CN104853747A - 用于体内递送的脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供基于脂质体的组合物，其中脂质体包含通过肽键与其结合的肽，其中肽包含间隔氨基酸和短的载脂蛋白E识别序列或短的β-淀粉样蛋白识别序列。本发明进一步提供制备该脂质体的方法和利用基于脂质体的组合物用于治疗和诊断目的的方法。

Description

用于体内递送的脂质体
发明领域
本发明尤其提供基于脂质体的组合物，其中短的载脂蛋白E识别肽和/或短的β-淀粉样蛋白识别肽被结合至脂质体。
发明背景
随着群体年龄的增长，神经变性疾病、癌症和脑的感染变得更加普遍。然而，虽然脑中有相对高的血流量，但脑可能是活性药理学化合物的递送最不容易进入的器官之一。将脑与经血液系统的自由供应分隔开的生理屏障有两种。第一种屏障是血脑屏障(BBB)，第二种屏障是血脑脊液屏障(BCSFB)。
由于据估计人BBB的表面积比BCSFB的表面积大5000倍，因此BBB被认为是控制分子如药物摄取进入脑实质的主要屏障和将药物递送至脑的靶标。BBB由脑的微脉管系统限定，其由通过复杂的紧密连接而连接的单层极化内皮细胞组成。通过各种细胞，包括星形胶质细胞、神经元和周细胞动态调节BBB的功能。
内皮细胞通过基膜与这些其他细胞分隔开，基膜的成分如IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和硫酸乙酰肝素可参与药物转运，因为它们中的一些带负电荷。
BBB的特征为脑毛细血管内皮细胞之间复杂的紧密连接，该内皮细胞的低内吞活性众所周知。然而，BBB也包括一些特定的转运和调节穿过毛细血管的分子运输的酶系统。该屏障和其选择性的转运系统也在脑微环境的稳态调节中起重要作用，该稳态调节是神经元稳定和协调的活性所必需的。循环分子可凭借以下穿过BBB：(i)脂质介导的通过自由扩散的小分子转运和(ii)催化转运。后者包括针对低分子量的营养物的载体介导的转运(CMT)或针对循环肽和血浆蛋白质的受体介导的转运(RMT)。因此，BBB是可对抗影响中枢神经系统(CNS)的疾病的药物进入受影响的神经元附近的主要障碍。
几种用于将药物递送至CNS的方案已经得到开发，从而增强治疗分子穿过BBB的能力：(i)包括穿透BBB的化合物的可注射性组合物；(ii)选择的药物被共价地连接至用于受体介导的或吸附介导的转胞吞作用的载体；和(iii)药物本身以使其能够穿透通过BBB的方式得到修饰。
这些方案具有不期望的副作用，如BBB非选择性全面增强的通透性，即BBB功能的损害；干扰药物本身的治疗能力。此外，药物的修饰未必有助于治疗的特异性，且甚至可通过将化合物引导至并非药物的“自然”靶标的组织和器官而使其降低。
发明内容
在一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和通过肽键结合至脂质体的肽的组合物，其中肽包括至少一个间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是SEQ ID NOs：1-6的任何一种或多种的氨基酸序列。
在进一步的实施方式中，本发明提供脂质体由以下组成：胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine；DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3–phosphoethanolamine；DOPE)。
在进一步的实施方式中，本发明提供脂质体由胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phosphor-L-serine]；DOPS)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)组成。在进一步的实施方式中，本发明提供Ch、DOPC和DOPE的重量比为约1:1:1。在进一步的实施方式中，本发明提供Ch、DOPS和DOPE的重量比为约1:1:1。
在进一步的实施方式中，本发明提供治疗患有脑病理的对象的方法，包括向对象施用包括脂质体和通过肽键结合至脂质体的肽的组合物，其中肽包括至少一个间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是SEQ IDNOs：1-6的任何一种或多种的氨基酸序列，从而治疗患有脑病理的对象。
在进一步的实施方式中，本发明提供制备结合至肽的脂质体的方法，该肽包括至少一个间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是SEQ ID NOs：1-6的任何一种或多种的氨基酸序列，该方法包括步骤：(a)使以下在氯仿中溶解：(1)胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；或(2)胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、和l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；(b)将肽添加至步骤(a)的混合物，该肽包含至少一个结合至0.1-1mol％浓度的l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐的间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是SEQ IDNOs：1-6中任何一种或多种的氨基酸序列；(c)去除氯仿并获得干燥的脂质膜；和(d)在等渗缓冲液中水合干燥的脂质膜；和任选地(e)在等渗缓冲液中将亲水性药物装载至脂质体上，亲水性药物的量等于在药物比干燥脂质体为2:1至100:1的范围内的w/w比；和/或(f)将脂溶性药物装载至脂质体上，包括：(1)加热包含脂溶性药物和脂质体的装载组合物至高于相变型温度0.01℃至5℃的温度，从而获得油包水乳状液；和(2)冷却装载组合物至低于相变型温度0.01℃至10℃的温度，从而获得水包油乳状液，因而获得结合至肽的脂质体，该肽包含至少一个间隔氨基酸和随后SEQ ID NOs：1-6的任何一种或多种的氨基酸序列。
在进一步的实施方式中，本发明提供本文所述的过程获得的脂质体。
附图说明
图1为显示第一靶向肽和第二靶向肽的序列以及间隔氨基酸通过肽键所连接的二油酰基琥珀酸盐的方案，从而将肽结合至脂质体。
图2为评估静脉内注射之后脂质体在小鼠脑内的转运和释放及其有效载荷的脑切片的显微图。A-用未靶向的脂质体注射的小鼠。B和C-用分别结合至SEQ ID NOs：1和2的转运蛋白肽的脂质体注射的小鼠。A1、B1和C1描述从脂质体释放钙荧光素有效载荷。仅具有靶向BBB的肽的脂质体(B、B1、C、C1)在脑内积累(浅灰色)。阴性对照没有显示这种积累(A、A1)。
图3为显示记录上图(A)中加载FAM标记的DNA的脂质体和下图(B)中对照空脂质体的FACS的图。自由DNA低于可由FACS检测的尺寸。
具体实施方式
在一种实施方式中，本发明提供药物递送系统，其确保药物以安全、受控和有效的方式穿过BBB而不干扰BBB的完整性和/或选择性。在另一种实施方式中，本文提供物质如标记(指示物，对比剂)-递送系统，其确保物质以安全、受控和有效的方式穿过BBB而不干扰BBB的完整性和/或选择性。
本发明进一步提供通过利用基于脂质体的载体增强药物和/或物质递送穿过BBB的策略。在一些实施方式中，脂质体转移任何期望的修饰的或未修饰的分子(如治疗分子、标签分子或标记)通过BBB，而没有药物/物质进入其它非靶标器官或组织的不期望的倾向(disposition)作用，且不干预内皮组织的完整性，内皮组织支撑和保护脑免受通过维管系统输送的分子的影响。
在另一种实施方式中，本发明提供包括锚定的BBB识别肽或肽如SED ID NOs：1-6中提供的肽的任何一种或多种的脂质体，用于转移任何期望的分子(如治疗分子、标签分子或标记)通过BBB，而没有药物/物质进入其它非靶标器官或组织的不期望的倾向作用，且不干预内皮组织的完整性，内皮组织支撑和保护脑免受通过维管系统输送的分子的影响。在另一种实施方式中，本发明提供基于用于以受控和可重复的方式递送任何种类的化合物(如治疗化合物)通过BBB的脂质体载体的方法。
在另一种实施方式中，本发明提供锚定的BBB识别肽靶向BBB转运蛋白如β-淀粉样蛋白(Αβ)和/或载脂蛋白E(ApoE)。在另一种实施方式中，本发明提供锚定的BBB识别肽在脑中积累并通过特定的机制产生作用。在另一种实施方式中，本发明提供锚定的BBB识别肽促进脂质体载体通过结合位于BBB中的特定转运蛋白从循环系统(血液)穿透至脑。在另一种实施方式中，本发明提供锚定的BBB识别肽具有最小或没有其他功能效果。
在另一种实施方式中，包括脂质体和锚定的BBB识别肽的本发明组合物的卓越功效相对于本领域的现状是意料不到的。在另一种实施方式中，包括脂质体和锚定的BBB识别肽的本发明组合物具有非常低的免疫原性。在另一种实施方式中，包括脂质体和锚定的BBB识别肽的本发明组合物克服了与通过不同方式连接至脂质体的其它蛋白质的免疫原性有关的困难。在另一种实施方式中，包括脂质体和锚定的BBB识别肽的本发明组合物的特征是摄取物质(药物或标记)的高效性。脂质体与治疗分子的比也针对靶标细胞类型而得到优化。脂质体-治疗分子复合物的这种优化结合靶向配体的添加，在连同放射或化学治疗施用时产生显著提高的功效。在另一种实施方式中，本发明的脂质体载体增加了其携带的药物的治疗窗。本领域技术人员能够优化复合物，用于将多种治疗分子递送至多种细胞类型。
在另一种实施方式中，本发明提供包括锚定的BBB的脂质体识别肽连接至BBB中的识别位点，并穿透至脑或介导至脑的穿透。在另一种实施方式中，本发明提供包括锚定的BBB识别肽的脂质体连接至BBB中的识别位点，从而允许脂质体中或脂质体上存在的选择的物质/药物释放进入脑中预定位点。
在另一种实施方式中，术语“包括(包含，comprising)”包括术语“由……组成(consisting)”。在另一种实施方式中，术语“包括”被术语“由……组成”替换。
组合物
在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和结合至脂质体的肽的组合物，其中肽包括至少一个间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是氨基酸序列RERMS(SEQ ID NO：1)。在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和结合至脂质体的肽的组合物，其中肽包括至少一个间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是氨基酸序列LRKLRKRLLR(SEQ ID NO：2)。在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和结合至脂质体的肽的组合物，其中肽包括氨基酸序列ALRKLRKRLLR(SEQ ID NO：3)。在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和结合至脂质体的肽的组合物，其中肽包括氨基酸序列ARERMS(SEQ IDNO：4)。在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和结合至脂质体的肽的组合物，其中肽包括氨基酸序列HRERMS(SEQ ID NO：5)。在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和结合至脂质体的肽的组合物，其中肽包括氨基酸序列AHRERMS(SEQ ID NO：6)。在另一种实施方式中，本发明提供通过肽键连接至至少一个间隔氨基酸的肽。在另一种实施方式中，至少一个间隔氨基酸是丙氨酸。在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和本文所述的肽中的至少一种的组合物。在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体和本文所述的肽的任意组合的组合物。
在另一种实施方式中，肽是靶向配体。在另一种实施方式中，结合是在脂质体脂双层中琥珀酸基团的羧基端和至少一个间隔氨基酸的氨基之间通过肽键结合。在另一种实施方式中，琥珀酸基团包括琥珀酸或通过中和琥珀酸形成的盐。在另一种实施方式中，间隔氨基酸是任意氨基酸。在另一种实施方式中，间隔氨基是添加至本发明的肽用于结合的目的的氨基酸。
在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体、结合至脂质体的肽和药物的组合物。在另一种实施方式中，药物是脑治疗化合物。在另一种实施方式中，本发明提供包括脂质体、结合至脂质体的肽和标记的组合物。在另一种实施方式中，标记是探针。在另一种实施方式中，标记是脑探测剂(brain probing agent)。
在另一种实施方式中，脑治疗化合物是在脑中具有确定的治疗效果的化合物。在另一种实施方式中，脑治疗化合物是能够治疗大脑病理的化合物。在另一种实施方式中，大脑病理选自：听神经瘤、后天性脑损伤、胼胝体发育不全、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索病、动脉瘤、失语症、动静脉畸形、巴腾病、贝切特病、眼睑痉挛、脑肿瘤、脑癌、脑狼疮、大脑性麻痹、颈部肌张力障碍、夏-马-图三氏病、希阿里畸形、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、昏迷和持续性植物状态、震荡、克-雅二氏病、痴呆(非阿尔茨海默型)、唐氏综合症、自主神经功能异常、诵读困难、动用障碍、张力障碍、脑炎、癫痫、特发性震颤、弗里德赖希共济失调、高歇氏病、格-巴二氏综合症、杭廷顿舞蹈病、脑积水、颅内高血压、脑白质病变、美尼尔病、脑膜炎、脑膜炎球菌病、偏头痛、运动神经元病、多发性硬化、肌肉萎缩症、重症肌无力、昏睡病、帕金森病、周围神经病、普-韦二氏综合征、进行性核上麻痹、不宁腿综合征、雷特综合征、希-德二氏综合征、睡眠障碍、痉挛性发音困难、中风、蛛网膜下出血、西登哈姆舞蹈病、泰-萨二氏病、图雷特综合征、短暂性缺血发作、横贯性脊髓炎、三叉神经痛、结节性硬化症、或冯希-林二氏综合征。
在另一种实施方式中，脑探测剂是结合脑内的位点并可通过放射学检测的剂。在另一种实施方式中，脑探测剂是识别脑内细胞或蛋白质的剂。在另一种实施方式中，脑探测剂是识别脑内有缺陷的细胞或有缺陷的蛋白质的剂。在另一种实施方式中，脑探测剂是特异地结合和/或识别脑内的表位的剂。在另一种实施方式中，脑探测剂是结合和/或识别与脑病理相关的表位的剂。在另一种实施方式中，脑探测剂用于诊断脑病理。在另一种实施方式中，脑探测剂探测脑活动。
在另一种实施方式中，组合物是冻干的组合物。在另一种实施方式中，组合物是粉末的形式。在另一种实施方式中，组合物进一步包括锚定至脂质体膜或被吞没在脂质体中的物质。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，包括包覆在其中的药物或物质，例如但不限于：基因或其片段、siRNA、包含基因治疗或产生基因的药物或对抗疾病(癌症)的特异性毒素的质粒、反义DNA等。在另一种实施方式中，组合物是冻干的、空载的脂质体组合物。在另一种实施方式中，组合物进一步包括磷脂。在另一种实施方式中，组合物进一步包括电解质。在另一种实施方式中，组合物进一步包括药物。在另一种实施方式中，组合物进一步包括溶液。在另一种实施方式中，组合物进一步包括水溶液。在另一种实施方式中，组合物进一步包括等渗溶液。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，是携带螯合聚合物的脂质体。
脂质体的脂质
在另一种实施方式中，适于本发明组合物中使用的脂质体包括主要由形成囊泡的脂质组成的脂质体。在另一种实施方式中，形成囊泡的脂质是(a)可在水中自发形成双层囊泡的脂质，例如磷脂(PLs)，或(b)稳定地并入脂双层，其疏水部分与双层膜的内部疏水区接触且其头部基团部分朝向膜的外部极性表面的脂质。在另一种实施方式中，磷脂是烷基化PLs，其在充当抗癌剂时可为脂质体的一部分。在另一种实施方式中，磷脂是HePC。在另一种实施方式中，磷脂是ErPC3。在另一种实施方式中，磷脂是HePC、ErPC3或任何其它PL的混合物。
在另一种实施方式中，形成囊泡的脂质具有两条烃链、酰基链、和头部基团的脂质，其为极性或非极性。在另一种实施方式中，利用合成的形成囊泡的脂质和天然存在的形成囊泡的脂质，包括磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中两条烃链通常为约14-22个碳原子长，并具有不同的不饱和度。
在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，由天然磷脂组成。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，由具有表面活性剂性质的混合脂质链组成。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，由磷脂酰乙醇胺组成。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，是多层脂质体(MLV)。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，是小单层脂质体(SUV)。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，是大单层脂质体(LUV)。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的是螺旋状脂质体。
在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物包括以下所述的任何组合物：美国专利号4,983,397；6,476,068；5,834,012；5,756,069；6,387,397；5,534,241；4,789,633；4,925,661；6,153,596；6,057,299；5,648,478；6,723,338；6,627218；美国专利申请公开号：2003/0224037；2004/0022842；2001/0033860；2003/0072794；2003/0082228；2003/0212031；2003/0203865；2004/0142025；2004/0071768；国际专利申请WO 00/74646；WO 96/13250；WO 98/33481；Papahadjopolulos D,Allen T M,Gabizon A,et al."Sterically stabilized liposomes.Improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy"Proc Natl Acad Sci U.S.A.(1991)88:11460-11464；Allen T M,Martin FJ."Advantages of liposomal delivery systems for anthracyclines"SeminOncol(2004)31:5-15(suppl 13).Weissig et al.Pharm.Res.(1998)15:1552-1556，其均整体通过引用并入本文。
在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物包括脂质混合物。在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物包括将被递送至脑的物质。在另一种实施方式中，该物质是药物或标记化合物。在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物提供减少来自药物或标记化合物的副作用和/或防止药物或标记化合物的功效下降和/或丧失的益处。
在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物包括N-(Ω)-二羧酸-衍生的磷脂酰乙醇胺，其为被包覆的药物或标记化合物。在另一种实施方式中，一种或多种磷脂是POPC、DPPC、DMPC或DSPC，以及至少一种额外的脂质，如胆固醇。
在另一种实施方式中，磷脂是磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰甘油。在另一种实施方式中，磷脂是中性磷脂。在另一种实施方式中，磷脂是磷脂酰胆碱。在另一种实施方式中，磷脂酰胆碱包含饱和脂肪酸部分。在另一种实施方式中，胆固醇包含胆固醇衍生物。
在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物包括阳离子脂质。在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物包括阴离子脂质。在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物没有阴离子脂质或阳离子脂质。
在一些实施方式中，磷脂是磷脂酰胆碱，包括天然存在的、半合成的或合成的磷脂酰胆碱(例如DSPC、DMPC等)。在一些实施方式中，磷脂酰胆碱是非天然存在的磷脂酰胆碱。在一些实施方式中，磷脂酰胆碱是酰基磷脂酰胆碱(例如，DMPC、DPPC、POPC、DSPC等)。示例性磷脂包括但不限于：磷脂酰胆碱(PCs)、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。在一些实施方式中，含有脂质的组合物不包括磷脂酰丝氨酸或磷脂酰甘油。
在一些实施方式中，脂质体包括中性脂质，如胆固醇或胆固醇衍生物(例如，胆固醇普鲁分支葡聚糖、带正电荷的胆固醇(例如，DC-胆固醇))。
在一些实施方式中，磷脂是磷脂酰胆碱。在某些实施方式中，磷脂酰胆碱可为，例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)等。在特定的实施方式中，至少一种磷脂是磷脂酰胆碱。在这些实施方式中的某些中，磷脂酰胆碱是DMPC。在其它实施方式中，磷脂酰胆碱是DSPC。在其它实施方式中，磷脂酰胆碱是DPPC。在其它实施方式中，磷脂酰胆碱是POPC。在其它实施方式中，磷脂酰胆碱是EPC。在其它实施方式中，磷脂酰胆碱是HSPC。在一些实施方式中，包含一种磷脂并且为DMPC、DSPC、DPPC、POPC、EPC或HSPC。在含有脂质的组合物包含单个磷脂(非PE磷脂)的特定实施方式中，磷脂是DMPC。在含有脂质的组合物包含单个磷脂(非PE磷脂)的其它实施方式中，磷脂是DSPC。在含有脂质的组合物包含单个磷脂(非PE磷脂)的其它实施方式中，磷脂是DPPC。在含有脂质的组合物包含单个磷脂(非PE磷脂)的其它实施方式中，磷脂是POPC。在含有脂质的组合物包含单个磷脂(非PE磷脂)的其它实施方式中，磷脂是EPC。在含有脂质的组合物包含单个磷脂(非PE磷脂)的其它实施方式中，磷脂是HSPC。
在另一种实施方式中，本发明的脂质体包括胆固醇(Ch)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在另一种实施方式中，本发明的脂质体包括胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在另一种实施方式中，Ch、DOPC和DOPE的重量比是0.2-2:0.2-2:0.2-2。在另一种实施方式中，Ch、DOPS和DOPE的重量比是0.2-2:0.2-2:0.2-2。在另一种实施方式中，Ch、DOPC和DOPE的重量比是1:1:1。在另一种实施方式中，Ch、DOPS和DOPE的重量比是1:1:1。在另一种实施方式中，重量比是重量百分数之比。
在另一种实施方式中，通过多种技术如Szoka,F.,Jr.,et al.,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)中详述的技术制备本发明的脂质体，和支持本发明的制备的脂质体具体实例将在下文描述。在另一种实施方式中，脂质体是多层脂质体(MLVs)，其可通过简单的脂质膜水合技术形成。
在另一种实施方式中，预形成的脂质体包括形成囊泡的脂质和与其结合的肽。在另一种实施方式中，预形成脂质体包括形成囊泡的脂质和通过肽键结合至琥珀酸盐或琥珀酸的肽。
在另一种实施方式中，本发明进一步包括衍生化脂质的应用。制备衍生化脂质和形成聚合物包被的脂质体的方法描述于美国专利号5,013,556、5,631,018和5,395,619中，其整体通过引用并入本文。
在另一种实施方式中，亲水性聚合物稳定地连接至脂质，或通过不稳定的键连接，当它们在血流中循环或应答刺激物时，不稳定的键可允许包被的脂质体去除聚合物链的包被。
在另一种实施方式中，通过标准方法将治疗或诊断剂并入脂质体，包括(i)通过利用剂的水溶液水合脂质膜而被动诱捕水溶性化合物，(ii)通过水合含有该剂的脂质膜而被动诱捕亲脂性化合物，和(iii)针对内部/外部脂质体pH梯度装载可电离的药物。其它方法如逆向蒸发相脂质体制备，也是合适的。
在另一种实施方式中，通过使核酸以单分子形式凝聚而在脂质体中诱捕多核苷酸、寡核苷酸、其它核酸，如DNA质粒。在另一种实施方式中，在有效地将核酸凝聚成小颗粒的条件下，将核酸悬浮在水介质含有鱼精蛋白硫酸盐、精胺、亚精胺、组蛋白、赖氨酸、其混合物或其它合适的聚阳离子凝聚剂的水介质中。在另一种实施方式中，凝聚的核酸分子的溶液被用于再水合干燥的脂质膜，以形成具有诱捕形式的凝聚的核酸的脂质体。
在另一种实施方式中，制备结合至肽的脂质体的方法包括步骤：(A)将下述溶解于有机溶剂如氯仿中：(1)胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；或(2)胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)和l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；(B)将本发明的肽和至少一个结合至肽的氨基端的间隔氨基酸添加至步骤(A)的混合物，其中至少一个间隔氨基酸结合至琥珀酸盐，例如但不限于：l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐或l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐；(C)去除有机溶剂从而获得干燥的脂质膜；和(D)水合干燥的脂质膜，从而获得结合至肽的脂质体。
在另一种实施方式中，琥珀酸盐是l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐。在另一种实施方式中，琥珀酸盐以0.05-2mol％的浓度添加。在另一种实施方式中，琥珀酸盐以0.1-1mol％的浓度添加。在另一种实施方式中，琥珀酸盐以0.5-1mol％的浓度添加。在另一种实施方式中，琥珀酸盐以0.05-0.5mol％的浓度添加。
在另一种实施方式中，水合是在水中水合干燥的脂质膜。在另一种实施方式中，水合是在缓冲液中水合干燥的脂质膜。在另一种实施方式中，水合是在等渗缓冲液中水合干燥的脂质膜。在另一种实施方式中，水合是在磷酸盐缓冲液中水合干燥的脂质膜。
在另一种实施方式中，至少一个间隔氨基酸是在脂质体的双层中的琥珀酸基团和肽之间连接的氨基酸。在另一种实施方式中，至少一个间隔氨基酸是一个氨基酸。在另一种实施方式中，至少一个间隔氨基酸是两个氨基酸。在另一种实施方式中，至少一个间隔氨基酸是三个氨基酸。在另一种实施方式中，识别肽由SEQ ID NOs：1-6中的任何一种组成。在另一种实施方式中，识别肽包含SEQ ID NOs：1-6中的任何一种。在另一种实施方式中，本文所述的脂质体包括超过一种本文所述的识别肽。
在另一种实施方式中，本文所述的获得脂质体的方法进一步包括将亲水性药物装载至脂质体上或脂质体中。在另一种实施方式中，本文所述的获得脂质体的方法进一步包括在水溶液中将亲水性药物装载直脂质体上或脂质体内。在另一种实施方式中，本文所述的获得脂质体的方法进一步包括在等渗缓冲液中将亲水性药物装载至脂质体上或脂质体内。
在另一种实施方式中，本文所述的将剂装载至脂质体上或脂质体内根据本领域技术人员所知的方法进行。在另一种实施方式中，将水溶性剂装载至脂质体内或脂质体上包括在水性缓冲液中溶解水溶性剂和将脂质体添加至含有该水溶性剂的溶液中，然后针对游离缓冲液(free buffer)透析溶液。在另一种实施方式中，脂溶性剂的装载可包括加热至超过脂不溶性剂的相变型温度(PIT)的温度的过程，之后是冷却步骤。
在另一种实施方式中，水溶性剂的装载包括被动装载。在另一种实施方式中，核酸分子的装载包括被动装载。在另一种实施方式中，水溶性剂的装载包括远程装载，如下文进一步示例的。
在另一种实施方式中，药物的量等于药物比干燥脂质体2:1至100:1范围内的w/w比。在另一种实施方式中，药物的量等于药物比干燥脂质体2:1至10:1范围内的w/w比。在另一种实施方式中，药物的量等于药物比干燥脂质体10:1至50:1范围内的w/w比。在另一种实施方式中，药物的量等于药物比干燥脂质体50:1至100:1范围内的w/w比。在另一种实施方式中，药物的量等于药物比干燥脂质体20:1至80:1范围内的w/w比。
在另一种实施方式中，本文所述的获得脂质体的方法进一步包括将脂溶性药物装载至脂质体上或脂质体内。在另一种实施方式中，本文所述的获得脂质体的方法进一步包括通过下述将脂溶性药物装载在脂质体上或脂质体内：(1)将包括脂溶性药物和脂质体的装载组合物加热至超过相变型温度0.01℃至5℃的温度，从而获得油包水乳状液；(2)冷却装载组合物至低于相变型温度0.01℃至10℃的温度，从而获得水包油乳状液。在另一种实施方式中，以上将脂溶性药物装载在脂质体上或脂质体内的过程包括步骤(1)和(2)的至少一个重复，从而形成至少一个循环。在另一种实施方式中，循环重复至少两次。在另一种实施方式中，循环重复2-10次。在另一种实施方式中，循环重复2-5次。
在另一种实施方式中，冷却是添加冷水。在另一种实施方式中，冷却是冷冻。在另一种实施方式中，加热和冷却以0.5℃至20℃/min的速率进行。在另一种实施方式中，加热和冷却以1℃至10℃/min的速率进行。在另一种实施方式中，加热和冷却以1℃至5℃/min的速率进行。在另一种实施方式中，加热和冷却以2℃至8℃/min的速率进行。在另一种实施方式中，加热和冷却以5℃至10℃/min的速率进行。
在另一种实施方式中，加热是加热至60℃至100℃的温度。在另一种实施方式中，加热是加热至75℃至95℃的温度。在另一种实施方式中，加热是加热至75℃至85℃的温度。在另一种实施方式中，加热是加热至80℃至90℃的温度。在另一种实施方式中，加热是加热至90℃至100℃的温度。
在另一种实施方式中，冷却是冷却至40℃至80℃的温度。在另一种实施方式中，冷却是冷却至50℃至60℃的温度。在另一种实施方式中，冷却是冷却至60℃至70℃的温度。在另一种实施方式中，冷却是冷却至低于最大加热温度至少5℃的温度。在另一种实施方式中，冷却是冷却至温度低于最大加热温度至少10℃的温度。在另一种实施方式中，冷却是冷却至低于最大加热温度至少15℃的温度。在另一种实施方式中，冷却是冷却至低于最大加热温度至少20℃的温度。
在另一种实施方式中，本发明提供脂质体或通过本文所述的方法获得的包含脂质体的组合物。
组合物
在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物包括溶液。在另一种实施方式中，脂质混合物没有溶液。在另一种实施方式中，溶液是水溶液或水溶液和水混溶性溶剂的混合物。在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物进一步包括糖，如蔗糖。在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂或防腐剂。
在另一种实施方式中，在溶液(例如，水溶液)中溶解物质(药物和/或标记)。在一些实施方式中，溶液包括糖(例如，海藻糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、甘露醇、甘油、葡萄糖、果糖等)。糖的浓度可为几个百分点。例如，糖浓度(v/v)为约0.1-12；0.5-12％、1-12％、2-8％、2-6％、2-5％、2-4％、2-5％、2-6％、2-8％、2-9％、2-10％、4-10％、4-9％、4-8％、4-6％、3-4％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在某些实施方式中，溶液包含糖并是水性的。预期其中溶解药物的溶液也可含有另外的成分，包括本领域技术人员已知的成分。
在某些实施方式中，糖浓度为约5％、约7％、约8％、约9％或约10％。在其它实施方式中，糖浓度为约5％至约10％。在一些实施方式中，糖是葡萄糖且组合物中葡萄糖的浓度为约5％。在一些实施方式中，糖是葡萄糖和组合物中葡萄糖的浓度为5-12％。在某些实施方式中，糖是蔗糖且组合物中蔗糖的浓度为5-12％。
在一些实施方式中，溶液中糖的浓度可为例如约50mg/ml至约150mg/ml、约50mg/ml至约130mg/ml、约50mg/ml至约120mg/ml、约50mg/ml至约100mg/ml、约80mg/ml至约100mg/ml、约90mg/ml至约150mg/ml、约90mg/ml至约130mg/ml、约60mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约105mg/ml、约120mg/ml、或约140mg/ml。
本发明的组合物也可包含本领域技术人员已知的其它成分，例如但不限于盐、缓冲液、糖醇等。在另一种实施方式中，组合物包括磷酸钠(例如，磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠)。
在另一种实施方式中，磷酸钠的浓度可为约5至约15mM。例如，从约5至约12mM、从约5至约10mM、从约5至约7mM、从约7至约12mM、从约7至约15mM、从约9至约12mM、约5mM、约7mM、约10mM、约12mM或约15mM。
在另一种实施方式中，糖溶液可另外包含约1.0至约1.5mg/ml的磷酸钠。例如，约1.2至约1.5mg/ml、1.0至约1.7mg/ml、1.0至约2mg/ml、1.0至约2.5mg/ml、1.0至约3mg/ml、0.5至约3.5mg/ml的磷酸钠。
在一些实施方式中，组合物/溶液的pH为约6.5至约7.5、约6.7至约7.5、约7至约7.5、约7、约7.5、约6.8、或约6.5。
在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，是长循环脂质体。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，进一步包括具有惰性、生物相容性聚合物例如PEG的涂层，该聚合物在脂质体表面上形成保护层并减缓脂质体被调理素识别和因此的后续清除。
在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，包括可去除的PEG。在另一种实施方式中，脂质体例如本文所述的，包括聚[N-(2-羟丙基(甲基丙烯酰胺)]、聚-N-乙烯基吡咯烷酮、基于L-氨基酸的可生物降解的聚合物-脂质缀合物、聚乙烯醇或其任意组合。
与利用(1)用于经PEG间隔臂连接靶向配体的PEG；或(2)通过将其与激活脂质体移植的聚合物分子暴露于水的远端连接，将靶向配体连接到保护基或聚合物层上(Torchilin VP.Recent advances withliposomes as pharmaceutical carriers.Nat Rev Drug Discov.2005Feb；4(2):145-60)的现有技术不同，本发明经琥珀酸盐利用肽键。
在另一种实施方式中，本文所述的脂质体是pH敏感性脂质体。在另一种实施方式中，本文所述的脂质体以pH敏感性释放方式释放其成分(物质如药物)。在另一种实施方式中，本文所述的脂质体由pH敏感性成分构成。
在另一种实施方式中，本文所述的组合物是脂质体气溶胶。在另一种实施方式中，本文所述的组合物被冻干。
尺寸和ζ电势
在另一种实施方式中，脂质体的直径在5nm至300nm之间。在另一种实施方式中，脂质体的直径在10nm至200nm之间。在另一种实施方式中，脂质体的直径在50nm至200nm之间。在另一种实施方式中，脂质体的直径在50nm至150nm之间。在另一种实施方式中，组合物包括具有5nm至300nm之间的平均直径的脂质体。在另一种实施方式中，组合物包括具有50nm至200nm之间的平均直径的脂质体。在另一种实施方式中，组合物包括具有50nm至150nm之间的平均直径的脂质体。在另一种实施方式中，组合物包括具有50nm至250nm之间的平均直径的脂质体。在另一种实施方式中，组合物包括具有90nm至200nm之间的平均直径的脂质体。
在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-10mV至-200mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-50mV至-150mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-50mV至-130mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-60至-120mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-50至-100mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-75mV至-90mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-80mV至-90mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-80mV至-85mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-85mV至-90mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-75mV至-85mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为从-70mV至-90mV。在另一种实施方式中，本发明的脂质体的ζ电势为-75mV、-80mV、-85mV、-83mV、-90mV、-100mV、-120mV。
药物
在另一种实施方式中，通过本发明结合的脂质体通过或经循环系统输送至脑的物质是药物。药物是在脑中具有治疗活性的物质或化合物。在另一种实施方式中，药物治疗、改善或减轻大脑病理——例如以上所列——的症状。在另一种实施方式中，药物结合脂质体的外表面。在另一种实施方式中，药物被包覆(encapsulated)在脂质体内。
在另一种实施方式中，药物是本领域技术人员已知的任何抗抑郁药。在另一种实施方式中，药物是本领域技术人员已知的任何神经变性改善剂。在另一种实施方式中，药物是本领域技术人员已知的任何抗脑癌药物。在另一种实施方式中，药物是本领域技术人员已知的任何抗精神病药物。在另一种实施方式中，药物是具有位于脑内的配体的任何剂。在另一种实施方式中，药物是在脑内具有治疗效果的任何剂。
在另一种实施方式中，药物是化合物或基因。在另一种实施方式中，药物是抗癌剂。在另一种实施方式中，本领域技术人员根据本文的教导、依据所选的药物和组合物或制剂所预期的用途、考虑对药物和待治疗的个体均具有特异性的因素，可容易地确定本文所述的脂质体或组合物中所含的药物的量，如本文进一步所述。
在另一种实施方式中，药物是编码具有抗癌性质的序列的核酸。在另一种实施方式中，药物与脂质体复合。在另一种实施方式中，药物包覆在脂质体中。在另一种实施方式中，药物是DNA分子。在另一种实施方式中，药物是RNA分子。在另一种实施方式中，药物是核酶。在另一种实施方式中，药物是肽或多肽。在另一种实施方式中，药物是肽核酸。在另一种实施方式中，药物是病毒颗粒。在另一种实施方式中，药物是化学剂。在另一种实施方式中，药物是细胞因子。在另一种实施方式中，药物是包含DNA和用于从头生成药物或毒素的合适启动子的质粒。在另一种实施方式中，药物源自包含DNA和用于生成药物或毒素的合适启动子的质粒。
在一些实施方式中，抗癌剂是细胞毒性药物，包括本领域技术人员和医师所知的细胞毒性药物。示例性抗癌剂包括拓扑异构酶I抑制剂、长春花生物碱、烷化剂(包括铂化合物)、紫杉烷类和其他本领域技术人员所知的。
在另一种实施方式中，本发明的组合物包括约1至约100μg药物/mg脂质。在另一种实施方式中，本发明的组合物包括约1至约50μg药物/mg脂质。在另一种实施方式中，本发明的组合物包括约20至约50μg药物/mg脂质。在另一种实施方式中，本发明的组合物包括约10至约25μg药物/mg脂质。
在另一种实施方式中，组合物中药物的浓度为0.2至1.5mg/ml。在另一种实施方式中，组合物中药物的浓度为0.4至1.0mg/ml。在另一种实施方式中，组合物中药物的浓度为0.6至1.0mg/ml。在另一种实施方式中，组合物中药物的浓度为0.7至0.9mg/ml。
在另一种实施方式中，药物或标记化合物(包覆在脂质体内或连接至脂质体)的量为约0.1mg/ml至约15mg/ml。在另一种实施方式中，脂质体中药物或标记化合物的量为约0.5mg/ml至约15mg/ml、约0.5mg/ml至约10mg/ml、约0.1mg/ml至约10mg/ml、约0.5mg/ml至约5mg/ml；约0.5mg/ml至约3mg/ml、约0.5mg/ml至约2mg/ml、约0.5mg/ml至约1.5mg/ml、约0.8mg/ml至约3mg/ml、约0.8mg/ml至约2mg/ml、约0.8mg/ml至约1.5mg/ml、约0.7mg/ml至约3mg/ml、约0.7mg/ml至约2mg/ml、约0.7mg/ml至约1.7mg/ml、约0.7mg/ml至约1.5mg/ml、约0.7mg/ml至约1.4mg/ml、约0.7mg/ml至约1.3mg/ml、约0.5mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml或约15mg/ml。
在另一种实施方式中，本文所述的组合物包括单种药物。在另一种实施方式中，本文所述的组合物包括多于一种药物。在另一种实施方式中，本文所述的组合物是联合治疗。
在另一种实施方式中，本文所述的组合物包括生物碱、烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、激素和激素类似物、免疫调节剂、光敏剂、抗体、肽、抗有丝分裂剂、或其任意组合。在另一种实施方式中，本文所述的组合物包括植物生物碱。
在另一种实施方式中，本发明的脂质体使药物如抗癌剂能够递送而不诱发药物产生的毁灭性的副作用。这通常被称为治疗指数，其描述完成癌细胞破坏所需的剂量与物质对个体不可接受地有毒性的剂量之间的平衡。因此，本发明避开了通常具有相对小范围的治疗指数的大多数抗癌剂的缺陷毒性(即，破坏癌细胞而对个体没有不可接受的毒性的窄剂量范围)。
在另一种实施方式中，本发明的脂质体携带本文所述的物质，使其稳定，穿透BBB并在精确的预定位置或细胞类型(例如癌细胞)中卸下物质。在另一种实施方式中，本发明的脂质体将本文所述的物质携带至癌性细胞。在另一种实施方式中，本发明携带抗癌的脂质体的安全性和特异性性质引起常见的副作用如恶心和呕吐的降低。在另一种实施方式中，这种一直期望的特异性允许将被递送至预定位点的高毒性化合物的应用，而没有这些毒性化合物非预期的泄漏。因此在一些实施方式中，本文所述的脂质体载体降低广泛的抗癌剂常见的副作用，包括：头发脱落(脱发)；食欲不振；重量减轻；味觉变化；口炎和食管炎(炎症和溃疡)；便秘；腹泻；疲劳；心脏损伤；神经系统变化；肺损伤；生殖组织损伤；肝损伤；肾和泌尿系统损伤。
标记
在另一种实施方式中，本发明的脂质体组合物包括标记化合物。在某些实施方式中，标记化合物包括放射性同位素部分。在另一种实施方式中，通过或经循环系统运送至脑的物质是标记或探针。在另一种实施方式中，通过或经循环系统运送至脑的物质是可通过放射学方法精确识别的物质。在另一种实施方式中，物质为标记化合物。在另一种实施方式中，标记或探针是在进行体内诊断程序有用的剂。在另一种实施方式中，“标记化合物”、“标记”或“探针”可互换地使用。
在另一种实施方式中，本领域技术人员根据现有技术和本文提供的教导、依据所选的标记化合物和组合物或制剂预期的用途、考虑对标记化合物和待诊断的个体均具有特异性的因素，可容易地确定本文所述的组合物和其制剂中所含标记化合物的量。
在另一种实施方式中，标记化合物是同位素。在另一种实施方式中，标记化合物是放射性标记化合物。示例性标记化合物包括，例如，包含放射性同位素(例如，3H、4C、67Ga、111In、125I、131I、133Xe等)的物质、包含荧光部分(例如，荧光素、荧光素异硫氰酸盐等)的物质、包含酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶等)的物质、以及本领域技术人员已知的另外的标记化合物。在另一种实施方式中，标记化合物是用于所有显像模式的显像剂。在另一种实施方式中，标记化合物是对比剂。在另一种实施方式中，标记化合物包括放射性核素或顺磁性金属。
在另一种实施方式中，标记化合物和在诊断中使用的方法的选择将取决于脑组织(例如，恶性或非恶性的)或待研究的组织类型。在另一种实施方式中，本发明包含125I的组合物对通过γ计数器识别癌症的存在和确定癌症的严重性(例如，在起初、疗程期间、治疗之后)是尤其有用的。
试剂盒
在本发明的另一种实施方式中，提供包含本文所述的脂质体组合物的试剂盒。包含脂质体的组合物的某些实施方式，包括包装和包含在容器中。
在另一种实施方式中，本文所述的试剂盒、包含脂质体的组合物包含在第一容器中，一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂、或防腐剂包含在第二容器中。在另一种实施方式中，提供包含本文所述的药物制剂的试剂盒、包装和使用说明书。
治疗方法
在进一步的实施方式中，本发明提供本文所述的组合物(包含靶向脂质体)和其制剂在制备药物中的应用。具体地为制备在治疗或诊断本文所述的状况中使用的药物。在另一种实施方式中，药物制剂还旨在用于制备在治疗和诊断状况中使用的药物，并且依据本文所述的方法。
在另一种实施方式中，本发明提供治疗癌症(例如成胶质细胞瘤)的方法，包括步骤a)将本文所述的脂质体以对治疗癌症有效的量施加于对其有需要的个体，其中药物是抗癌剂。在另一种实施方式中，抗癌剂是抗成胶质细胞瘤剂。在另一种实施方式中，癌症是脑癌。
在另一种实施方式中，本发明提供治疗神经变性疾病(如阿尔茨海默病)的方法，包括步骤a)将本文所述的脂质体以对治疗神经变性疾病有效的量施加于对其有需要的个体，其中药物是神经变性疾病治疗剂。阿尔茨海默病。在另一种实施方式中，药物是阿尔茨海默病治疗剂。在另一种实施方式中，药物是帕金森病治疗剂。
在另一种实施方式中，本发明进一步提供包括治疗方法，包括：在联合模式治疗之前、联合模式治疗的同时或联合模式治疗之后进行步骤(a)。在特定的实施方式中，联合模式治疗，例如用于癌症的，包括化学疗法、放射疗法或手术。在一些实施方式的治疗方法中，在辅助治疗之前、辅助治疗的同时或辅助治疗之后进行步骤(a)。
在另一种实施方式中，辅助治疗包括施加使将要进一步被本文所述的脂质体靶向的靶标细胞或组织致敏的一种或多种剂。在另一种实施方式中，本文所述的脂质体组合物经肠胃外投药施用。在另一种实施方式中，肠胃外投药凭借注射或静脉输注。
在另一种实施方式中，提供诊断方法，包括步骤a)将本文所述的脂质体以对检测有效的量施加于对其有需要的个体，其中靶向脂质体包括标记化合物；和b)检测标记化合物。在另一种实施方式中，方法进一步包括步骤(c)，比较检测的标记化合物的水平与处于健康或疾病时检测的标记化合物的参考量。在另一种实施方式中，参考量是指示疾病的阈值量。
在另一种实施方式中，本文所述的包含脂质体的组合物用于光动力疗法.。在另一种实施方式中，本文所述的包含脂质体的组合物被用作药物载体、增强剂或二者。在另一种实施方式中，本文所述的包含脂质体的组合物用于在肿瘤中受控释放包含光敏剂的药物。
在以下实施例的检验之后，本发明另外的目的、优势和新特征对本领域技术人员将变得显而易见，实施例不旨在限制。此外，上文描述的和以下权利要求部分所要求的本发明各种实施方式和特征的每一种在以下实施例中存在实验依据。
实施例
具有β-淀粉样蛋白(Αβ)和/或载脂蛋白E识别肽(一种或多种)的脂质体从血液穿透至脑而不妨碍BBB的完整性
材料
胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)或l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL)。荧光标记德克萨斯红购自Molecular Probes(Eugene,OR)。钙荧光素购自Sigma(St.Louis,MO)。
脂质体制备
在10mM磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.4中制备具有摩尔比为1:1:1的Ch/DOPE/DOPS或Ch/DOPE/DOPC的基本组合物的脂质体。磷脂和Ch溶解于氯仿中，以适当的摩尔比混合。在需要时，将德克萨斯红和R18以0.05-0.1mol％的浓度添加至该混合物。将结合的短肽(例如，l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐-A-H-R-E-R-M-S-COOH(SEQ ID NO：6)和/或l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐-A-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-COOH(SEQ ID NO：3))以0.2-0.5mol％的浓度添加至混合物。肽：l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐复合物的合成、结合和纯化由肽公司(PiProteomics)根据我们的特定要求进行。
通过在40℃下旋转蒸发2小时去除溶剂。利用延长的手臂振动器将干燥的脂质膜在PBS中水合2小时。利用超声波清洁器(型号75HT,VWR)通过温和的超声波处理30秒，将通过水合和振动形成的多层脂质体减小至100-150nm的脂质体直径尺寸范围。
对脂质体进行5个冻融(F&S)循环，随后利用挤出装置(NorthernLipids Inc.,Burnaby,BC,Canada)通过100-nm-孔聚碳酸酯滤器挤出。然后，利用Virtis Benchtop SLC冻干器(型号4KBTXL-75)过夜冻干脂质体和在密封瓶中在氮气下保存直至使用。按照需要，利用额外的F&T循环进一步减小脂质体的尺寸，随后通过100nm和50nm孔尺寸的聚碳酸酯滤器挤出。
1、药物装载(亲水性和/或亲脂性)
将以可提供的最高浓度溶于PBS的水溶性药物如钙荧光素以5:1-30:1的比添加至干燥的脂质体，轻轻混合并在室温孵育30分钟。混合物被转移至1ml的体积并针对500ml的PBS过夜透析。确定药物浓度和脂质体注射剂量。
对于脂溶性药物，脂质体制备过程包括两个步骤。步骤I包括将所有成分(其比例根据研究而不同)在磁力搅拌下混合并从室温加热高达“所谓的”T2温度，以获得水/油乳状液，T2温度高于相变型温度(PIT)。
其之后为冷却过程，到达“所谓的”T1温度，其低于ΡIΤ，引起O/W乳状液的形成。然后进行穿过T2和T1之间的相变型区(PIZ)的几个温度循环。稀释之前的温度在变型过程的开始被测定并由从O/W乳状液的开始设置在1-3℃的温度范围限定。
步骤II是不可逆的冲击(shock)，其由用添加至混合物的冷水骤然稀释引起，冷水已经保持在之前限定的温度。完成该步骤从而使在PIZ内获得的微乳状液系统破碎，并引起稳定的纳米胶囊的形成。
随后，对悬浮液施加缓慢的磁力搅拌5分钟。制备不同的组合物比例，从而考察相图。在85和60℃之间施加速率为4℃/min的三个加热和冷却温度循环。将脂质体装载选择的药物，测试有效载荷的浓度和装载的脂质体在体外和体内的稳定性。对每一批结合的肽进行一组测试，以在注射入动物之前评估产品的质量。
将核酸分子装载至本发明的脂质体的进一步实验被实施。具体地，通过将溶解于0.2ml水中的100μg DNA添加至冻干的脂质体，使DNA片段(用荧光FAM标记的39BPs)被动地装载至脂质体中，随后通过在盐水中离心去除未被包覆的DNA(1000g,5min,4℃)。然后通过在盐水中重悬浮洗涤丸粒，重复该过程四次。通过使脂质体在FACS中运行测定装载的DNA，测量DNA在脂质体中的分布和含量(图3)。将数据与空脂质体和自由的标记的DNA相比较。由于DNA在细胞内起作用，使用pH敏感性脂质体例如包含33％的磷酯酰丝氨酸以从内体释放有效载荷是重要的。
然后，进行装载至本发明的脂质体上。由于在透析过程中药物扩散返回外部溶液，被动装载的脂质体不能将药物保持在脂质体内。因此，氯吉灵(Clorgyline)远程装载的过程被测试(Zucker et al.2009)。通过利用0.2M的硫酸铵被动装载脂质体，然后通过用盐水或蔗糖的等渗溶液(相对于血浆)将盐置于外部脂质体介质中而产生脂质体梯度，装载得到完成。接着对1个体积的脂质体分散体使用250个体积的透析介质，进行在40℃三个重复的透析循环1h，然后用500个体积的透析介质过夜进行第四个透析步骤。这产生至少1000的跨膜离子梯度大小，其实际上产生了将温和的阳离子药物吸入脂质体中的阴离子泵并引起由电结合将这些药物在脂质体内扣紧。
此外，通过将氯吉灵与硫酸铵预装载的脂质体在37℃孵育10-480分钟，然后冷却至4℃，实现远程装载的最终步骤。未诱捕的药物通过离心(1000g,5min,4℃)去除。然后，通过在盐水中重悬浮而洗涤丸粒，重复该过程四次。在该过程之后，从脂质体提取液中测得100μg氯吉灵/2.8mg脂质体的浓度。
最后，成功将多巴胺装载入脂质体中。具体地，将多巴胺溶解于水中产生pH 5.7的溶液，该溶液与包含33％的磷酯酰丝氨酸的脂质体—设计为在低pH下融合的pH敏感性脂质体不相容。由于各种药物在溶解于水中时可呈现不同的pH，脂质体的制剂被设计为在pH不敏感性脂质体中携带药物，例如，如Allon at al.(2012)中所述，用磷脂酰胆碱替换磷酯酰丝氨酸。简而言之，在pH 7.4、10mM的磷酸盐缓冲液(PBS)中制备具有摩尔比为1:1:1的Ch/DOPE/PC基本组合物的脂质体。溶解于氯仿中的磷脂和Ch以适当的摩尔比混合。将结合的靶向肽以0.5mol％添加至混合物。通过在40℃旋转蒸发2h去除溶剂，然后过夜冻干。利用延长的手臂振动器使干燥的脂质膜在PBS中水合2小时。将通过水合形成的多层脂质体如下减小至100nm：对脂质体进行5个冻融循环，然后使用挤出装置(Northern Lipids Inc.,Burnaby,BC,Canada)通过200-nm孔的聚碳酸酯滤器和随后的100nm孔的聚碳酸酯滤器挤出。然后，利用Virtis Benchtop SLC冻干器(型号4KBTXL-75)将脂质体过夜冻干并在密封小瓶中在氮气下保存直至使用。利用由PC而不是PS配置的脂质体使得能够利用具有宽范围pH的远程装载药物并稳定系统。DNA、siRNA或质粒的装载需要PS脂质体用于内体逸出，例如将有效载荷释放至细胞质，并可通过被动装载完成。
2、评估靶向脂质体穿过BBB和在脑中释放其有效载荷的能力
测试两个主要的SJL/雌性小鼠组：
1、对照-装载钙荧光素的未靶向脂质体治疗组。
2A、与β-淀粉样蛋白结合位点H-R-E-R-M-S-COOH(APP327-332,SEQ ID NO：5)结合的、装载钙荧光素的脂质体。通过氨基酸间隔将肽共价地结合至1,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐。
2B、结合至-L-R-K-L-R-K-R-L-L-R(hApoE141-150,SEQ ID NO：2)的、装载钙荧光素的脂质体Ch/DOPE/DOPS。通过氨基酸间隔将肽共价地结合至l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐。
在制备脂质体的过程中，在0.25mol％德克萨斯红的存在下将靶向肽以初始混合物的0.5mol％插入磷脂混合物。
每个组包括4只小鼠。小鼠被注射(尾静脉)相等量的每kg小鼠钙荧光素。三小时后，小鼠被麻醉，用盐水灌注，并在30％蔗糖的存在下用多聚甲醛固定一个星期，然后连续切片成40μm厚的冰冻切片。利用激发德克萨斯红和/或钙荧光素的特定激光进行观察。
基于40μm厚的脑切片的激光共聚焦显微镜来评估治疗功效。
总之，由于Αβ或ApoE的全长或长段可具有损伤副作用，因此使用由BBB转运蛋白识别的、但不具有另外不期望的功能作用的该肽的短段。靶向两个不同的BBB结构域的脂质体-肽制剂(2A和2B)，均具有最少的体内生物作用。因此这些肽可用作将缀合物靶向至脂质体用于BBB连接和穿过，并因此实现一直期望的促进化合物经循环系统转运进入脑中。并且，这些短肽被证明与更长的源肽相比，具有可以忽略的免疫原性。
为了评估在经BBB从血液至脑的脂质体转运中这些肽的功效，制备用德克萨斯红(红色荧光染料)标记的脂质体并加载钙荧光素(浅黄绿色的荧光染料)。脂质体与SEQ ID NO：1的肽或SEQ ID NO：2的肽在它们的表面结合，如图1和2所述。对照脂质体没有任何这种转运蛋白肽。将脂质体注射入清醒的小鼠的尾静脉中。三小时后，小鼠被麻醉，用盐水灌注，然后将脑摘出用于组织学评估。利用共聚焦显微镜测量每种染料荧光发射的评估。
用与转运蛋白肽结合的脂质体注射的小鼠显示脂质体的充足标记以及其有效载荷在其靶标器官脑中积累(图2)。相反，未靶向的对照脂质体仅在少量的毛细血管中显示极少的标记(图2)。
因此，按照设计，本发明使化合物能够递送至脑，从而使得能够治疗大脑病理，如成胶质细胞瘤或神经变性疾病。

Claims (31)

1.包含脂质体和结合至所述脂质体的肽的组合物，其中所述肽包括至少一个间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是氨基酸序列RERMS(SEQID NO：1)或氨基酸序列LRKLRKRLLR(SEQ ID NO：2)。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体包括SEQ ID NO：1的所述肽和SEQ ID NO：2的所述肽。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述结合是通过脂质体脂双层内的琥珀酸基团羧基端和所述至少一个间隔氨基酸氨基基团之间的肽键而结合。
4.权利要求1所述的组合物，其中所述肽由ALRKLRKRLLR(SEQID NO：3)的氨基酸序列组成。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述肽由氨基酸序列ARERMS(SEQ ID NO：4)组成。
6.权利要求1所述的组合物，其中所述肽由氨基酸序列HRERMS(SEQ ID NO：5)组成。
7.权利要求1所述的组合物，其中所述肽由氨基酸序列AHRERMS(SEQ ID NO：6)组成。
8.权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体进一步包括脑治疗化合物。
9.权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体进一步包括脑探测剂。
10.权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体包括胆固醇(Ch)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体包括胆固醇(Ch)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
12.权利要求10所述的组合物，其中Ch、DOPC和DOPE的重量比为1:1:1。
13.权利要求11所述的组合物，其中Ch、DOPS和DOPE的重量比为1:1:1。
14.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物被冻干。
15.权利要求1所述的组合物，其中脂质体的直径在l0nm至200nm之间。
16.治疗患有脑病理的对象的方法，包括对所述对象施用权利要求8所述的组合物，从而治疗患有大脑病理的对象。
17.将脂质体递送至对象的脑中的方法，包括向所述对象施用权利要求1所述的组合物，从而将脂质体递送至对象的脑中。
18.权利要求16所述的方法，其中所述大脑病理为：基底神经节疾病、慢性脑损伤、代谢性脑疾病、脑内炎症、脑血管疾病、小脑疾病、健忘症、痴呆、阿尔茨海默病、杭廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、下丘脑疾病、颅内高血压、脑软化、脑瘤、脑炎、神经轴性营养不良、脑水肿、颅内高血压、硬膜下积液、帕金森病或谢尔德弥漫性脑硬化。
19.权利要求16或17所述的方法，其中所述施用是系统施用。
20.制备结合至肽的脂质体的方法，所述肽包含至少一个间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是选自SEQ ID NOs：1-6的氨基酸序列，所述方法包括步骤：
(a)将下述溶解于乙醇或氯仿中：(1)胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；或(2)胆固醇(Ch)、l,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)和l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；
(b)将肽添加至步骤(a)的混合物，所述肽包含至少一个结合至0.1-1mol％浓度的l,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸盐的间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是选自SEQ ID NOs：1-6的氨基酸序列；
(c)去除所述氯仿并获得干燥的脂质膜；和
(d)在等渗缓冲液中水合所述干燥的脂质膜；
从而获得结合至肽的脂质体，所述肽包含至少一个间隔氨基酸，所述间隔氨基酸之后是选自SEQ ID NOs：1-6的氨基酸序列。
21.权利要求20所述的方法，其中Ch、DOPC和DOPE的重量比或Ch、DOPS和DOPE的重量比为1:1:1。
22.权利要求20所述的方法，其中所述脂质体的直径在10nm至200nm之间。
23.权利要求20所述的方法，进一步包括通过50nm至100nm孔过滤器挤出所述脂质体。
24.权利要求20所述的方法，进一步包括冻干所述脂质体。
25.权利要求20所述的方法，进一步包括在等渗缓冲液中将亲水性药物以等于在药物比干燥脂质体为2:1至100:1范围内的w/w比的量装载至所述脂质体上。
26.权利要求20所述的方法，进一步包括将脂溶性药物装载至所述脂质体上，包括：
(a)将包含所述脂溶性药物和所述脂质体的装载组合物加热至高于相变型温度0.01℃至5℃的温度，从而获得油包水乳状液；
(b)将所述装载组合物冷却至低于相变型温度0.01℃至10℃的温度，从而获得水包油乳状液。
27.权利要求26所述的方法，其中步骤(a)和(b)形成重复至少两次的循环。
28.权利要求26所述的方法，其中所述加热和所述冷却以1℃至10℃/min的速率进行。
29.权利要求26所述的方法，其中所述加热是加热至75℃至95℃之间的温度。
30.权利要求26所述的方法，其中所述冷却是冷却至50℃至70℃之间的温度。
31.通过权利要求20-30中任意一项所述的方法获得的脂质体。
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