定。舒友菊等(几种植物天然提取物的抑菌作用研究食品工业科技，2010,31(10):89-91)的研究同样发现，丁香提取物对金黄色葡萄球菌、青霉菌的抑菌效果较好，然而，据其报道，丁香对大肠杆菌的抑菌作用则较弱，当丁香提取物以0.782％的浓度存在时，大肠杆菌仍可以生长。

银杏提取物的主要成分是银杏黄酮、银杏酸、银杏内酯、水溶性多糖、萜类、多种氨基酸以及多种微量元素等有效成分。已有的研究表明，银杏提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和霉菌等具有很好的抑菌性能；同时具有清除自由基和抗氧化、消炎和洁肤功效。

黄连提取物含有小檗碱，以及黄连碱、甲基黄连碱和棕榈碱等多种生物碱，具有良好的抗菌和消炎效果，既对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌也有较强的抑制作用，也对一些真菌如酵母菌、毛霉和黑曲霉等有一定的抑制作用。申请号201410384962.1的中国专利申请公开了一种中药活性物组合物及其在化妆品的应用，该组合物包括苦参提取物、甘草提取物、黄柏提取物、黄连提取物、黄芩提取物、白芍提取物、白术提取物、马齿苋提取物，可对皮肤干燥、发红、瘙痒、湿疹等症状具有抑制和改善的功效。

山梨坦辛酸酯是天然可再生资源来源，从小麦或谷物分离的山梨醇加成生成山梨聚糖，与椰子油或棕榈油中分离的辛酸反应生成的化合物。具有防腐作用，易生物降解，具有很好的毒理学数据的产品，既非甲醛释放体和不含卤素的产品，也是低气味非挥发性液体，已通过认证可在全球范围内安全使用。

上述提取物均是已被报道的具有抑菌效果的天然产物。它们可通过常规的方式进行提取。为了方便应用于化妆品中，提取物以提取液的形式利用，或者也可以将粉末状提取物通过溶解而得。采用原料进行提取的提取液，均可以适用。

作为一种非限制性的实施例，所述提取物例如为：

丁香提取液，以植物香辛料丁香花为原料，水或水-乙醇萃取得到的提取液。

银杏提取液：以中草药银杏叶为原料，水或水-丙二醇萃取得到的提取液。

黄连提取液：以中草药黄连为原料，水萃取得到的提取液。

作为一种优选的实施方案，所述的组合物同时含有丁香提取物和山梨坦辛酸酯；进一步优选地还含有银杏提取物或黄连提取物中的一种。

作为一种更加优选的实施方案，所述组合物同时含有丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物和山梨坦辛酸酯。

在本发明的一个实施方案中，防腐组合物含有丁香提取物和山梨坦辛酸酯，丁香提取物所提供的丁香酚在组合物中的含量大于等于0.3mg/mL，山梨坦辛酸酯的质量分数7.5％。

在本发明的另一个实施方案中，防腐组合物含有丁香提取物、山梨坦辛酸酯和银杏提取物，丁香提取物所提供的丁香酚在组合物中的含量大于等于0.26mg/mL，山梨坦辛酸酯的质量分数5％，银杏提取液所提供的银杏黄酮在组合物中的含量大于等于1.66mg/mL。

在本发明的另一个实施方案中，防腐组合物含有丁香提取物、山梨坦辛酸酯和黄连提取物，丁香提取物所提供的丁香酚在组合物中的含量大于等于0.26mg/mL，山梨坦辛酸酯的质量分数5％，黄连提取液所提供的小檗碱在组合物中的含量大于等于0.2mg/mL。

在本发明的一个实施方案中，所述的丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物分别为丁香提取液、银杏提取液、黄连提取液。

丁香提取物所提供的丁香酚在组合物中的含量为大于等于0.06mg/mL，银杏提取物所提供的银杏黄酮在组合物中的含量大于等于0.2mg/mL，黄连提取液所提供的小檗碱在组合物中的含量大于等于0.06mg/mL，山梨坦辛酸酯在组合物中的质量分数大于等于2％；优选地，丁香提取物所提供的丁香酚在组合物中的含量为大于等于0.1mg/mL，银杏提取物所提供的银杏黄酮在组合物中的含量大于等于0.31mg/mL，黄连提取液所提供的小檗碱在组合物中的含量大于等于0.07mg/mL，山梨坦辛酸酯在组合物中的质量分数大于等于2.5％；进一步优选地，所述的丁香酚在组合物中的含量为0.15～0.2mg/mL，银杏黄酮在组合物中的含量0.375～0.5mg/mL，小檗碱在组合物中的含量为0.1～0.15mg/mL，山梨坦辛酸酯在组合物中的质量分数6.25％～10％。

作为一种可选的方案，上述的丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物在组合物中的配比，以提取原料干重计为：丁香1～3份:银杏1～5份:黄连1～3份。优选地，为2～2.5份:4～5份:2～2.5份。

发明人经过实验发现，上述组合物，对细菌、霉菌、酵母等多种类型的微生物菌具有抑杀作用。尽管根据现有技术来看，各种天然产物作为单一成分来看，其在抑菌方面的作用根据不同的微生物而异。然而，发明人发现上述天然产物的组合物，可形成较好的协同作用，对多种细菌、真菌均具有良好的抑杀作用。其可作为细菌和真菌的广谱通用的抗微生物体系配方，特别是对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母、黑曲霉、白色念珠菌在化妆品中生长具有良好的抑制作用。在以可接受的量添加于化妆品中之后(例如，以1％～5％(w/w)的量存在于化妆品中)，进行加菌28天微生物挑战性试验，结果显示其对细菌、霉菌、酵母均具有良好的抑杀作用。

本发明同时提供了一种化妆品，其含有如权利要求1所述的防腐组合物。优选地，所述防腐组合物在化妆品中的质量分数为1％～5％；优选2.5％～5％。该组合物在化妆品中应用pH范围为4～9，优选5～8。

本发明最为突出的特点在于，该组合物不仅作为天然的广谱抗菌物质，并且，该天然产物组合物适于长期涂抹于皮肤上，包括脸部皮肤，其不会引起色素沉着或肤色暗黄，也不会引起皮肤的不适感或者过敏反应。相比之下，姚淑敏等(黄芪提取物对细菌抑制作用研究食品科学，2006,27(08):90-93)的研究同样发现，黄芪提取物对常见细菌如大肠杆菌具有较好的抑制作用，然而，发明人发现这种天然产物在连续7天，每天两次涂抹于皮肤上之后，出现涂抹区域肤色变暗的不利影响。将柠檬精油涂抹于皮肤，4小时内在阳光下暴露皮肤易产生色素沉积。因此黄芪提物和柠檬精油等则不适宜作为化妆品的防腐添加剂。同样茶树精油、花椒提取物和肉桂提取物等也不适宜作为化妆品的防腐添加剂，因为发明人发现这些天然产物在涂抹于受试者皮肤上之后，小部分受试者皮肤出现红斑、瘙痒等过敏反应。通过在大量的天然产物中进行筛选和皮肤测试，发明人发现了若干种较为适应皮肤使用的天然产物，其中丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物的组合使用可以在低添加量的情况下获得较好的协同性抑菌效果，并且适用于皮肤的长期使用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的防腐组合物由多种天然植物提取液和一种植物原料合成物配伍使用。根据中草药提取物的不同抗菌性能，以及植物原料合成物的协同增效防腐作用，配伍具有良好抗细菌和真菌的体系配方，可安全应用于化妆品中，替代传统化学防腐剂，将产品对人体健康的风险降至最低的。

本发明所提供的防腐组合物可以有效量应用于化妆品中，此时对该化妆品的长期使用不会带来色素沉着或肤色变黄等负面作用，相反地，发明人在进行了肤色影响实验后发现该组合物的使用可以使得皮肤亮白。

本发明所提供的防腐组合物对皮肤低致敏，可作为低敏性的护肤品使用。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。实施例作为非限制性的例子，并非对本发明保护范围的限制。

实施例1组合物抑菌实验

1.材料

1.1试验材料

丁香提取液、银杏提取液和黄连提取液均为本实验室按以下方法提取获得。

丁香提取液：以植物香辛料丁香花为原料，水或水-乙醇萃取得到的提取液。将丁香的干燥中药材粉碎过100目筛，按照15mL提取溶剂每克丁香的比例，以85％的乙醇为提取溶剂，85℃保温提取2h，离心、过滤，收集滤液，记为第一道滤液；滤渣按照每克滤渣10mL提取溶剂的比，以浓度70％乙醇为提取溶剂，80℃保温提取3h，离心、过滤，收集滤液，记为第二道滤液；合并第一道滤液和第二道滤液，经旋转蒸发，浓缩除去乙醇，用0.45μm滤膜滤过，得到丁香提取液。按照此方法提取的丁香提取液为棕色粘稠液体，其中丁香酚的含量为0.4～0.8mg/mL。

银杏提取液：以中草药银杏叶为原料，水或水-丙二醇萃取得到的提取液。将银杏的干燥中药材粉碎过100目筛，按照20mL提取溶剂每克银杏的比例，以70％的丙二醇为提取溶剂，150℃微波萃取2h，离心、过滤，收集滤液，记为第一道滤液；滤渣按照每克滤渣10mL提取溶剂的比，以浓度70％丙二醇为提取溶剂，150℃微波萃取3h，离心、过滤，收集滤液，记为第二道滤液；合并第一道滤液和第二道滤液，经旋转蒸发，浓缩除去丙二醇，得到银杏提取液，可按实际需要用去离子水稀释使用。按照该方法提取得到的银杏提取液为琥珀色偏棕色液体，其中银杏黄酮在提取液中的含量1.25～2mg/mL。

黄连提取液：以中草药黄连为原料，水萃取得到的提取液。将黄连的干燥中药材粉碎过60目筛，按照10mL提取溶剂每克黄连的比例，以去离子水为提取溶剂，100℃保温提取4h，离心、过滤，收集滤液，记为第一道滤液；滤渣按照每克滤渣10mL提取溶剂的比，以去离子水为提取溶剂，100℃保温提取3h，离心、过滤，收集滤液，记为第二道滤液；合并第一道滤液和第二道滤液，经旋转蒸发，浓缩除去水分，得到黄连提取液。按照该方法提取得到的黄连提取液为棕黄色透明液体，其中小檗碱在提取液中的含量为0.3～0.6mg/mL。

山梨坦辛酸酯为市售原料，购于Clariant公司。

1.2受试菌株：购自广东省微生物研究所

细菌：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：ATCC6538

大肠杆菌(Escherchia coli)：ATCC8739

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)：ATCC9027

真菌：

黑曲霉(Aspergillus niger)：ATCC16404

白色念珠菌(Candida albicans)：ATCC10231

1.3供试培养基

真菌培养基：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)或孟加拉红培养基，115℃高压灭菌30min后制成斜面或平板备用。

细菌培养基：营养琼脂培养基或卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，121℃高压灭菌20min后制成平板或斜面备用。

1.4菌悬液的制备

将各细菌(金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌)分别接种至营养琼脂斜面，于37℃恒温培养箱中培养18h～24h，加入3mL无菌生理盐水吹打斜面洗涤细胞，充分混匀后，调节菌悬液浓度为1.0～5.0×10⁸cfu/mL备用。将黑曲霉和白色念珠菌接种至马铃薯葡萄糖培养基斜面，于28℃恒温培养箱中分别培养72h～96h和24h～48h，加入3mL无菌生理盐水吹打斜面洗涤细胞，充分混匀制成1.0～5.0×10⁷cfu/mL浓度的菌悬液，于4℃贮存备用。

1.5不同浓度下各个单一组分及组合物的抑菌试验

采用滤纸片扩散法，将滤纸用打孔器制成直径5mm的圆形滤纸片，置于干净的小烧杯，121℃灭菌20min烘干后，分别放入不同浓度丁香提取液、银杏提取液、黄连提取液和山梨坦辛酸酯及其组合物中充分浸泡。将已灭菌营养琼脂或PDA培养基分别倒入培养皿中，待冷却凝固，吸取上述各细菌或真菌菌悬液0.1mL均匀涂布于平板上。然后用无菌镊子夹取各组分浸泡过的圆形滤纸片贴于含菌平板上，每个平板等距离贴4片，其中以1片无菌水浸泡的滤纸片作为空白对照，将各培养皿相应的置于37℃或28℃恒温培养箱中倒置培养18h或48h，测量各菌株在单一组分和组合物的不同浓度的抑菌圈直径的大小，每个样品2个重复，取其平均值。

1.5.1不同浓度下各单一组分抑菌能力大小

根据实验设计按表1对所得的4个组分进行稀释或浓缩制备，测试不同浓度下各单一组分对各细菌和真菌抑菌能力的大小。

表1.各组分浓度表

注：表1中各组分丁香提取液、银杏提取液和黄连提取液的浓度分别是指丁香酚、银杏黄酮和小檗碱在提取液中的含量，可根据具体情况将原液进行适当稀释或浓缩达到所需数值。

根据不同浓度的单一组分对各菌株抑菌圈直径(单位为mm)大小实验结果可知(如表2所示)，丁香提取液、银杏提取液、黄连提取液和山梨坦辛酸酯对各菌株均有一定的抑菌效果，且组分浓度越高，抑菌效果更优良。其中，丁香提取液、银杏提取液、黄连提取液和山梨坦辛酸酯各单一组分分别在浓度为0.8mg/mL、5mg/mL、0.6mg/mL和15％(w/w)时，抑菌效果很明显。

表2.不同浓度单一组分对各菌株抑菌圈的大小

注：三次重复实验；抑菌圈直径≤7mm，抑菌效果不明显；抑菌圈直径≥7mm，抑菌效果明显。

1.5.2不同浓度组合物与单一组分的抑菌效果比较

将浓度分别为0.8mg/mL、5mg/mL、0.6mg/mL的丁香提取液、银杏提取液和黄连提取液(以丁香酚、银杏黄酮和小檗碱的含量计)以及山梨坦辛酸酯溶液15％(w/w)的各单一组分，按照1:(0～1):(0～1):(0～1)的体积比直接混合，配制成测试组合物观察抑菌效果，与单一组分丁香提取液抑菌效果比较。由测试结果(如表3所示)发现单一组分丁香提取液的抑菌效果均弱于任一两种组分组合、三种组分组合和四种组分组合的组合物抑菌效果，其中四种组合物抑菌效果最佳。由此说明丁香提取液、银杏提取液、黄连提取液和山梨坦辛酸酯溶液的不同组分之间有协同作用，且四种组分组合使用能发挥最佳的协同抑菌作用。

表3.组合物和单一组分对各菌株抑菌圈的大小

注：三次重复实验；抑菌圈直径≤7mm，抑菌效果不明显；抑菌圈直径≥7mm，抑菌效果明显。

由表3的结果可知，当组合物中同时含有丁香提取物、山梨坦辛酸酯时(组d、f、g)，对多种微生物均呈现出较为均衡的良好抑菌能力，抑菌圈大小均大于等于8，最高达13。当组合物同时含有丁香提取物、山梨坦辛酸酯，并且还含有黄连提取物或银杏提取物中的一种时(组f、g)，该类组合物多种微生物的抑菌圈均能达到9以上，具有更可靠的防腐能力。最优的配方为组合物同时含有丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物、山梨坦辛酸酯四种组分(组h)，尽管此时四种溶液复配一定程度上对每种有效成分进行了高达4倍的稀释倍数，然而，复配后的溶液对多种细菌的抑菌圈均达到10或以上，最高达15。

与表2相比，复配的组合物的抑菌圈明显大于单一组分，表现出明显的协同效应，且对比单一组分来说尤其优越的是，单一组分存在对某些菌种抑菌能力不足的弱势，而复配的组合物对多种菌种均呈现均衡的良好抑菌能力。

实施例2化妆品添加试验

2.1将丁香提取液、银杏提取液和黄连提取以及山梨坦辛酸酯4个组分，按分别为0.8mg/mL、2mg/mL、0.6mg/mL的丁香提取液、银杏提取液和黄连提取液(以丁香酚、银杏黄酮和小檗碱的含量计)以及山梨坦辛酸酯溶液15％(w/w)，按照2:1:2:1的体积比直接混合，配制成的组合物。按照1％～5％(w/w)添加化妆品中，优选2.5％～5％，配方如表4或表5：

表4.O/W乳化型化妆品膏霜(样品1)配方

原料名称	添加量(质量比)
		A：十六/十八醇	2
单甘脂	1
		硬脂酸	3
白油(26#)	6
		十四酸异丙酯IPM	4
防腐组合物	2
		Span-60	1
B：EDTA-2Na	0.05
		甘油	5
Tween-60	2
		1％透明质酸钠	3
1,3-丁二醇	5
		去离子水	To 100
C：香精	适量

表5.O/W乳化型化妆品乳液(样品2)配方

原料名称	添加量(质量比)
		A：十六/十八醇	1
聚二甲基硅氧烷	2
		GTCC(辛酸/癸酸甘油三酯)	3
角鲨烷	2
		Span-60	1
B：EDTA-2Na	0.05
		甘油	5
Tween-60	2
		1％透明质酸钠	3
1,3-丁二醇	5
		卡波940	0.1
PC2000	0.1
		去离子水	To 100
C：香精	适量
		防腐组合物	5

制备所述应用样品1和2化妆品的方法，所述化妆品的原料组成包括油相、水相和本发明所述的防腐组合物，该方法包括：

先使化妆品原料的油相和水相进行初步乳化，调整该乳化体系的温度，降温至35～40℃，再防腐组合物(如配方中有其他添加相如营养、功能性成分，在此步骤中加入其他添加相)，体系经搅拌均匀，进一步降温后根据配方要求完成操作。

2.2微生物挑战性试验方法：

采用一次加菌28天微生物挑战性试验，选用如实例1的5种受试菌株，参照美国药典USP32<51>微生物防腐挑战性试验方法。分别称取100g上述样品1和样品2作为测试样品，装入无菌塑料瓶内，分别加入适量的混合菌悬液，使每克样品最终含细菌量为1.0×10⁶～5.0×10⁶cfu/g，霉菌酵母菌量为1.0×10⁵～5.0×10⁵cfu/g充分混匀。在接种第0时、第1天、第3天、第7天、第14天、第21天和第28天取样进行菌落计数分析：准确称取10g样品，加到已灭菌玻璃珠和90mL生理盐水的锥形瓶内，充分振荡混匀，此悬液为1:10稀释液，然后再用生理盐水按1:10依次稀释，取各稀释梯度菌液1mL加入至平板中，再倾注15mL已灭菌卵磷脂吐温-80营养琼脂或孟加拉红培养基，待琼脂冷却凝固，分别将细菌平皿于37℃下倒置培养48h，霉菌和酵母平皿于28℃下倒置培养72h，计数样品中含菌量。

2.3评价标准：

初始接种量细菌10⁶cfu/g～10⁷cfu/g，霉菌10⁵cfu/g～10⁶cfu/g：①第28天时，样品中含细菌或霉菌＞10³cfu/g，该样品不能通过微生物防腐的挑战试验，表明样品的防腐体系不能有效地起到抑制微生物的作用，产品在生产、贮藏和使用中很容易受到微生物的污染。②第28天时，样品中含细菌或霉菌在10²cfu/g～10³cfu/g，该样品有条件地通过挑战试验，即当产品中蛋白质或其他动植物材料成分不是特别高，同时生产的卫生环境符合要求，包装物不易发生二次污染时，该防霉体系可以使用，否则不能。③第28天时，样品中含细菌或霉菌在10cfu/g～10²cfu/g，表明该样品的防腐体系对微生物有较强的抑杀效果，通过挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时不容易受到微生物污染。④从第7天起，样品中的细菌或霉菌＜10cfu/g，说明该样品的防腐体系对微生物有特强的抑杀作用，通过挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时很不容易被微生物污染。

2.4结果分析：

根据微生物防腐挑战性实验结果(如表6所示)，2个防腐体系的样品进行的微生物挑战试验结果表明：防腐组合物在化妆品中能通过挑战试验。由此可见，根据本发明中的防腐组合物加入至化妆品配方中能发挥良好的抗菌功效。

表6.微生物防腐挑战性实验结果

实施例3皮肤刺激实验

3.1不同浓度组合物的人体皮肤斑贴试验

人体斑贴试验检验受试物引起人体皮肤不良反应的可能性。参考GB17149.1-1997《化妆品皮肤病诊断标准及处理原则总则》、GB17149.2-1997《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》和《2007年版化妆品卫生规范》标准，按受试者入选标准选择参加试验30名人员，年龄为22-35岁。

将实例1.5.1中不同浓度各单一组分溶液和实施例2中组合物共17个样品作为受试物，用量约250μL放入斑试器内，对照孔为空白对照(不置任何物质)。将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。分别于去除受试物斑试器后30min(待压痕消失后)、24h和48h观察皮肤反应。

3.2实验结果

经3个时间段测试观察，统计结果得到30例受试者对17个样品均未出现(1级皮肤不良反应的人数多于5例、或2级皮肤不良反应的人数多于2例、或出现任何1例3级和或出现3级以上皮肤不良反应)的此类情况，因此可以判定组合物不会对人体皮肤有不良反应。通过此试验结果可以得出该组合物对人体安全性很高，未对人体皮肤引起不良反应。

实施例4对皮肤颜色影响实验

4.1色素实验

将丁香提取液、银杏提取液和黄连提取液以及山梨坦辛酸酯4个组分，按照1:2:1:1、2:1:2:1和1:3:3:2的体积比直接混合，配制成E、F、G三种组合物，各组分配置前的浓度如表7所示。根据组合物在化妆品中的添加量为1％～5％(w/w)，故三种组合物均需稀释后形成预配液再进行色素实验测试。

表7.三种组合物各组分浓度表

注：表7中各组分丁香提取液、银杏提取液和黄连提取液的浓度分别是指丁香酚、银杏黄酮和小檗碱在提取液中的含量。

Melan-α细胞经组合物处理后进行黑色素生成量分析。将处于对数生长期的Melan-α细胞，调整密度为5×10⁴个/mL后接种于6孔板中，每孔2mL，在37℃及5％CO₂下孵育24h。弃培养液后，取三种组合物预配液与浓度为60μg/mL、45μg/mL和30μg/mL安慰剂物质均各3mL，继续孵育72h，去上清液，用PBS清洗2次后，加入经0.25％胰蛋白酶1mL/孔消化，加入1.5mL培养液中止消化，制成细胞悬液，将细胞收集至离心管中，离心去上清，加入100μL浓度为1mol/L NaOH，37℃水浴1.5h，裂解细胞和溶解黑色素颗粒。加入500μL双蒸水稀释，混匀后取100μL/孔加至96孔板，每组设4个平行，在490nm波长测试1mol/L NaOH中溶解的黑色素吸光度，换算成各种总蛋白质量。得到各组分黑色素抑制率如表8所示。

表8.组合物黑色素生成抑制率

(n＝4，p<0.01)

由测试结果分析可知，Melan-α细胞在组合物和安慰剂处理培养72h后，和阴性对照组相比较，发现组合物E、组合物F和组合物G的对黑色素生成均有抑制作用，且抑制率分别为74.2％、55％和33.7％；而安慰剂对照组60μg/mL、45μg/mL和30μg/mL时，黑色素的生成抑制率分别为70.5％、44.1％、24.4％。由此可知三种组合物处理组的黑色素抑制效果比对照组更明显，说明本发明组合物有抑制黑色素生成的作用。

4.2运用仪器测试组合物对肤色的影响

使用实施例2的组合物稀释至1％～5％(w/w)作为测试样品。

4.2.1黑色素指数

利用Mexameter MX18(CK Electronic GmH，德国)测定测试者使用组合物后第0天、第7天、14天、21天和42天时间段的黑色素指数各5次，以第0天时黑色素指数值为对照，评价组合物对肤色改善的效果。

4.2.2ITA^o值

利用Chromameter CR-400颜色仪(Konica Minolta Sensing，Inc.，日本)测定测试者使用实施例1.5.2的组合物第0天、第7天、14天、21天和42天时间段的L*、a*和b*值各5次，按照公式换算Individual Typology Angle(ITA^o)值，第0天时ITA^o值为对照，通过对测得皮肤色度值统计分析比较，评价组合物对肤色改善的效果。

ITA^o＝{Arc Tangent[(L*-50)/b*]}*180/3.1416

L*数值代表皮肤黑白度参数，即其变化显示组合物使用前后皮肤黑白色度的变化，数值越大皮肤越亮；

a*代表红绿色度，即其变化显示组合物使用前后皮肤红绿色度变化，数值越大皮肤偏向于红色；

b*值即黄蓝色度，即其变化显示组合物使用前后皮肤黄蓝色度变化，数值越大皮肤颜色偏向于黄色。

综合计算ITA^o值，根据Colipa规定，其值越大，皮肤越明亮，反之皮肤晦暗。统计分析所有测试者皮肤颜色参数，分析比较组合物使用前后对皮肤肤色影响。

4.2.3测试条件和使用标准

选择无皮肤病及肤色过敏的健康受试者人数30名，年龄为22-35岁，于环境为恒温22±1℃，相对湿度为恒湿50±10％下提前30min安静待测，测前10min露出左或右整个前臂臂弯处，将组合物以2μL/cm²涂布密度均匀擦拭测试部位，每天2次持续6周。

4.2.4组合物对黑色素指数的影响

通过对30位受试者各个时间段黑色素指数的测定，测定组合物使用前第0周和使用1周、2周、4周和6周数据分析比较(表9所示)，可见组合物对皮肤色度有改善作用。与使用前第0周测试数据比较，从第2周起，黑色素指数开始呈下降趋势，黑色素指数越低，说明改善效果越好，也即黑色素含量越低，皮肤越白。

表9.黑色素指数

(p<0.05)

4.2.5组合物对ITA^o值影响

通过对30位受试者各个时间段L*、a*和b*值的测定，测定组合物使用第0周和使用1周、2周、4周和6周数据分析比较(表10所示)，从第2周开始，ITA^o值开始出现增加趋势，可见组合物对皮肤改善有明显作用，ITA^o值增加越快，说明改善效果越好，也即组合物对皮肤具有增亮效果。使用该组合物后肤色均匀，没有发现色素堆积、皮肤发黄或局部脱色问题。

表10.ITA^o值

时间	样本数(N)	平均值(Mean)	标准误差(S.E.Mean)	标准差(S.D)
					0周	30	27.59	1.2503	4.2321
1周	30	28.92	1.1432	4.3562
					2周	30	31.45	1.1029	4.2892
4周	30	32.63	1.1685	4.3035
					6周	30	33.86	1.0288	4.1202

(p<0.05)。

Claims (8)

1.一种防腐组合物，其特征在于同时含有丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物和山梨坦辛酸酯；

丁香提取物所提供的丁香酚在组合物中的含量为0.06～0.2mg/mL，银杏提取物所提供的银杏黄酮在组合物中的含量为0.2～0.5mg/mL，黄连提取液所提供的小檗碱在组合物中的含量为0.06～0.15mg/mL，山梨坦辛酸酯在组合物中的质量分数为2～10％。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的丁香提取物、银杏提取物、黄连提取物分别为丁香提取液、银杏提取液、黄连提取液。

3.如权利要求1～2任一所述的组合物在作为化妆品防腐剂中的应用。

4.一种化妆品，其特征在于含有如权利要求1～2任一所述的防腐组合物。

5.如权利要求4所述的化妆品，其特征在于所述防腐组合物在化妆品中的质量分数为1％～5％。

6.如权利要求5所述的化妆品，其特征在于所述防腐组合物在化妆品中的质量分数为2.5％～5％。

7.如权利要求4所述的化妆品，其特征在于pH值为4～9。

8.如权利要求7所述的化妆品，其特征在于pH值为5～8。