CN104840448A - 一种可高效快速穿透血脑屏障的纳米药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能将药物高效输运至中枢神经系统并随后立即快速释放的纳米药物。更具体而言，该纳米药物以纳米多孔硅颗粒为内核载体装载目标药物分子，将目标药物分子迅速输运至脑部后迅速释放，达到迅速治疗脑部急性疾病的目的。所装载的目标药物，尤其适用于因水溶性强等原因无法穿透血脑屏障的药物。该纳米药物，尤其适用于神经性毒剂中毒后中枢神经系统中毒乙酰胆碱酯酶的救治。

Description

一种可高效快速穿透血脑屏障的纳米药物

技术领域

本发明涉及一种能穿透血脑屏障进而将装载的药物高效输运至中枢神经系统并随后立即快速释放的纳米药物。该纳米药物中枢靶向性好、载药量高、释药快，可用于治疗需紧急给药的脑部急性疾病及肿瘤，尤其适用于神经性毒剂中毒后中枢神经系统的救治。

背景技术

1血脑屏障的穿透

脑部为维持中枢的动态稳定，除了一些氨基酸、己糖类、神经肽类等通过特殊的载体转运穿过血脑屏障之外，超过98%的药物分子不能穿过血脑屏障抵达中枢。

针对该难题，既往的研究多集中在新型药物分子的设计和结构改构上面，例如增加分子的亲脂性基团、减少分子的正电荷基团、减少分子量等，但由于药物分子内分子电荷、亲疏水性、分子空间位阻等一系列固有因素的限制，以及分子结构的细微改变将极大的影响药物的理化性质和药效，通过分子自身改构的研究方案仍不能有效的实现药物中枢给药，例如救治神经性毒剂中毒的药物重活化剂，虽然对分子结构进行改造，设计合成了了大量的新型重活化剂，但依然未能实现对中枢中毒酶的有效重活化。

2药物在中枢的释放

现有的以中枢神经系统为靶向目标的纳米药物中，多数以治疗脑部肿瘤等为治疗目标，缓释型纳米结构即可满足使用要求，即装载药物的内核外包裹了一层高分子层等修饰层，内核药物需要伴随着外层高分子层的舒展才能与外界环境接触，从而开始缓慢释放药物。

但是以神经性毒剂中毒的解毒为代表的脑部急性疾病的治疗则与此不同，其需要迅速起效。因为神经性毒剂中毒后，可迅速与血液及组织中的乙酰胆碱酯酶结合，进而导致乙酰胆碱酯酶丧失对乙酰胆碱的催化水解作用，引发体内乙酰胆碱大量蓄积，由于乙酰胆碱是体内重要的神经递质，最终会产生以胆碱能系统功能亢进为代表的中毒症状表现。中毒者命悬一线，药物起效快能避免造成多重后遗症。但是现有的报道中尚没有提供能穿透血脑屏障后迅速释药的纳米药物。

3中枢中毒救治

对于神经性毒剂中毒救治，最重要的措施之一是重活化，即采用药物干预的方法，使与神经性毒剂结合的乙酰胆碱酯酶重新恢复水解乙酰胆碱的功能。而能够使中毒酶重新恢复水解乙酰胆碱酯酶的药物，称之为重活化剂。

以梭曼为例进行说明，梭曼（Soman，化学名：甲氟膦酸特己酯）是神经性毒剂一种，也是最为难防难治的神经性毒剂。目前临床普遍应用的酶重活化剂如氯解磷定、双复磷等，对梭曼中毒酶无良好重活化作用；而以HI-6为代表的双季胺单肟类重活化剂，尽管对梭曼外周中毒酶有良好重活化作用，但由于其本身分子结构所具有的强亲水性、分子带正电荷等理化性质显著特点，使其难以穿透血脑屏障（blood-brainbarrier,BBB）而进入中枢，因而无法实现对梭曼中枢中毒酶的重活化作用。其结果导致梭曼中毒后，伤员很快出现惊厥、昏迷为代表的严重中枢中毒症状表现，进而出现难以抑制的迟发性脑损伤。

德国的Franz Worek研究组在该领域进行了相应的研究工作，他们将人血清白蛋白制备成为纳米颗粒后，利用静电吸附作用在颗粒表面挂载HI-6药物后，模拟体外血脑屏障模型，进行生物学药效评价。从药效评价上看，药物穿透血脑屏障的能力有一定的提升，但是效率低、结构不稳定，依然不能满足神经性毒剂（例如梭曼）中毒救治的需求（Miriam Dadparvara,Franz Worek等，HI-6human serum albuminnanoparticles-Development and transport over an in vitro blood–brainbarrier model，Toxicology Letters206(2011)60–66）。

综上可知，目前基于分子改构的方法和现有的纳米药物，均未能有效的实现中枢梭曼中毒酶的重活化，目前亟需开发出可以对梭曼中枢中毒酶有重活化作用的有效药物。

发明内容

为了解决这个问题，我们进行了大量的研究工作，最终开发出了本发明的包被有特定蛋白质的载药纳米硅球，有效地实现了药物的血脑屏障穿透和中枢迅速释放，最终提供了新型的纳米药物用于中枢解毒。

首先，本发明在纳米材料的选择上发现无机纳米药物载体纳米多孔硅球可以有效的满足中枢靶向给药的各项要求。首先纳米多孔硅球载体其多孔结构，在保证能大量吸附药物分子的同时，也保持了与外界直接的药物释放通道，而不需要经历外层修饰层的舒展，就能快速地释放所装载的药物分子。

另外由于硅材料生物安全性高，满足使用要求，经已有文献证实，在小鼠模型上其耐受剂量高达2mg/只，且未引起小鼠炎症、过敏、脱水、脱毛等症状，经组织切片观察，硅球进入体内后未引起体内器官炎症等，并且多孔硅球在4天后94%将排出体外，进入脑部的硅球在96小时后排出体外。

为测试该纳米药物能否有效的将药物输运至中枢神经系统并迅速释放，本发明选用该纳米药物装载重活化剂HI-6重活化梭曼中枢中毒酶的实验来验证该纳米药物的中枢靶向有效性。

本发明以多孔纳米硅球为载体装载重活化剂HI-6，利用该载体将原本不能进入中枢的HI-6快速输运至脑部后迅速释放，立即重活化梭曼中枢中毒酶，达到中枢解毒的救治目的。

为证明本发明的先进性，我们重复了德国的Franz Worek研究组的研究工作，按照该课题组发表的工作所提供的数据合成制备了装载了HI-6的人血清白蛋白纳米颗粒（HSA NP）,该课题组报道中仅对该纳米药物进行了初步的体外药效评价，本发明在此基础上进一步进行在体药效学评价，与本发明所涉及药物纳米重活化剂进行对比，证明本发明药物效率远超已报道工作。

本发明的目的是提供一种新型中枢靶向能迅速释药的纳米药物的结构和制备方法以及相应的药效评价。

本发明所提供的新型纳米药物如下：其以内部多孔的纳米多孔硅球作为载体，在载体孔内吸附或者装载有目标药物，在载体的表面修饰有蛋白层。

其中，前述的新型纳米药物上的目标药物可以是重活化剂，优选为双季胺单肟类重活化剂，进一步优选酰胺磷定（HI-6）、氯解磷定及双复磷中的至少一种，更进一步优选为HI-6。

其中，前述的新型纳米药物上修饰的蛋白层是通过化学反应键合上的一层蛋白层，蛋白层采用的蛋白优选对血脑屏障穿透效率高的内源性蛋白，其可以辅助实现药物高效进入中枢神经系统。优选白蛋白和转铁蛋白，进一步优选转铁蛋白。

本发明所提供的纳米药物的制备方法为：（1）利用stober法制备纳米硅球；（2）酸性环境下回流得到多孔结构的纳米硅球；（3）在氮气保护下，在硅球表面键合上硅烷偶联剂；（4）在硅球表面键合上蛋白；（5）完成目标药物载药。

所述的硅烷偶联剂包括并不限于化合物一端为正硅酸酯基团一端通过烷基链连接上能与氨基反应的活性基团，如APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷），（3-三乙氧基甲硅烷基）丙基琥珀酸酐，（3-环氧乙基甲氧基丙基）三甲氧基硅烷等，优选（3-环氧乙基甲氧基丙基）三甲氧基硅烷，其活性基团环氧乙基能在室温环境及不加任何催化剂条件下与蛋白上氨基结合，不产生副反应产物。

其中，步骤（1）中所述stober法具体操作是将氢氧化钠（2mmol/L）和十二烷基溴化铵（CTAB）按照摩尔比（1:3.92×10⁵）溶解于水（V_水：V _NaOH溶液=137:1）后，80℃加热半小时，加入正硅酸乙酯（TEOS，V_水：V _TEOS=120:1)和乙酸乙酯（V_水：V_乙酸乙酯=120:1），回流10min后，关闭加热和搅拌，老化2h，乙醇离心3次，旋干除去溶剂收集产物；

其中，步骤（2）中所述酸性条件下回流具体操作是将步骤（1）所制样品分散于甲醇（m_硅球：m_甲醇=1:1000）中，加入浓盐酸（V_浓盐酸:V_甲醇=1:2），回流24h后，乙醇离心样品3次，旋干除去溶剂收集产物。

其中，在步骤（3）中，硅烷偶联剂GMAS（（3-环氧乙基甲氧基丙基））三甲氧基硅烷通过硅烷的水解作用，在多孔硅纳米颗粒外层生成一层超薄硅层，其所含活性基团环氧乙基与转铁蛋白中的氨基发生键合反应，从而在多孔硅球外层修饰上了一层蛋白层。

其中，步骤（3）中所述的硅烷剂键合的具体操作步骤是将步骤（2）产物分散于甲苯（m_硅球：m_甲醇=1:1000）中，加入硅烷剂GMAS（（3-环氧乙基甲氧基丙基）三甲氧基硅烷，m_硅球：m_GMAS=5.5:1），氮气保护下，避光60℃反应5h后，乙醇离心样品3次，旋干除去溶剂收集产物。

其中，步骤（4）中所述的硅球表面键合蛋白是将转铁蛋白(m_硅球：m_转铁蛋白=8：1)加入步骤（3）中的水溶液中，室温避光搅拌1h后既得到产品，低温冻存。

其中，步骤（5）中所述的重活化剂为HI-6，但本发明不局限于上述药物，凡是具有对梭曼中毒酶有重活化效果的水溶性强的药物以及水溶性化疗药物等都可适用。

其中，步骤（5）中所述的载药的具体操作是将步骤（4）产物分散于水中(m_硅球：m_水=5.5：1)，加入HI-6（m_硅球：m_HI-6=1.36：1）后，避光室温搅拌1h。在本申请中，m：m表示重量比，V：V表示体积比。

其中，本发明中在制备方案、纳米载体、外层修饰蛋白等条件均相同的情况下，利用该纳米靶向中枢给药系统装载了分子结构、治疗效果均相近的同一类型药物双季胺单肟类重活化剂。对装载重活化剂的纳米药物完成了药物的制备，并进行了相关的物理形貌等表征，证明所制备纳米药物满足使用要求；同时进一步对装载了进一步优选的双季胺单肟类重活化剂HI-6以及其它重活化剂的纳米药物进行了药效评价，从结果中可得知，装载HI-6的纳米药物能获得最高的中枢重活化率。

附图说明

图1是本发明的纳米药物的结构示意图。

图2是本发明的纳米药物的制备流程图。

图3是实施例1纳米药物扫描电镜图。

图4是实施例1已载药的纳米药物的透射电镜图。

图5是实施例1未载药未修饰的多孔纳米硅球的透射电镜图。

图6是实施例4中各样品的吸收光谱图，其中，细虚线为修饰转铁蛋白后样品吸收光谱，宽虚线为未修饰转铁蛋白的吸收光谱，实线为装载了HI-6药物后样品的吸收光谱。

图7是实施例3中所制备纳米药物对梭曼染毒小鼠全血AChE的重活化率，从左到右依次为：装载有HI-6的多孔硅球，但多孔硅球尚未经转铁蛋白修饰全血AChE重活化率（图中用MSN-HI-6表示）；装载有HI-6的多孔硅球，且多孔硅球已经转铁蛋白修饰全血AChE重活化率（图中用Tf-MSN-HI6表示）；以及HI-6水溶液的全血AChE重活化率（图中用HI-6表示）。

图8是实施例3中制备纳米药物对梭曼染毒小鼠脑AChE的重活化率，从左到右依次为：装载有HI-6的多孔硅球，但多孔硅球未经转铁蛋白修饰样品的脑AChE重活化率（图中用MSN-HI-6表示）；装载有HI-6的多孔硅球，且多孔硅球已经过转铁蛋白修饰样品的脑AChE重活化率（图中用Tf-MSN-HI6表示）；以及HI-6水溶液的脑AChE重活化率（图中用HI-6表示）。

图9是实施例5中未靶向修饰的多孔硅球（图中用MSN表示）和靶向修饰了蛋白层后的多孔硅球载药的纳米颗粒（图中用MSN，MSN-TF表示）的动态光散射的测试结果。经测试，多孔硅球的动态光散射直径为160nm，经蛋白层修饰载药的纳米多孔硅球直径为200nm，经推算得出蛋白层的厚度为20nm。

图10是实施例6中装载氯解磷定的纳米多孔硅球的透射电镜照片。

图11是实施例7中装载了双复磷的纳米多孔硅球的透射电镜照片。

图12是实施例8中对实施例6、7所制药物对梭曼染毒小鼠全血AChE的重活化率测试，从左到右依次为氯解磷定水溶液、装载氯解磷定纳米药物、双复磷、装载双复磷纳米药物对梭曼染毒小鼠全血AChE重活化率。

图13是实施例8中对实施例6、7所制药物对梭曼染毒小鼠脑AChE的重活化率测试，从左到右依次为氯解磷定水溶液、装载氯解磷定纳米药物、双复磷、装载双复磷纳米药物对梭曼染毒小鼠脑AChE重活化率。

图14是实施例9中装载了HI-6的人血清白蛋白纳米粒透射电镜照片,(a),(b),(c)放大倍数依次为25000×,50000×及150000×。

图15是实施例9中所制备药物对梭曼染毒小鼠全血AChE的重活化率，从左到右依次为装载有HI-6的人血清白蛋白纳米粒（图中用HSA-HI-6表示）的重活化率，HI-6水溶液（图中用HI-6表示）对梭曼染毒小鼠全血AChE的重活化率。

图16是实施例9中所制备药物对梭曼染毒小鼠脑AChE的重活化率，从左到右依次为装载有HI-6的人血清白蛋白纳米粒（图中用HSA-HI-6表示）的重活化率，HI-6水溶液（图中用HI-6表示）对梭曼染毒小鼠全血AChE的重活化率。

图17是所装载重活化剂的结构式，A是氯解磷定、B是双复磷、C是HI-6。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但是本发明不仅仅局限于以下实施例。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：装载HI-6的纳米多孔硅球重活化剂的制备

本实施例所使用的目标药物为HI-6（1-[[(4-carbamoyl-pyridinio)methoxy]methyl]-2-(hydroxyimino-methyl)dichloride monohydrate）由军事医学科学院毒物药物研究所药物化学研究室合成，纯度95%以上，选用的硅烷剂为正硅酸四乙酯（TEOS），选用的硅烷偶联剂为GMAS（（3-环氧乙基甲氧基丙基）三甲氧基硅烷），选用的外层辅助修饰材料为转铁蛋白，以纳米多孔硅球作为药物载体，具体结构如图1所示，制备流程如图2所示。

⑴纳米多孔硅球的制备：将875μlNaOH（2mmol/L）和CTAB（十二烷基溴化铵，0.25g）溶解于120ml水，80℃加热半小时后，加入TEOS(正硅酸乙酯正硅酸乙酯，1ml)和乙酸乙酯（1ml），回流10min后，关闭加热和搅拌，老化2h（不加热静置即为老化），将产物离心(12000转/min，5min)后，除去上层清液保留沉淀，加入乙醇将沉淀分散后按相同条件离心2次，旋干除去乙醇收集产物。将收集的样品分散于100ml甲醇中，加入浓盐酸50ml，回流24h后，乙醇离心样品3次，旋干除去溶剂收集产物，即得尺寸在100nm左右的多孔纳米硅球。

经扫描电镜（图3）及透射电镜（图5）检测，硅球直径在100nm左右，内部孔洞为2-4nm。该纳米硅球可按文献（Daniel P.Ferris,Jie Lu等Synthesis of Biomolecule-Modified Mesoporous Silica Nanoparticles forTargeted Hydrophobic Drug Delivery to Cancer Cells,Small2011,7,13,1816）提供的合成方法制备。

⑵多孔纳米硅球的外层修饰：将前述步骤(1)中制备得到的纳米多孔硅球80mg置于10ml甲苯中，超声分散后，加入硅烷偶联剂GMAS（（3-环氧乙基甲氧基丙基）三甲氧基硅烷）200uL，氮气保护下，避光60℃反应5h后，将产物离心(12000转/min，5min)后，除去上层清液保留沉淀，加入乙醇将沉淀分散后按相同条件离心2次后，旋干除去溶剂收集产物（此产物为连接上GMAS的纳米多孔硅球）。室温条件下将上述连接上GMAS的纳米多孔硅球分散于8ml水溶液中（乳白色悬浊液），随后加入2ml转铁蛋白溶液（转铁蛋白，淡红色液体，浓度100%），室温避光搅拌（650转/min）1h后既得到产品（土黄色悬浊液），低温-20℃冻存。从动态光散射数据分析可得知（图9），经硅烷偶联剂的链接作用，在多孔硅球外层修饰上了20nm厚的蛋白层。

⑶修饰转铁蛋白的纳米多孔硅球载药：将步骤（2）得到的产物分散于16ml水中，加入57.2mg HI-6后，避光室温搅拌1h，随后低温-20℃冻存，使用时使之解冻即可。从已完成载药的纳米药物颗粒的透射电镜照片（图4）可以看出，完成载药后，纳米多孔硅球的内部孔洞内被填满，硅球外层有一层高分子层包裹。

实施例2：装载HI-6的荧光纳米多孔硅球重活化剂的制备

本实施例所使用的目标药物为HI-6（1-[[(4-carbamoyl-pyridinio)methoxy]methyl]-2-(hydroxyimino-methyl)dichloride monohydrate）由军事医学科学院毒物药物研究所药物化学研究室合成，纯度95%以上），选用硅烷剂为正硅酸四乙酯（TEOS），选用硅烷偶联剂为GMAS（（3-环氧乙基甲氧基丙基）三甲氧基硅烷）和APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，参杂荧光材料选用已得到FDA认可的安全无毒材料FITC（异硫氰酸荧光素），选用的外层辅助修饰材料为转铁蛋白，以纳米多孔硅球作为药物载体。掺杂荧光的硅球作为纳米药物的载体，利用其荧光，可以表征药物是否完成了外层蛋白的修饰和药物的装载，以及更进一步利用该荧光来检测药物是否进入脑部完成药物输运和在脑部的残留情况。

⑴荧光掺杂的硅烷偶联剂的制备：将3mgFITC溶解在3ml乙醇中，与12ul APTES在氮气保护下避光室温反应5h。

⑵掺杂荧光的纳米多孔硅球的制备：将875μlNaOH（2mmol/L）和CTAB（十二烷基溴化铵，0.25g）溶解于120ml水80度加热半小时后，加入TEOS(正硅酸乙酯正硅酸乙酯，1ml)和掺杂FITC的APTES乙醇溶液，随后加入乙酸乙酯（1ml），回流10min后，关闭加热和搅拌，老化2h，将产物离心(12000转/min，5min)后，除去上层清液保留沉淀，加入乙醇将沉淀分散后按相同条件离心2次后，旋干除去溶剂收集产物。将前述已制产物分散于100ml甲醇中，加入浓盐酸50ml，回流24h后，乙醇离心样品3次，旋干除去溶剂收集产物，既得到尺寸在100nm左右的多孔纳米硅球。

⑶多孔纳米硅球的外层修饰：将前述步骤(1)中制备的纳米多孔硅球80mg置于10ml甲苯中，超声分散后，加入硅烷偶联剂GMAS（（3-环氧乙基甲氧基丙基）三甲氧基硅烷）200uL，氮气保护下，避光60度反应5h后，将产物离心(12000转/min，5min)后，除去上层清液保留沉淀，加入乙醇将沉淀分散后按相同条件离心2次后，旋干除去溶剂收集产物（此产物为连接上GMAS的纳米多孔硅球），室温条件下将连接上GMAS的纳米多孔硅球分散于8ml水溶液中（橘红色悬浊液），随后加入2ml转铁蛋白溶液（转铁蛋白，淡红色液体，浓度100%），室温避光搅拌（650转/min）1h后既得到产品（橙色悬浊液），低温-20℃冻存。

(4)修饰转铁蛋白的纳米多孔硅球载药：将步骤（3）得到的产物分散于16ml水中，加入57.2mg HI-6（1-[[(4-carbamoyl-pyridinio)methoxy]methyl]-2-(hydroxyimino-methyl)dichloride monohydrate）由军事医学科学院毒物药物研究所药物化学研究室合成，纯度95%以上）后，避光室温搅拌1h，随后低温-20度冻存，使用时使之解冻即可。

实施例3：装载HI-6纳米药物对梭曼中枢中毒酶重活化效果

3.1实验分组

昆明小鼠，♂，按体重随机分为5组，每组各10只动物，包括：正常组（不给药不染毒），染毒组（只染毒不给药），对照组（染毒，给药HI-6水溶液，2.2mg/ml），未修饰硅球载药组（染毒，给药外层未修饰蛋白的多孔硅球装载HI-6，HI-6浓度为2.2mg/ml），纳米药物组（染毒，给药为实施例1中外层修饰蛋白的多孔硅球装载HI-6，HI-6浓度为2.2mg/ml）。

3.2实验方法

①给药。尾静脉注射梭曼120ug/kg，随后立即注射相应剂量药物，每只小鼠按100ul/10g剂量给药；

②取血及脑。给药10min摘眼球取血，取全脑对其乙酰胆碱酯酶活性进行测定；

③酶活性测定。

a.将全血用蒸馏水稀释成（1:100v/v）待测，小鼠全脑称重，按1:10（g/ml）加入乙酰胆碱酯酶提取液，匀浆，离心（4℃，10000rpm，10min），取上清液，用PBS稀释成（1:50v/v）待测；

b.将稀释好的全血和脑上清分别吸取20ul加入酶标板，空白对照空加入30ulPBS,试验空加入30ul ATCh（3mM）,空白和试验均设复孔，最后各孔用PBS加至100ul；

c.37℃恒温箱反应30min；

d.各孔加入200ulDTNB(0.03%)200ul；

e.在415nm波长下测定吸光值X(OD)；

f.根据所测得到的吸光值计算相应各组的复活率，计算公式：

q_复活率=（X_给药组-X_染毒组）/X_正常组

3.3实验结果

在血酶中(图7)，HI-6水溶液、未修饰纳米硅球装载重活化剂和纳米药物均使乙酰胆碱酯酶复活率达到了25%以上，证明纳米药物能有效的释放其所装载的HI-6，能达到相同剂量的自由药物的治疗效果；而在脑酶中（图8），因为HI-6不能穿透血脑屏障，致使其中枢乙酰胆碱酯酶仅能达到5%，而纳米药物由于外层转铁蛋白的作用，能有效的携带药物进入中枢，所以能有效的实现了中枢中毒酶的重活化，重活化率达到了22%，为目前所有报道中的最高值。根据已知文献，小鼠脑部乙酰胆碱酯酶重活化率达到10%后，即可有效的对抗毒剂，而该结果为首例报道的梭曼中枢中毒酶超过10%的工作，实现了梭曼中毒救治工作质的飞跃。

同时，我们纳米硅球的给药剂量为0.6mg/只，远低于文献报道的2mg/只，安全性高，未引起小鼠的不良反应。

实施例4：各型药物组吸收光谱的测定

对各组药物（未修饰蛋白的含FITC的纳米多孔硅球，修饰蛋白的含FITC的纳米多孔硅球，装载了HI-6的修饰蛋白含FITC的纳米多孔硅球），均按照HI-62.2mg/ml，硅球浓度3.33mg/ml的浓度进行配置后，均稀释1/10后，各取2ml进行吸收光谱测定，扫描范围为200nm至800nm（图6）。

结果如图6所示，未修饰蛋白的含FITC的纳米多孔硅球因为荧光材料FITC的参杂在500nm处有较强吸收峰；在修饰上了蛋白层后，由于外层的包裹，使得该处吸收峰消失；在装载了药物HI-6后，在300nm处，出现了HI-6的吸收峰。因此可推断，当FITC的吸收峰急剧降低时，即完成了外层蛋白层的包裹，当在300nm波段出现HI6的特征吸收峰释，即完成了药物的装载。我们可以通过几个特征峰的出现来判断样品制备处于哪一个阶段，并且该表征手段方便、快捷。

实施例5：各型药物的动态光散射直径测试

将纳米多孔硅球（MSN）和修饰完蛋白载药的纳米多孔硅球（TF-MSN）分别稀释至0.1mg/ml后，取10uL注入吸收池中，反复测量5次后，取平均值既得到各纳米颗粒的动态光散射直径。从数据可知（图9），MSN的动态光散射直径为160nm，修饰完蛋白层的TF-MSN直径为200nm，大致推算出蛋白层厚度为20nm。

实施例6：装载氯解磷定的纳米多孔硅球重活化剂的制备

除步骤3中装载药物为氯解磷定外，其余操作制备步骤与实施例1相同。图10为其透射电镜照片。

实施例7：装载双复磷的纳米多孔硅球重活化剂的制备

除步骤3中装载药物为双复磷外，其余操作制备步骤与实施例1相同。图11为其透射电镜照片。

实施例8：装载氯解磷定和双复磷重活化剂的纳米药物对梭曼中枢中毒酶重活化效果

除纳米药物组分别为装载氯解磷定和双复磷的修饰了装铁蛋白的纳米多孔硅球，对照组为其装载药物相应的水溶液，其余操作制备步骤与实施例3相同，药效评价结果如图12所示，在血酶中氯解磷定和双复磷的水溶液和相应的纳米药物均使乙酰胆碱酯酶复活率达到了10%以上，证明我们的纳米药物能有效的释放其所装载的重活化剂，能达到相同剂量的自由药物的治疗效果；而在脑酶中（图13），因为装载不能穿透血脑屏障，致使其中枢乙酰胆碱酯酶仅能达到3%，而纳米药物由于人血清白蛋白纳米颗粒的转运作用，能部分携带药物进入中枢实现中枢中毒酶的重活化，重活化率达到了10%，但其值远低于本发明装载HI-6的修饰转铁蛋白的纳米多孔硅球的20%的重活化率。

通过比较实施例3和9的结果可知，外层修饰蛋白、载药模式等相同的情况下，装载了HI-6的纳米药物的治疗效果，远高于装载其它重活化剂的纳米药物。

实施例9：人血清白蛋白纳米颗粒的制备

将20mg人血清白蛋白溶解于1ml NaCl溶液（10mM）中，用NaOH溶液（0.1N）将溶液pH调至8.3，再用0.22μm水系滤头过滤溶液；在1000rpm转速搅拌下，将续滤液缓慢匀速（1ml/min）滴入5ml96%乙醇中；搅拌3min后调大搅拌速度至1500rpm，将8%戊二醛22μl注入溶液中继续搅拌反应1min，向溶液中再加入22μl戊二醛溶液，室温避光反应24h。反应停止后，收集HSA NPs混悬液，4℃、14000rpm下离心12min；再用蒸馏水离心洗涤样品2次，除去残留的戊二醛、乙醇等物质。离心后得到的纳米粒超声分散于2ml去离子水中，4℃避光保存，用于下一步实验。图14为已制备得到的HSA纳米颗粒。

实施例10：装载HI-6的人血清白蛋白纳米颗粒对梭曼中枢中毒酶重活化效果的药效学评价

除纳米药物组为装载了HI-6的人血清白蛋白纳米颗粒，其余操作制备步骤与实施例3相同，药效评价结果如图15所示，在血酶中HI-6水溶液、纳米药物均使乙酰胆碱酯酶复活率达到了20%以上，证明我们的纳米药物能有效的释放其所装载的HI6，能达到相同剂量的自由药物的治疗效果；而在脑酶中（图16），因为HI-6不能穿透血脑屏障，致使其中枢乙酰胆碱酯酶仅能达到4%，而纳米药物由于人血清白蛋白纳米颗粒的转运作用，能部分携带药物进入中枢实现中枢中毒酶的重活化，重活化率达到了8%，但其值远低于本发明修饰转铁蛋白的纳米药物的20%的重活化率。

通过比较实施例3和10的结果可知，因为外层修饰蛋白、载药模式等不同，本发明（实施例3所测试药物）对中枢梭曼中毒酶的重活化率远远高于目前已有报道纳米药物人体血清白蛋白纳米颗粒（实施例10），从而证明了本发明的先进性。

本发明的优点和有益效果

本发明与现有技术相比，有以下区别：1.纳米药物的载体材料选择不同。该报道中采用人体血清白蛋白纳米颗粒作为载体，而本发明以无机纳米多孔硅球作为载体；2.外层靶向修饰不同。该报道中纳米药物未采进行外层靶向修饰，而本发明中采用转铁蛋白作为外层靶向修饰；3.载药方式不同。该报道中采用外层吸附挂载药物分子，而本发明中采用内部多孔吸附药物分子；4.评价手段不同。对梭曼中毒动物中枢中毒酶重活化是评价药物是否穿透中枢并迅速起效“金标准”，该报道中未进行药物对中枢酶重活化率评价，本发明进行了相应的药效评价。

另外更加详述本发明的技术效果如下：

⑴修饰转铁蛋白的载体能有效的携带药物进入中枢。人员沾染神经性毒剂后，亲脂性的神经性毒剂能迅速穿越血脑屏障进入脑部损害中枢神经系统。而相应的救治药物重活化剂却由于药物亲水性及所含基团的限制不能进入中枢重活化中毒酶，在采用分子改构和普通纳米药物递运未能有效提升重活化率的情况下，本发明率先采用了纳米硅球系统装载药物进中枢，能将原本因亲水性等原因不能进入中枢系统的重活化剂输运至脑部，从而实现有效的中毒救治。

⑵硅球载体能装载大量的重活化剂，且释药迅速。基于药物使用特殊性，纳米药物需能携带大量药物进入中枢后迅速释药重活化中毒酶。现有的纳米中枢给药系统主要应用于抗癌药物领域，载药量高但释药缓慢而不适用于该体系，而纳米多孔硅球载药系统却能有效的满足中枢中毒酶救治的使用要求。硅球内部的孔洞结构能有效的装载目标药物分子,且多孔结构与外界环境相同使得药物释放拥有足够的释放通道，无需外层修饰高分子层、蛋白质层的舒展或代谢，因而能获得较快的药物释放速度。大量文献已证实，硅材料生物安全性高，已大量应用在了药物载体领域。纳米多孔硅球以上诸多特点尤其适用于作为中枢神经中毒救治药物纳米药物的载药平台。

⑶该纳米药物能有效重活化梭曼中枢中毒酶。依据对梭曼染毒小鼠中枢中毒酶评价结果，本发明药物对梭曼中枢中毒酶具良好重活化作用，重活化率超过20%，远超过目前已有的所有类型的重活化剂，达到了目前已报道的最高药效。根据已知文献，小鼠脑部乙酰胆碱酯酶重活化率达到10%后，即可有效的对抗毒剂，而该结果为首例报道的梭曼中枢中毒酶超过10%的工作，实现了梭曼中毒救治工作质的飞跃。

Claims (10)

1.一种纳米药物，其特征在于：所述纳米药物以内部多孔的纳米多孔硅球作为载体，在载体孔内吸附或装载目标药物，在载体的最外层修饰有蛋白层。

2.权利要求1的纳米药物，所述的目标药物选自水溶性高而不能穿透血脑屏障的药物。

3.权利要求1的纳米药物，其中的目标药物选自对外周梭曼中毒酶有重活化效果的重活化剂，优选为双季胺单肟类重活化剂。

4.权利要求1的纳米药物，其中的目标药物选自酰胺磷定（HI-6）、氯解磷定及双复磷中的至少一种，优选为HI-6。

5.权利要求1的纳米药物，所述的蛋白层采用的蛋白是内源性蛋白，优选转铁蛋白。

6.权利要求1的纳米药物，所述的蛋白层是通过化学反应键合上的一层蛋白层。

7.权利要求1的纳米药物，所述的纳米多孔硅球直径在100nm左右，内部孔洞为2-4nm。

8.权利要求1-7中任一项所述的纳米药物在制备用于中枢解毒药物或者脑部急性疾病治疗药物中的用途。

9.权利要求1-7中任一项所述的纳米药物的制备方法，其包括步骤：

（1）利用stober法制备纳米硅球；

（2）酸性环境下回流得到多孔结构的纳米硅球；

（3）在氮气保护下，在硅球表面键合上硅烷偶联剂；

（4）在硅球表面键合上蛋白；

（5）完成载药。

10.权利要求9的方法，其特征在于所述步骤（1）具体如下：

将氢氧化钠和十二烷基溴化铵按照摩尔比（1:3.92）溶解于水后，与正硅酸乙酯和乙酸乙酯回流一定时间，优选将875μL NaOH（2mmol/L）和CTAB（十二烷基溴化铵，0.25g）溶解于120ml水80℃加热半小时后，加入TEOS(正硅酸乙酯正硅酸乙酯，1ml)和乙酸乙酯（1ml），回流10min后，关闭加热和搅拌，老化2h，乙醇离心3次，旋干除去溶剂收集产物；

步骤（2）中所述酸性条件下回流具体操作是将步骤（1）所制样品分散于100ml甲醇中，加入浓盐酸50ml，回流24h后，乙醇离心样品三次，旋干除去溶剂收集产物；

步骤（3）中所述的硅烷剂键合的具体操作步骤是将步骤（2）产物80mg分散于10ml甲苯中，加入硅烷偶联剂GMAS（（3-环氧乙基甲氧基丙基）三甲氧基硅烷），氮气保护下，避光60℃反应5h后，乙醇离心样品3次，旋干除去溶剂收集产物；

步骤（4）中所述的硅球表面键合蛋白是将1ml转铁蛋白溶液加入步骤（3）中的水溶液中，室温避光搅拌1h后即得到产品，低温冻存；

步骤（5）中所述的载药的具体操作是将步骤（4）产物分散于8ml水中，加入一定量的目标药物后，避光室温搅拌1h。